يقدم هنا بروتوكول لعزل وتضخيم البكتيريا اللاهوائية الهوائية والكلية الملتحمة الماوس الملتحمة باستخدام مسحة عين فريدة من نوعها وخطوة إثراء قائمة على الثقافة مع تحديد لاحق من خلال الأساليب القائمة على الميكروبيولوجية وقياس الطيف الكتلي MALDI-TOF.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان سطح العين يعتبر ذات مرة محصنا متميزا وغير أحيائيا ، ولكن يبدو مؤخرا أن هناك وجودا صغيرا ، ولكن مستمرا. وقد كان تحديد ورصد الأنواع البكتيرية في الغشاء المخاطي العيني تحديا بسبب وفرة منخفضة وتوافر محدود من المنهجية المناسبة لنمو commensal وتحديد. هناك نهجان قياسيان: الثقافة القائمة أو أساليب تسلسل الحمض النووي. الطريقة الأولى هي إشكالية بسبب البكتيريا القابلة للاسترداد محدودة والنهج الثاني يحدد البكتيريا الحية والميتة على حد سواء مما يؤدي إلى تمثيل شاذ من الفضاء العين. طورنا طريقة قوية وحساسة للعزل البكتيري من خلال البناء على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي القياسية. هذه تقنية تعتمد على المسحة ، باستخدام مسحة رقيقة مصنوعة من "المختبر" تستهدف الملتحمة السفلية ، تليها خطوة تضخيم للأجناس اللاهوائية الهوائية والكلية. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لعزل وتحديد الأنواع الملتحمة مثل Corynebacterium spp., Coagulase المكورات العنقودية السلبية spp., العقدية spp. هذا النهج هو مناسبة لتحديد التنوع commensal في الفئران في ظل ظروف المرض المختلفة.
المقدمة
الهدف من هذا البروتوكول هو تعزيز عزلة محددة من الميكروبات الهوائية والكلية غير الهوائية القابلة للحياة والنادرة من الملتحمة العينية لتوصيف الميكروبيوم العيني. وقد عرضت دراسات مستفيضة المجتمعات المخاطية كومينسال على الجلد والأمعاء والجهاز التنفسي والأعضاء التناسلية وتبين أن هذه المجتمعات تؤثر على تطور الجهاز المناعي والاستجابة1و2و3. وقد ثبت أن المجتمعات commensal العين لتغيير خلال أمراض معينة، مثل مرض جفاف العين4، متلازمةشيغرن5 ومرض السكري6. ومع ذلك ، فإن القدرة على تحديد مجتمع كومينسال سطح العين النموذجي يعوقها وفرة منخفضة نسبيا مقارنة مع غيرها من المواقع المخاطية6،7،8. وهذا يثير جدلا حول ما إذا كان هناك ميكروبيوم العين المقيم وإذا كان موجودا، ما إذا كان يختلف عن ميكروبيوم الجلد وبالتالي، تأثيره المحلي على تطوير الجهاز المناعي الفطري والاستجابة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في حل هذه المسألة.
عموما، تستند النهج لتحديد مكانة commensal العين على التسلسل والتقنيات القائمة على الثقافة4،7،9. 16 S rDNA التسلسل وتحليل BRISK7 تظهر تنوعا أوسع من التقنيات القائمة على الثقافة، ولكن غير قادرين على التفريق بين الميكروبات الحية والميتة. نظرا لأن سطح العين معاد للعديد من الميكروبات بسبب خصائص الفيلم المسيل للدموع المضادة للميكروبات4 التي تولد مجموعة كبيرة من شظايا الحمض النووي ، فإن النهج القائمة على الحمض النووي ستكتشف هذه القطع الأثرية التي قد تحرف البيانات نحو تحديد البكتيريا الميتة ككومينسالات مقيمة بدلا من الملوثات. وهذا يؤدي إلى تحديد commensal شاذة وتوصيف الفضاء العين بأنها أعلى في وفرة الميكروبات والتنوع10. وهذا يجعل من الصعب تحديد الميكروبيوم العيني المقيم عن طريق الأساليب القائمة على الحمض النووي. حيث أن التقنيات المستندة إلى الثقافة القياسية غير قادر على الكشف عن commensals لأن التحميل منخفض جدا11. أسلوبنا يحسن على الممارسات القياسية باستخدام مسحة رقيقة التي يمكن أن تستهدف الملتحمة، وبالتالي تجنب التلوث من الجلد المجاور، فضلا عن مفهوم أن الكائنات الحية قابلة للحياة يمكن إثراء من قبل ثقافة قصيرة في وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات بهدف إحياء قابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكريس، فضلا عن إثراء للميكروبات نادرة قابلة للحياة.
النتائج، وفرة نسبية من commensals العين لكل مسحة العين، تميز الميكروبيوم المقيم الملتحمة ومهمة لأغراض المقارنة. تظهر بياناتنا أن هناك فرقا بين الجلد والميكروبات الملتحمة ، بالإضافة إلى تنوع أكبر مع زيادة العمر والفرق المحدد للجنس في الوفرة. وعلاوة على ذلك ، فقد وجد هذا النهج بشكل مستنسخ اختلافات كومينسال في الفئرانالمغلوبة 12. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لوصف الميكروبيوم العيني الذي قد يختلف بسبب ممارسات التكتكة أو الجغرافيا أو حالة المرض ، وكذلك الآثار المحلية لمييضات ومنتجات commensal على تطوير الجهاز المناعي والاستجابة له.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تتبع جميع الإجراءات التي تشمل الفئران المبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. اتبع إرشادات السلامة المختبرية (وفقا لتوجيهات إدارة الصحة والسلامة البيئية المؤسسية) عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة والمواد التي يحتمل أن تكون ملوثة. استخدام أوعية النفايات المناسبة وإجراءات إزالة التلوث قبل التخلص من المواد الملوثة المحتملة بالأخطار البيولوجية.
1. إعداد مسحة العين، إعداد حقل العمل، مسح عين الفأر وإثراء العينة
- إعداد مسحات العين العقيمة
ملاحظة: مسحات العين العقيمة هي مسواك خشبية مغلفة رقيقة مع طبقة رقيقة من الألياف من ضرب القطن ومكبرة في المنزل.- كمية مناسبة من الضرب القطن والمواساك لعدد الفئران التي سيتم مسحها.
- قرصة قبالة نصف سنتيمتر طويلة قطعة من القطن الضرب مع الإبهام والسبابة. ندف الضرب عن طريق سحب على حواف مع الإبهام وefingers لتشكيل طبقة واحدة مسطحة مسامية، ووقف فقط قبل الضرب ينهار (بت صغيرة من القطن المنتشرة في جميع أنحاء الضرب امتدت مقبولة).
- دوامة الضرب حول واحدة من النهايات الحادة للمسنك عن طريق عقد طفيفة قطعة امتدت التدريجي على طرف مسواك كما هو الملتوية، انظر الشكل 1. سيكون لمسحة العين "المكتملة" طبقة رقيقة جدا من القطن تمتد على الطرف ، وتمتد ما يقرب من نصف إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن الطرف.
- إدراج مسحات "مكتملة" في كوب صغير، مسحة الجانب إلى أسفل وتغطية. "أوتوكلاف"
- إعداد مساحة العمل
- إعداد التخدير التي تحتوي على 2 مل من الكيتامين (100 ملغم / مل), 400 ميكرولتر من xylazine (100 ملغ / مل) و 27.6 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl في DH2O) في أنبوب طرد مركزي معقم 50 مل معقم. تصفية تعقيم وaliquot التخدير للاستخدام الفوري (قد يتم تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر؛ تسمح دائما إلى equilibrate لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام).
- مسح وتنظيف منطقة العمل مع مطهر للحد من التلوث.
- Aliquot 0.5 مل من وسائل الإعلام حقن القلب الدماغ العقيمة (BHI) في المسمى 1.5 مل أنابيب الطرد الدقيق المعقمة (1 أنبوب لكل فأر والتحكم)؛ ترتيب في رف الطرد المركزي الدقيق. وضع الرف على الجليد.
- إعداد تدفق العمل على النحو التالي (من اليسار إلى اليمين): محطة تخدير الماوس (قفص يحتوي على فئران تجريبية، قفص معقم فارغ، تخدير درجة حرارة الغرفة، إبرة 25 G ومحقنة 1 مل)، محطة مسح العين (aliquoted BHI على الجليد، مسحات العين المعقمة، المناشف الورقية النظيفة، رذاذ الأيزوبروبانول 70٪) ومحطة الطلاء (لوحات أجار الدم درجة حرارة الغرفة، 10 ميكرولتر ماصة ، 10 ميكرولتر نصائح التخلص منها العقيمة، حاوية النفايات الخطرة بيولوجيا).
- مسح العين
- إدارة 10 ميكرولتر من التخدير لكل 1 غرام من جرعة وزن الماوس من الكيتامين وإكسيلازين على التوالي intraperitoneally إلى كل فأر الكبار ومكان في قفص autoclaved. اختبار تخدير عن طريق الضغط على لوحة الخلفية; لا توجد حركة تشير إلى تخدير مناسب.
- تعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران المخدرة فقط واليد الأخرى للتعامل فقط مع مسحة العين والثقافة. لمسح، وإزالة الماوس تخدير تماما من القفص. مكان على رأس سطح العمل النظيف المتمركزة على جانبها مع العين اليسرى المكشوفة. رش اليدين القفاز مع isopropanol، الجافة مع منشفة ورقية نظيفة.
- Uncap المسمى على وجه التحديد أنبوب الطرد المركزي BHI الصغيرة مع وسائل الإعلام مخصصة التعامل مع اليد. ضع الأنبوب مرة أخرى في رف الطرد المركزي الصغير على الجليد. تراجع طرف القطن المغلفة من مسحة العين في BHI، سحب مسحة العين من أنبوب يحوم تلميح 2 مرات ضد الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد.
- مع يد الماوس التعامل مع، عقد بلطف الماوس من قبل scruff من الرقبة. مع جهة أخرى، ضع طرف العين مسحة ضد منطقة الملتحمة المتوسطة للعين اليسرى، انظر الشكل 2A. الاكتئاب طفيفة مقلة العين وتحريك مسحة في نافذة غسل الحركة (الشكل 2B) ذهابا وإيابا، بين الجفن السفلي والعين، 10 مرات. الحفاظ على الضغط المستمر.
- دون لمس الفراء، وإزالة بلطف غيض من مسحة، عمودي إلى حيث تم إدراجها، ووضع الجانب القطن مسحة أسفل مباشرة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة المسماة التي تحتوي على وسائل الإعلام BHI. تطبيق قطرة العين التشحيم إلى العين مسحة.
- أعد الفأرة إلى القفص.
- دع المسحة تقف لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد وإزالة مسحة العين باليد القفازة المعقمة عن طريق خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات. سحب مسحة عن طريق طرف دوامة ضد الجدار الداخلي للأنبوب الطرد المركزي الجزئي لمدة 5 دورات. التخلص من مسحة في حاوية الخطر البيولوجي.
- كرر الخطوات من 1.3.2 إلى 1.3.7 لكل فأر وعينات التحكم (مسحة الجلد أو الفراء). تعقيم القفازات بشكل مناسب بين كل مسحة.
- تخصيب
- إثراء العينة عن طريق احتضان الأنبوب بشكل ثابت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية
- أثناء الحضانة، تسمية درجة حرارة غرفة واحدة Trypticase الصويا مع 5٪ لوحة أجار الدم الأغنام (صفيحة TSA) لكل فأر وتقسيمها إلى نصفين.
- بعد احتضان ثقافة مسحة العين، قم بإزالة العينات المخصبة من الحاضنة ووضعها على الجليد.
- لفترة وجيزة دوامة عينات لخلط ولوحة وفقا لتخطيطي في الشكل 3A. Aliquot 10 ميكرولتر من العينة على لوحة TSA وإمالة لوحة لتشكيل شريط، كرر 2 مرات.
- على الجانب الآخر من الخط الفاصل للوح، النقطة 10 ميكرولتر من العينة على أجار، كرر 9 مرات.
- احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، 2 أيام، و 4 أيام (في غرفة نظيفة تمنع لوحات أجار من التجفيف). عد المستعمرات في شرائط، لاحظ مورفولوجيا وحساب وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) لكل مسحة لعزل مماثلة مورفولوجيا. انظر إلى النقاط للكائنات الحية الفريدة التي لا يتم التقاطها في شرائط.
2. لوحة رئيسية، وتوصيف، وتحديد الميكروبات العين
-
لوحة رئيسية
- رسم الشبكات على الجزء الخلفي من لوحة TSA (الشكل 3B). اختيار مستعمرة مع مسواك معقمة من كل لوحة مسحة عين الماوس وشرائط مربع لوحة رئيسية (الشبكات)، تسمية الشبكة مع رقم المستعمرة ومعلومات الماوس. اختيار لوحة ثلاث مستعمرات مختلفة لكل مستعمرة متميزة شكليا.
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 °C. استمر في الحضانة لمدة 96 ساعة، والتحقق يوميا من ظهور عزلات جديدة.
ملاحظة: سوف تختلف السكان Commensal على أساس عمر الماوس والتغذية وحالة المرض وممارسات الكهن. ويستند عزل التوصيف على البكتيريا الهوائية والكلية اللاهوائية السائدة الموجودة في مختبرنا.
-
توصيف
- تكرار13 لوحة الميكروبات على مانيتول الملح أجار (MSA) وماكونكي (MAC) لوحات, احتضان بين عشية وضحاها في 37 °C. لاحظ النمو لكل عزل ووجود مستعمرات شمعية أو مستعمرات صفراء مع هالة على MSA.
- لغرام cocci إيجابية، واختبار مع اختبار كاتالاز13،14. ضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ على شريحة زجاجية نظيفة. باستخدام مسواك معقمة ، اختر الميكروب المقابل من لوحة مسحة العين. لا يشير تشكيل فقاعة العقدية spp.، تشكيل فقاعة طفيفة يشير Corynebacterium spp. وربما Aerococcus spp. وتشكيل فقاعة سريعة يشير إلى المكورات العنقودية spp.
-
التعريف: تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد من مالدي-توف
ملاحظة: يتم إجراء التعرف البكتيري باستخدام MALDI-TOF وقاعدة بيانات البرامج. يستخدم هذا النظام الليزر بمساعدة مصفوفة تأين وقت قياس الطيف الكتلي للرحلة (MALDI-TOF MS) لتطوير ملامح الأطياف التي تتم مقارنتها بالأطياف البكتيرية المعروفة لتحديد الهوية. E.coli, ATCC 8739, يستخدم لمعايرة النظام.- يعزل بكتيرية الصفائح على لوحات TSA التي تحتوي على 5٪ من دم الأغنام وتحتضن بين عشية وضحاها مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام حلقة 1 ميكرولتر، وتطبيق طبقة رقيقة من البكتيريا النقية على الشريحة الهدف MALDI-TOF؛ 1 ميكرولتر من MALDI-TOF MS CHCA مصفوفة الحل (ألفا-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك حمض) هو مضاف ويسمح للهواء الجاف تماما قبل تحميل الشريحة في صك MALDI-TOF.
- يتم رصد كل عزل في تكرار.
- يتم قبول التقارير التي تحتوي على درجات احتمالية أكبر من 80٪، والتي تشير إلى قيمة تمييز عالية، كنتائج موثوقة وتم قبول الهوية البكتيرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تظهر النتائج التمثيلية للوحة مسحة العين التي تظهر أساليب مختلفة للطلاء في الشكل 3A تظهر عزلات متنوعة شكليا من الماوس C57BL/6. لكل عزلة متميزة، تم عد المستعمرات في القطاع والوفرة النسبية، وحدات تشكيل مستعمرة فريدة من نوعها (CFUs) لكل مسحة عين، محسوبة ورسمت لأغراض المقارنة. لتوصيف الميكروبيولوجية، تم اختيار البكتيريا من لوحات مسحة عين الماوس الفردية لإنتاج لوحة TSA الرئيسية (التي تم إنشاؤها عن طريق اختيار عزل متميزة شكليا في ثلاثة نسخ من كل لوحة مسحة عين الماوس). من اللوحة الرئيسية، في اليوم ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بسبب الحالة البكتيرية للسطح العيني ، واجهت العديد من المختبرات صعوبة في عزل commensals العين7،20، مما أدى إلى انخفاض عدد العينات مع النمو وانخفاض وفرة وانخفاض التنوع8. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير على الممارسات التقليدية الثقافة4،21 بإضافة خطوة التخصيب ، فضلا عن مسحة العين المعاد تصميمها وتحديدها من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF. تعالج خطوة التخصيب إمكانية الاسترداد المنخفض...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا تضارب في المصالح للكشف.
شكر وتقدير
دعم التمويل من P30 DK034854 VY وLB والدراسات في مركز ماساتشوستس المضيف الميكروبيوم والتمويل من NIH / NEI R01 EY022054 دعم MG.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.1 إلى 10 & ميكرو; ل طرف ماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1110-300 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| 0.5 إلى 10 & micro ؛ ل ماصة Eppendorf | فيشر Scientific | 13-690-026 | |
| 1 مل حقنة | فيشر Scientific | BD309623 | 1 حقنة لكل مجموعة مسحة العين |
| 1.5 مل أنابيب Eppendorf | الولايات المتحدة الأمريكية Scientific | 1615-5500 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| 1000 & micro مل طرف ماصة | الولايات المتحدة الأمريكية Scientific | 1111-2021 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| 200 إلى 1000 & micro ؛ ل جيلسون ماصة (P1000) | فيشر ساينتفيك | F123602G | |
| 25 جم إبرة | فيشر Scientific | 14-826AA | 1 إبرة لكل مجموعة مسحة العين |
| 3٪ بيروكسيد الهيدروجين | فيشر Scientific | S25359 | |
| 37 درجة ؛ معدات | مختبر | ||
| C 70٪ Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg / ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain Kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab Equipment | ||
| Papers | Lab Lab معدات | ||
| القطن الضرب / القطن المدلفن المعقم | CVS | ||
| يمكن التخلص منه 1 مل Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | لاختبارات الجرام وصمة عار والكاتالاز |
| E.coli< / em> | ATTC | ATCC 8739 | |
| شرائح زجاجية | فيشر Scientific | 12-550-A3 | لاختبارات الجرام وصمة عار والكاتالاز |
| الكيتامين ( 100 مجم / مل) | هنري شاين | 9950001 | |
| كونكي أجار لوحات | فيشر 4321270 العلمية | مخزن في 4 درجات ؛ C حتى تصبح جاهزة للاستخدام | |
| Mannitol Salt Agar | Carolina | Biological Supply قم بإعداد الأطباق وفقا لتعليمات MFR ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات ؛ C لمدة أسبوع | |
| من الفئران | Jackson Labs | C57 / BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | لألواح أجار الملح مانيتول |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | تستعد وفقا للتوجيهات والأوتوكلاف |
| SteriFlip (0.22 & micro ؛ م حجم المسام كبريت البوليستر) | EMD / Millipore ، فيشر Scientifc | SCGP00525 | لتعقيم التخدير |
| أنبوب الطرد المركزي المعقم Corning | تحضير التخدير | 430829 | |
| قفص الفأر | معدات | ||
| أعواد الأسنان (الخيزران المستدير) | الأوتوكلاف الأساسي | للمطبخ | |
| المسحةTrypticase Soy Agar II مع 5٪ من لوحات دم الأغنام | متجر Fisher Scientific | 4321261 | في 4 درجات ؛ C حتى تصبح جاهزة لاستخدام |
| شريحة الهدف Vitek | BioMerieux Inc. Durham ، NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham ، NC | ||
| Vitek-MS CHCA مصفوفة حل | BioMerieux Inc. دورهام ، نورث كارولاينا | 411071 | |
| قطرات العين ذات الاستخدام الواحد | CVS Pharmacy | Bausch و Lomb Soothe Lubricant Eye Drops ، 28 قارورة ، 0.02 أونصة سائلة. |
المراجع
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547(2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117(2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880(2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56(2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831(2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855(2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11(2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
