$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لقانون رعاية ودليل رعاية واستخدام المختبر (NRC 2011) ، على النحو المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة ولاية أوهايو (IACUC).
1. الخطوة 1 إعداد والبروتوكول الجراحي تم استخدام نموذج لسكتة دماغية انسداد الشريان القاعدي (BAO) كما هو موضحسابقا 9،10.
- بيجل البالغ السريع (8-13 كجم ، 14-21 شهرا) بين عشية وضحاها مع حرية الوصول إلى الماء.
- حقن ، قبل التخدير ، إعطاء الأسيبرومازين العضلي (0.2 مجم / كغ)
- أدخل قسطرة قياس 20 في الوريد الرأسي.
- تحفيز التخدير مع إعطاء الكيتامين عن طريق الوريد (10 مجم / كغ) وميدازولام (0.025 مجم / كغ).
- بعد تحريض التخدير ، قم بتنبيب والتهوية ميكانيكيا باستخدام التخدير المستنشق المستمر (2-3٪ إيزوفلوران).
- قم بإنشاء نافذة حج القحف مقاس 1 سم2 لتصوير البقع بالليزر.
- أدخل غمدا شريانيا 7F في الشريان الفخذي الأيمن للوصول إليه وقياس ضغط الدم.
- أدخل قسطرة وعائية قياس 16 في الوريد الفخذي الأيمن لسحب الدم.
- تحضير الجلطات الدموية (جلطة دموية) كما هو موضحسابقا 16. باختصار ، ارسم واخلط 5 مل من دم الكامل مع 0.5 غرام من كبريتات الباريوم (Ba2SO4) في أنبوب بلاستيكي لجمع الدم في الدم أثناء التدحرج لمدة 30 ثانية. ضع الخليط دون إزعاج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إعطاء القسطرة.
- ابدأ في تسجيل تصوير الأوعية الدموية بالطرح الرقمي الأساسي (DSA) قبل الوصول إلى الشريان القاعدي الأوسط. تقدم قسطرة توجيه 4F تحت التوجيه بالمنظار الفلوري ، باستخدام نهج عبر الأبهر الرجعي ، إلى غمد الشريان 7F الذي تم وضعه مسبقا في الشريان الفخذي الأيمن من خلال الشريان الفقري إلى قاعدة الشريان القاعدي. حقن ملليلترين من عامل التباين مع محلول ملحي عادي لتحديد الشريان القاعدي.
- باستخدام مشرط جراحي ، قم بإزالة الجلطة إلى قطع صغيرة مع طبقات غنية بالفيبرين وغنية بكريات الدمالحمراء 16 لتحميلها في حقنة 3 مل وحقنها من خلال القسطرة الدقيقة في منتصف الشريان القاعدي. اترك الجلطة تستقر لمدة 10 دقائق. قم بإجراء تصوير الأوعية الدموية للتحقق من موقع الجلطة المطلوب. يمكن التحقق من انسداد الشرايين عن طريق DSA وتقليل التروية الدماغية عن طريق التصوير بالبقع بالليزر (LSI).
2. الخطوة 2 تصوير البقع بالليزر
- ركز كاميرا تصوير نتروية البقع بالليزر (LSI) على نافذة الجمجمة. قم بتكوين نظام كاميرا التصوير عالي الدقة بالليزر (LSI) كما هو موضحسابقا 15.
- تسجيل التروية مع الانقطاعات أثناء أداء تصوير الأوعية الدموية في النقاط الزمنية المطلوبة. احصل على بيانات من مجال رؤية 1.5 سم × 1.5 سم باستخدام طول موجي 785 نانومتر وليزر 80 ميجاوات بمعدل أخذ عينات 60 هرتز على مسافة عمل 10 سم في نموذج هذا.
- من الرسوم البيانية للتروية في الوقت الفعلي ، اختر وقت الاهتمام (TOI) لتضمين القمم المنخفضة فقط لاستبعاد القطع الأثرية المتعلقة بحركة الجهاز التنفسي. متوسط وحدات التروية النسبية خلال فترة أخذ العينات 10 ثوان باستخدام برنامج PimSoft v1.4. قم بإجراء تحليل تباين البقع بالليزر (LASCA) كما هو موضحسابقا 15.
- لتحسين القياس الكمي للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في نموذج هذا ، سجل الصور بمعدل 15 إطارا في الثانية وقم بإجراء حسابات الشدة والتباين بمتوسط زماني مكاني على مساحة 5 × 5 بكسل مع 5 إطارات. كان معدل الإطارات الإجمالي لبيانات الشدة والتباين 3 إطارات في الثانية. اختر القيمة المتوسطة للتروية لكل بكسل لتقليل التأثيرات على متوسط التغيرات المفاجئة الكبيرة في قراءات التروية بسبب الحركة من تنفس. قم بتحويل البيانات الأولية إلى ملفات ثنائية ومعالجة البيانات إلى تصوير ذي مغزى للأوعية. استخدم خوارزمية LASCA المعاد تجهيزها من البرنامج (rt-LASCA) لاستخدام تباين بيانات التباين بمرور الوقت لتحديد مواقع الأوعية الدموية كما هو موضحسابقا 15.
3. الخطوة 3: التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي
- قم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في اليوم السابق للجراحة للمقارنة إذا رغبت في ذلك ، ثم كرر ذلك لتأكيد BAO ومرة أخرى قبل التضحية إذا كان سيتم تقييم العلاج.
- ضع الأنياب المخدرة باستمرار رأسا على عقب أولا في وضع ضعيف كما هو موضح سابقا في قوة مجال Siemens Prisma 3 Tesla وماسح التصوير بالرنين المغناطيسي بقطر 60 سم بما في ذلك ملف رأس 32 قناة كجهاز استقبال مع أداء تصوير متوازي محسن للحصول على صوردماغية 17.
- قم بإجراء عمليات مسح مترجم للحصول على صور تجريبية لكل دماغ قبل بدء التصوير التشريحي. يحتوي النظام المستخدم للحصول على البيانات المقدمة على نظام تصوير متكامل يسمح بمسح أسرع في الدقة المكانية والزمانية المثلى. تولد التدرجات 80 طن متري / م صورا عالية الجودة مرجحة ب T2 ومرجحة بالانتشار وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي. التصوير المرجح بالانتشار (DWI) حساس بدرجة كافية ويمكن أن يظهر بنية فرعية تشريحية أكثر من طرق التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلية التقليدية مثل الصور المرجحة T2. في هذه الدراسة ، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي بعد 4 ساعات من BAO.
- بعد التوطين المناسب ، قم بإجراء تصوير صدى التدرج المرجح T2 (المعلمات: مجال الرؤية = 130 مم ، حجم المصفوفة = 320 × 320 ، حجم البكسل = 0.3 × 0.3 مم ، سمك الشريحة = 3 مم ، TR = 4 ثوان ، FA = 180 درجة ، BW = 255 هرتز / بكسل ، NEX = 2 ، TE= 75 مللي ثانية ، الدقة = 2.4615 بكسل لكل مم) متبوعا بتصوير استعادة الانعكاس المخفف للتدفق (FLAIR) لتصور بنية تشريح الدماغ.
- إجراء تصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA) لتصور تشريح الأوعية الدموية وقياس الدورة الدموية. الحصول على MRA للدماغ الذي يغطي الرأس والرقبة بتسلسل وقت الرحلة ثلاثي الأبعاد (TOF) في عرض عرضي (المعلمات: مجال الرؤية = 129 × 129 مم ، حجم المصفوفة = 768 × 768 ، حجم البكسل = 0.3 × 0.3 مم ، سمك الشريحة = 81.59 مم ، TR = 25 مللي ثانية ، FA = 18 درجة ، أبيض وأسود = 185 هرتز / بكسل ، NEX = 1 ، TE= 4.22 مللي ثانية ، الدقة = 5.91 بكسل لكل مم). قم بإجراء الإسقاط الأقصى للكثافة (MIP) مع تصور ثلاثي الأبعاد مرمز بالألوان لزيادة شدة الإشارة في الأوعية الدموية. صور DICOM المكتسبة بعد العملية لتصور الأوعية الدموية وتأكيد انسداد الشريان القاعدي.
4. الخطوة 4 التصوير المرجح بالانتشار وحساب حجم السكتة الدماغية
- قم بإجراء تسلسل تصوير مرجح للانتشار للكشف عن السكتات الدماغية الإقفارية الحادة (المعلمات: مجال الرؤية = 149 مم × 149 مم ، حجم المصفوفة = 132 × 0 × 100 ، حجم البكسل = 0.30 مم × 0.30 مم ، سمك الشريحة = 4 مم ، TR = 4.6 ثانية ، FA = 90 درجة ، أبيض وأسود = 255 هرتز / بكسل ، NEX = 1 ، TE = 86 مللي ثانية ، الدقة = 0.93 بكسل لكل مم). نقل صور DICOM للمعالجة اللاحقة.
- قم بإنشاء خرائط انتشار ظاهرية (ADC) من صور DWI وحساب أحجام الاحتشاء باستخدام برنامج OsiriX MD v.5.0.
- تتبع كل من نصفي الكرة المخية ومناطق الاحتشاء لكل شريحة واضربها بسماكة الشريحة للحصول على أحجام الاحتشاء.
- قم بتحويل الحجم الكامل المطلق إلى 100 وحدة لحساب النسبة المئوية لحجم السكتة الدماغية لكل.
5. الخطوة 5: هيماتوكسيلين والإيوزين تلطيخ أنسجة الدماغ
- في وقت التضحية في المخدرة ، حصاد الدماغ وقطع قسمين وسطيين بسمك 4 مم بمشرط حاد ، سيتم استخدام قسم واحد لتلوين TTC أدناه.
- قم بإصلاح القسم 4 مم في 10٪ فورمالين لمدة 7 أيام على الأقل للسماح بالتسلل في جميع أنحاء القسم بأكمله.
- قم بتضمين قسم الدماغ الثابت في البارافين باتباع البروتوكول17 الخاص بنا.
- قم بقص وتسوية كل كتلة بارافين (يمكن تخزين كتل متعددة ومعالجتها في نفس الوقت).
- قسم كل كتلة بارافين عند 4 ميكرومتر وضع الأنسجة المقطوعة على شريحة 2 × 3 بوصة.
- قم بمعالجة كل شريحة في Hematoxylin 560 لمدة 8 دقائق ، وقم بتمييز الكحول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 1 ثانية ثلاث مرات مع الشطف في ماء الصنبور.
- أزرق كل شريحة مع 1٪ هيدروكسيد الأمونيوم لمدة 1 ثانية واشطفها لمدة 2 ثانية بماء الصنبور.
- يجفف في 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ثانية اثنتي عشرة مرة ، مع تلطيخ في اليوزين لمدة 1 دقيقة.
- يجفف في 95٪ لمدة 1 ثانية اثنتي عشرة مرة متبوعا ب 100٪ إيثانول.
- قم بمسح الزيلين وقم بتطبيق غطاء مقاس 2 × 3 بوصة مع وسائط التثبيت ، وإزالة فقاعات الهواء.
6. الخطوة 6 2٪ 2،3،5-ثلاثي فينيلترازوليوم كلوريد تلطيخ الدماغ
- ضع القسم الثاني مقاس 4 مم الذي تم حصاده بجانب قسم H & E في محلول معد مسبقا يحتوي على 100 مل 2٪ 2،3،5-ثلاثي فينيل-2H-tetrazolium كلوريد (TTC) في درجة الحموضة 7.4 PBS دافئة إلى 37 درجة مئوية في الظلام.
- احتضن في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل ، مع قلب قسم الدماغ برفق كل 5 دقائق.
- عندما يتحول القسم إلى اللون الأحمر الكرز على كلا الجانبين ، قم بإزالة محلول TTC واستبدله بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، لتحسين التباين بين عشية وضحاها.
- عندما يكون التباين مثاليا بين البقع البيضاء والحمراء في الدماغ (1-3 أيام) ، ضعه بين الأغطية البلاستيكية الشفافة ، وجفف السوائل الزائدة ، وامسح بدقة عالية.
- تتبع المناطق الإقفارية وانزلاق الدماغ بالكامل للحصول على النسبة المئوية للاحتشاء في كل قسم كما هو موضحسابقا 17.