يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

5.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61694

⸱

أغسطس 25, 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية الصالحة للحياة للغاية من منصات الدهون الظهارية الماوس باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلوريس.

الملخص

السمنة والاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري, أمراض القلب, والسرطان, وترتبط جميع مع إعادة عرض الأنسجة الدهنية مثيرة. الخلايا الدهنية الدهنية (APCs) الأنسجة المقيمة تلعب دورا رئيسيا في الأنسجة الدهنية التوازن ويمكن أن تسهم في علم الأمراض الأنسجة. إن الاستخدام المتزايد لتكنولوجيات تحليل الخلايا المفردة - بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وبروتيوميكس أحادي الخلية - يحول مجال الخلايا الجذعية/السلفة من خلال السماح بحل غير مسبوق لتغيرات التعبير الخلوي الفردية في سياق التغيرات السكانية أو على نطاق الأنسجة. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتشريح الماوس الأنسجة الدهنية الظهارية، وعزل الخلايا الدهنية واحدة مشتقة من الأنسجة، وتنفيذ الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لإثراء لSCA1+/ CD31 قابلة للحياة-/ CD45-/ Ter119- APCs. وستتيح هذه البروتوكولات للمحققين إعداد مراكز عالية الجودة من الكارود للأفراد مناسبة للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

المقدمة

يلعب النسيج الدهني دورًا رئيسيًا في استقلاب الطاقة. يتم تخزين الطاقة الزائدة في شكل الدهون، والأنسجة الدهنية قادرة على التوسع أو التراجع كبيرة اعتمادا على الوضع الغذائي والطلب النشط. يمكن أن ينتج توسع الأنسجة الدهنية عن زيادة حجم الخلايا الشحمية (تضخم) و/أو من زيادة في عدد الخلايا الدهنية (فرط التنسج)؛ العملية الأخيرة ينظمها بإحكام انتشار وتمايز الخلايا السلف الدهنية1,2. خلال السمنة، الأنسجة الدهنية يتوسع بشكل مفرط، والخلل الوظيفي الأنسجة – بما في ذلك نقص الأكسجة, التهاب, ومقاومة الأنسولين – غالبا ما يتطور3,4. هذه المضاعفات هي عوامل الخطر للعديد من الأمراض المزمنة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والسرطان5. وبالتالي، الحد من توسع الأنسجة الدهنية غير المنضبط وتخفيف أمراض الأنسجة الدهنية هي أعلى أولويات البحوث الطبية الحيوية. خلال توسع الأنسجة الدهنية ، يتكاثر الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية المقيمة (ASCs) ويميز بشكل متسلسل إلى preadipocytes (الخلايا السلف الملتزمة) ثم إلى الخلايا الدهنية الناضجة6. تظهر الدراسات الحديثة أحادية الخلية RNA تسلسل (scRNA-seq) أن هذه الخلايا السلف الدهنية (APC) السكان (ASCs وpreadipocytes) تظهر التجانس الجزيئي والوظيفية كبيرة7,8,9,10,11,12. على سبيل المثال، تعرض ASCs قدرة تمايز adipogenic مخفضة، في حين تظهر أيضًا قدرات أعلى للانتشار والتوسع، مقارنة بـ preadipocytes7. يتم الإبلاغ عن مزيد من الاختلافات الجزيئية داخل ASC والسكان preadipocyte، على الرغم من أن الأهمية الوظيفية لهذه الاختلافات لا تزال غير واضحة7. وتبرز هذه البيانات مجتمعة تعقيد تجمع الخلايا السلف الدهنية وتؤكد على الحاجة إلى تطوير وتوحيد الأدوات لتحسين فهم ومعالجة هذه التجمعات السكانية الحرجة من الخلايا.

هذا البروتوكول تفاصيل عزل Sca1 قابلية عاليةللحياة + مجموعات الخلايا السلف الدهنية من الماوس منصات الدهون الظهارية التي هي مناسبة لتحليلات المتلقين للحساسية، بما في ذلك دراسات الخلية المفردة (scRNA التسلسل) وثقافة الخلية. تم إجراء عزل وتفكك منصات الدهون الظهارية كما سبق وصفها7,13 مع تعديلات طفيفة تحسن من صلاحية الـ APCs المعزولة. باختصار، تلطخ الخلايا المنفصلة من منصات الدهون الظهارية بالأجسام المضادة ضد Sca1، وهي علامة لكل من ASCs وpreadipocytes6و7وعلامات النسب الأخرى (Lin): Ter119 (الخلايا الإريثرويدية)، CD31 (الخلايا البطانية)، وD45 (الكريات البيض). سكا 1 قابلة للحياة+/ Ter119-/ CD31-/ CD45-/ DAPI- ثم يتم فرز الخلايا من قبل فرز الخلايا المنشطة الفلورة (FACS). الأهم من ذلك، تم التحقق من صحة هذا البروتوكول من خلال عزل ناجحة وتحليل Sca1+/Lin- الخلايا السلف الدهنية ذكرت في دراسة حديثة تسلسل RNA خلية واحدة التي حددت الاكتظاظ الفرعي غير متجانسة وظيفيا داخل ASCs و preadipocytes7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية للحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في Mayo Clinic (مايو كلينك).

1. إعداد الحل

  1. إعداد الكولاجين 2٪ (ث / الخامس) حل عن طريق حل الكولاجين الثاني 2 ز في 100 مل هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS). Aliquot 200 ميكرولتر لكل استخدام.
  2. إعداد وسيط تحييد عن طريق خلط 84 مل F-12 المتوسطة، 15 مل مصل الخيل، و 1 مل البنسلين / ستربتوميسين.
  3. إعداد تدفق العازلة التميتري عن طريق حل 500 ملغ من الألبومين مصل الأبقار (BSA) و 400 ميكرولتر من 0.5 M EDTA في 100 مل من محلول ملحي Dulbecco الفوسفات المخزنة (DPBS).

2. تشريح من وسادة الدهون epididymal وتفكك الأنسجة

  1. القتل الرحيم إنسانيا (isoflurane / خلع عنق الرحم) فأر ذكر واحد. في هذا البروتوكول، تم استخدام ماوس FVB عمرها أربعة أشهر.
  2. تطبيق / رش 70٪ الإيثانول على البطن وفضح تجويف البطن السفلي باستخدام مقص نظيفة والملقط.
  3. تحديد موقع لوحة الدهون الظهارية (قريب / تعلق على الخصيات). عقد تقاطع بين الخصيات ومنصة الدهون epididymal مع ملقط حادة وسحب بلطف لتحرير وسادة الدهون epididymal.
  4. إزالة الخصيات عن طريق قطع باستخدام مقص واحتضان وسادة الدهون epididymal في 5 مل من HBSS تكملها 3٪ BSA في أنبوب مخروطي 50 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. جهاز طرد مركزي عند 150 × ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. اتخاذ عائمة رقة الدهون الظهارية من أنبوب مخروطي 50 مل و mince ناعما الأنسجة باستخدام مقص نظيفة.
  7. أضف محلول 200 ميكرولتر كولاجيناز 2٪ إلى 3.8 مل من HBSS في أنبوب ثقافة 13 مل. إضافة الأنسجة المفروم واحتضان في حاضنة الدورية في 5 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. بدلا من حاضنة الدورية، حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية يمكن استخدامها بدلا من ذلك مع الانفعالات في بعض الأحيان.
  8. نقل محتويات كاملة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 10 مل من وسيط تحييد. تخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب 2-3 مرات.
  9. إعداد أنبوب مخروطي آخر 50 مل مزودة مصفاة خلية 70 ميكرومتر. تصفية الأنسجة المهضوبة في أنبوب جديد باستخدام مصفاة الخلية.
  10. نقل تدفق من خلال أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  11. إزالة بعناية الكريات الخلية فائقة وsuspend مع 5 مل من DPBS. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. إزالة بعناية فائقة وإضافة 50 ميكرولتر من تدفق العازلة cytometry. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف والحفاظ على الخلايا على الجليد. نظرا لحجم الكريات الخلية وكمية صغيرة من فائقة المتبقية، فإن الحجم الكلي للخلايا في المخزن المؤقت للخلايا تدفق يكون أكبر من 50 ميكرولتر (حوالي 100 ميكرولتر).

3. وضع علامات الأجسام المضادة وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)

  1. بعد خلط الخلايا جيدا مع الأنابيب لطيف، نقل 54 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل. إضافة 6 ميكرولتر من FcR حظر الكاشف ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حفظ أي بقايا الخلايا بعد أخذ 54 μL والاحتفاظ بها في الجليد لاستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة 3.5 والخطوة 3.6.
  2. أثناء الحضانة في الخطوة 3.1، وإعداد كوكتيل الأجسام المضادة من خلال الجمع بين 11 ميكرولتر كل من المضادة-Sca1-APC، المضادة ل-Ter119-FITC، المضادة لـ CD31-FITC، ومضادات CD45-FITC الأجسام المضادة في أنبوب microcentrifuge. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف والحفاظ على الجليد المحمية من الضوء.
  3. بعد الحضانة مع FcR منع الكاشف لمدة 10 دقيقة، إضافة 40 μL من كوكتيل الأجسام المضادة وخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. إضافة 500 μL من تدفق العازلة قياس الخلايا تكملة مع 1 ميكروغرام / مل من DAPI في الخلايا الملطخة. مزيج جيد عن طريق الأنابيب لطيف وخلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. إبقاء الخلايا على الجليد.
  5. أضف 500 ميكرولتر من مخزن قياس الخلايا المتدفق إلى الخلايا المتبقية في الخطوة 3.1 واخلط جيداً عن طريق الأنابيب اللطيفة. خلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. الاحتفاظ بهذه الخلايا على الجليد واستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة التالية.
  6. خذ الخلايا الملطخة والسيطرة غير الملطخة إلى تحليل FACS أو أداة الفرز.
    1. تحديد وعزل APC+/FITC-/DAPI- السكان مع استراتيجيات الغاتة الموضحة في الشكل 1. وتمثل هذه الخلايا Sca1 قابلة للحياة+/ Ter119-/CD31-/ CD45- الخلايا. تستنفد مجاميع الحطام والخلية باستخدام مخططات التشتت الأمامي والجانبي .(SSC). ثم، DAPI- يتم بوابات السكان، تليها الغاءات من APC+/ FITC- السكان. يجب استخدام عناصر التحكم غير المُطَرَّكة للمساعدة في تعيين معلمات البوابات.
    2. جمع الخلايا في 500 ميكرولتر من تدفق العازلة للخلايا في أنبوب microcentuge 1.5 مل. للمضي قدما، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة للحد من التلوث. يتم جمع ما يقرب من 50،000 - 100،000 خلية من فأرة واحدة.
  7. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت لتقييم جدوى الخلية. وبما أن مجاميع الخلايا يمكن أن تتداخل مع تحليلات المصب، فإن وجود مجاميع الخلايا يتم تقييمه أيضاً لضمان وجود الحد الأدنى (<5٪ من عدد الخلايا القابلة للتطبيق) لهذه المجاميع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام فئران FVB الذكور البالغ من العمر أربعة أشهر في هذه التجربة. وبعد استبعاد الحطام والمزدوجة باستخدام مخططات FSC/SSC، تم اًبواؤها ببوابات الخلايا القابلة للحياة (DAPI- السكان)، يليها اختيار APC+/ FITC- السكان (الشكل 1). تم رسم بوابات DAPI و APC و FITC استنادًا إلى التحكم غير المطّط. وتظهر استراتيجيات الغاتينغ في الشكل 1.

بعد 1 ح من الفرز، تم تقييم نوعية العزلة كميا من خلال تحليل تدفق قياس الثغر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسلسل RNA خلية واحدة (scRNA-seq) تكتسب بسرعة الجر كأداة قوية لدراسة في وقت واحد مجموعات الخلايا المتنوعة على مستوى الخلية الواحدة. نظراً لارتفاع التكاليف المرتبطة بإعداد العينة وتسلسل الإنتاجية العالية، لا بد من تحسين المدخلات الخلوية (قابلية البقاء العالية والنقاء) لزيادة احتمال النجاح التجريبي. تعتمد بعض بروتوكولات إعداد الخلايا على إزالة الخلايا الميتة والحطام باستخدام يغسل منخفض الدوران وفصل قائم على العمود دون فرز FACS14. العديد من هذه الأساليب، ومع ذلك، يقلل بشكل كبير من عدد الخلايا المستردة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن نقر بمرفق تحليل الخلايا المجهرية من Mayo Clinic (مايو كلينك) لتحليل التدفق الخلوي الأساسي للحصول على المساعدة في فرز FACS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 ملVWR87003-294
13 مل أنبوب ثقافةThermo Fisher Scientific50-809-216
15 مل أنبوب مخروطيGreiner Bio-one188 271
5 مل أنبوب اختبار مع غطاء مصفاة خليةThermo Fisher Scientific08-771-23
50 مل أنبوب مخروطيGreiner Bio-one227 261
70 وميكرو ؛ مصفاة الخلايا mThermo Fisher Scientific22-363-548
الأجسام المضادة ل CD31-FITCMiltenyi Biotec130-102-519
الجسم المضاد ل CD45-FITCMiltenyi Biotec130-102-491
الجسم المضاد ل Sca1-APCMiltenyi Biotec130-102-833
الأجسام المضادة Anti-Ter119-FITCMiltenyi Biotec130-112-908
BSAGold BiotechnologyA-420-500
كولاجيناز من النوع الثانيثيرمو فيشر العلمي17101-015
DAPIThermo FisherD1306
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
F-12 متوسطثيرمو فيشر Scientific11765-054
كاشف حجب FcRMiltenyi Biotec130-092-575
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025-092
مصل الحصانThermo Fisher Scientific16050-122
البنسلين الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140-122
محلول يوديد البروبيديومMiltenyi Biotec130-093-233
محلول

المراجع

  1. Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
  2. Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
  4. Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
  5. Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
  6. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
  7. Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).
  8. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
  9. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636(2018).
  10. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501(2019).
  11. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
  12. Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
  13. De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
  14. Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219(2020).
  15. Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057(2018).
  16. Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
  17. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  18. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.