يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير شرائح الدماغ الحادة من القطب الظهري للحصين من القوارض البالغة

3.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61699

⸱

سبتمبر 10, 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

في هذه المقالة

ملخص

الغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لإنتاج شرائح من الحصين الظهري للفحص الفيزيولوجي الكهربي. يستخدم هذا الإجراء التروية باستخدام ACSF المبرد قبل تحضير الشريحة بزاوية تقطيع قريبة من الإكلية مما يسمح بالحفاظ على الخلايا العصبية الرئيسية السليمة.

الملخص

تعد تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح دماغ القوارض الحادة الدعامة الأساسية للأبحاث الفيزيولوجية العصبية الحديثة ، مما يسمح بالقياس الدقيق للخصائص الخلوية والمشبكية. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لإجراء تحليلات مترابطة بين الأنماط التجريبية المختلفة بالإضافة إلى الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح ، على سبيل المثال: الكيمياء المناعية ، البيولوجيا الجزيئية ، التصوير في الجسم الحي أو التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. للإجابة على الأسئلة المعقدة من أي وقت مضى عن وظائف الدماغ. ومع ذلك ، فإن التوصل إلى استنتاجات ذات مغزى من هذه الأساليب التجريبية المختلفة ليس بالأمر السهل ، لأنه حتى داخل هياكل الدماغ الموصوفة جيدا نسبيا ، توجد درجة عالية من التباين شبه الإقليمي للوظيفة الخلوية. لا يوجد مكان يتمثل فيه هذا بشكل أفضل من CA1 للحصين ، الذي له خصائص ظهرية بطنية محددة جيدا ، بناء على الخصائص الخلوية والجزيئية. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات المنشورة تفحص أنماط التعبير عن البروتين أو مرتبطة سلوكيا في النشاط في الجسم الحي في المدى الظهري للحصين. وشرح النتائج ميكانيكيا باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية من منطقة البنترو الإنسية. هذا مربك أيضا بسبب حقيقة أن العديد من تجارب الفيزيولوجيا الكهربية للشرائح الحادة يتم إجراؤها في الصغيرة ، عندما يتم إجراء أنماط تجريبية أخرى في الأكثر نضجا. لمعالجة هذه المشكلات ، تتضمن هذه الطريقة نضح عبر القلب للقوارض الناضجة (>60 يوما) مع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي متبوعا بإعداد شرائح إكليلية معدلة بما في ذلك عمود الحاجز للحصين الظهري للتسجيل من الخلايا الهرمية CA1. تؤدي هذه العملية إلى توليد شرائح حادة صحية من الحصين الظهري مما يسمح باستجواب الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية القائمة على الشريحة المطابقة للتدابير الأخرى.

المقدمة

يمكن القول إن الحصين هو الهيكل الأكثر دراسة جيدا في دماغ الثدييات ، نظرا لحجمه الكبير نسبيا وبنيته الصفيحية البارزة. تورط الحصين في عدد من العمليات السلوكية: التنقل المكاني ، والذاكرة السياقية ، وتشكيل الحلقة. ويرجع ذلك جزئيا إلى السهولة النسبية للوصول إلى الأجزاء الظهرية من الحصين في القوارض لتحليلها في الجسم الحي . في الواقع ، عادة ما تكون خلايا الإخراج الرئيسية أقل من 2 مم من سطح القرص.

في القوارض ، الحصين عبارة عن هيكل كبير نسبيا ، يتكون من غزو الدماغ الممتد من الحاجز الظهري إلى القشرة المخية البطنية. وهي تتألف من 2 مناطق رئيسية: التلفيف المسنن والكورنو الأمونيس (CA); ينقسم الأخير إلى 3 مناطق فرعية موصوفة جيدا (CA1-3) تمتد إلى مسام التلفيف المسنن (المعروف سابقا باسم CA4) ، بناء على الاتصال والتشريح الخلوي والخصائص الجينية1. يتم الحفاظ على هذا الهيكل على طول المدى الظهري البطني للحصين ، وإن كان ذلك مع اختلافات كبيرة في الخصائص المشبكية2،3،4 ، والتشريح5 ، والتنوع الجيني6،7،8 ، والوظيفة السلوكية9،10. من بين مناطق CA ، يتكون الحقل الفرعي CA1 إلى حد كبير من الخلايا الهرمية CA1 الجلوتاماتية (CA1 PCs) ، والتي تم تحديد 3 أنواع فرعيةلها 11 ، والخلايا العصبية الداخلية المثبطة التي تشكل ~ 10٪ من الخلايا العصبية ، ولكنها متنوعة للغاية مع أكثر من 30 نوعا فرعيا محددا12،13،14. بالإضافة إلى الاختلافات الإقليمية المحددة ، فقد ثبت أن الشيخوخة الطبيعية لها تأثيرات كبيرة على الانتقال المشبكي15،16،17 ، والتشريح18 ، والملف الجيني19. الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتقييم تعقيدات الخصائص الخلوية والمشبكية بطريقة خاضعة للرقابة هي من خلال استخدام تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من شرائح الدماغ الحادة20.

يعتمد فهم وظيفة الحصين إلى حد كبير على التلاعب الظهري نظرا لسهولة الوصول إليها جراحيا أو تشريحيا للمهام السلوكية ، أو زرع أقطاب كهربائية أو نوافذ تصوير ، أو تعبير البلازميد الفيروسي. في العديد من الدراسات بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنفيذ هذه الإجراءات مع القوارض المتأخرة أو البالغة لمنع التباين في بنية الدماغ أثناء النمو. على الرغم من ذلك ، يتم تنفيذ العديد من الأساليب لفحص الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية وتحت الخلوية في القوارض المبكرة إلى المتوسطة ، من الجزء البطني الإنسي في الغالب من الحصين في مستواه المستعرض21،22،23،24،25. عندما يتم تقييم المدى الظهري البطني بالكامل ، يتم استخدام مفرمة الأنسجة للحفاظ على المدى العرضي4،26 ، أو تم إجراء التجربة في الفئران الصغيرة27 أو الفئران28. علاوة على ذلك ، من المعروف أن تبريد الأنسجة قبل تشريح الدماغ يحافظ على بنية الحصين في الفئران29 والخلايا العصبية القشرية الحديثة في الفئران30،31. ومع ذلك ، هناك ندرة في التفاصيل فيما يتعلق بإنتاج شرائح الدماغ من المحور العرضي الظهري للحصين ، كما تم إنشاؤه بواسطة الشرائح الإكليلية المعدلة ، في الفئران الناضجة.

يصف هذا البروتوكول نهجا يمكن من خلاله الحصول على تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية المفردة أو الأزواج في شرائح إكليلية معدلة من الحصين الظهري من الفئران المسنة ، متبوعا بتحديد مورفولوجي لاحق. يتم الحصول على شرائح الدماغ السليمة بعد التروية عبر القلب للسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المبرد (ACSF) ، مما يسهل قياس الخصائص الفيزيولوجية الكهربية من أجهزة الكمبيوتر CA1 والخلايا العصبية الداخلية المحلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم توليد جميع وصيانتها وفقا لإرشادات وزارة الداخلية والمؤسسات (HO # P135148E). تم الحفاظ على جميع الفئران في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة وتم منحها إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.

1. نضح عبر القلب من ACSF المبرد

  1. قبل جميع التجارب ، ضع ~ 200 مل من السكروز ACSF (الجدول 1) في الفريزر عند -20 درجة مئوية (حتى شبه مجمدة ، للتقطيع) و ~ 100-200 مل أخرى من السكروز المصفى ACSF على الجليد (للنضح) ، فقاعات مع الكربوجين (95٪ O2/5٪ CO2).
  2. اجمع فأرا بالغا من قفص منزله وضعه لمدة ~ 30 دقيقة في قفص احتجاز في غرفة العمليات للتأقلم مع مستويات الضوضاء والضوء.
  3. تحضير أدوات التشريح (الشكل 1 أ) ومنطقة التروية والمخدر عن طريق الحقن (حوالي 1 مل من 200 ملغم/مل بنتوباربيتال الصوديوم للتركيز النهائي 100 ملغم/كغ).
  4. قم بإعداد غرفة تخدير مناسبة عن طريق وضع مسحة صغيرة من المناديل الورقية أو الصوف القطني بالداخل. أدخل 1-2 مل من مخدر الأيزوفلوران المتطاير إلى المادة الماصة في الغرفة.
  5. ضع الجرذ في غرفة التخدير للتخدير. راقب التنفس حتى ينخفض معدل التنفس إلى ~ 1 نفس ضحل في الثانية.
  6. في هذه المرحلة ، ابدأ في غلي السكروز شبه المجمد ACSF مع الكربوجين على الثلج لاستخدامه أثناء التقطيع.
  7. قم بوزن الجرذ ولاحظ وزنه.
  8. تخدير الفئران بشكل نهائي عن طريق حقن البنتوباربيتال الصوديوم المحضر في التجويف داخل الصفاق. يجب أن تكون جرعة البنتوباربيتال الصوديوم 100 مجم / كجم ، محسوبة من الوزن المأخوذ مسبقا وتركيز مخزون الدواء. ضع الجرذ في غرفة احتجاز واترك 0.5-5 دقائق لبدء التخدير النهائي.
  9. تأكيد توقف ردود الفعل: اختبر كل من وميض القرنية (المس التلميذ) وقرص المخلب الخلفي (رفع الساق والضغط على المخلب الخلفي) باستخدام مسبار حاد (أي ملقط مستدير). بمجرد توقف ردود الفعل ، قم بتثبيت الجرذ على اللوح الجراحي للبوليسترين أو الفلين باستخدام إبر تحت الجلد.
  10. افتح تجويف الصدر وضع القنية في قاعدة البطين الأيسر للقلب. ثقب الأذين الأيمن وابدأ على الفور بالتروية باستخدام السكروز المثلج البارد (0-1 درجة مئوية) ACSF (باستخدام مضخة تمعجية عند 50 مل / دقيقة).
  11. بمجرد حدوث التبادل الكامل للسوائل وتبريد الجسم (<5 دقائق) ، قم بإزالة القنية والدبابيس ، ثم قطع الرأس باستخدام المقصلة.
  12. قم بإزالة الجمجمة بعناية وسرعة باستخدام مقص العظام وأدوات عظام Rongeur (الشكل 1أ ، 1 ب).
    1. ابدأ بعمل شق ثنائي 2x من خلال الثقبة ماغنوم باستخدام مقص العظام وقم بإزالة الجمجمة إلى خياطة لامدا باستخدام Rongeurs. قص بعناية على طول خياطة خط الوسط باستخدام مقص العظام خلف العينين مباشرة.
    2. قم بعمل 2x قطع ثنائية عبر الجمجمة ، عموديا على خط الوسط. باستخدام Rongeurs ، افتح الجمجمة على طول خط الوسط. توخي الحذر الشديد لإزالة الأم باستخدام مقص دقيق أو إبرة معقوفة.
  13. اخرج الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة حادة ، وقطع الأعصاب القحفية والبصرية بضغط من جانب إلى آخر. ضع الدماغ في السكروز المكربوجين وشبه المجمد (0-1 درجة مئوية) لمدة 1-2 دقيقة قبل التقطيع.

2. تحضير شرائح الدماغ من الحصين الظهري

  1. قم بإزالة الدماغ المنفوخ من السكروز شبه المجمد (0-1 درجة مئوية) ووضعه في طبق بتري زجاجي مبطن بورق الترشيح. ضع الدماغ على سطحه البطني.
  2. باستخدام مشرط (شفرة رقم 22) ، قم بإزالة الجزء الخلفي من الدماغ عند ~ 10 درجة من الوضع الرأسي لإنشاء سطح مستو للصق الدماغ على المسرح (الشكل 1 ج).
  3. ضع كمية صغيرة من غراء سيانواكريليت على مرحلة الاهتزاز. انشر الغراء لعمل طبقة رقيقة أكبر بنسبة 50٪ تقريبا من مساحة المقطع العرضي لسطح الدماغ المقطوع.
  4. ارفع الدماغ من الطبق الزجاجي على ملعقة ، واقطع الجانب لأسفل ، باستخدام فرشاة رسم لتوجيه الأنسجة. امسح الدماغ بقطعة من الأنسجة لإزالة ACSF الزائد وحرك الدماغ ، وقطع السطح لأسفل ، على مركز الغراء. باستخدام ماصة باستور ، أضف 1-2 مل من السكروز المثلج ACSF فوق الدماغ لإزالة الغراء بعيدا عن كتلة الدماغ.
  5. ضع الدماغ في غرفة التقطيع وغمره بالسكروز شبه المجمد ACSF. استخدم ملعقة أو ملعقة لإبعاد الثلج الزائد عن كتلة الدماغ ، ثم الكربوجين (الشكل 1 د).
  6. حرك شفرة الاهتزاز إلى موضعها: ~ 1 مم من السطح الظهري للدماغ وعموديا ~ 1 مم أمام البريجما. تأكد من غمر الشفرة بالكامل ، وقم بإزالة الفقاعات باستخدام فرشاة الرسم.
  7. ابدأ في تقطيع الدماغ. للتقليم إلى الحصين الظهري ، استخدم سرعة 0.1-0.2 مم / ثانية ، مع حركة شفرة أفقية من 1-1.5 مم ومعدل تذبذب متبادل ~ 90 هرتز. عند تقطيع الحصين الظهري ، قلل السرعة إلى 0.05-0.1 مم / ثانية.
  8. اجمع شرائح الحصين الظهري (اسميا 3-4 شرائح كاملة أو 6-8 شرائح نصف مقطوعة) لكل دماغ. إذا كانت هناك حاجة إلى شرائح طولية من الحصين البطني الإنسي ، فاستمر في التقطيع. بمجرد تقطيع الحصين الظهري ، ليست هناك حاجة لقطع أنسجة إضافية تتجاوزموضع البطين الثالث تقريبا. أوقف الاهتزاز ، وافصل الشريحة بإبرة تحت الجلد مثنية ، واجمعها في قاعدة غرفة التقطيع.
    ملاحظة: يمكن أن يتراوح سمك الشرائح بين 250 و 500 ميكرومتر ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية. بالنسبة للتسجيلات من الحصين الظهري ، عادة ما تستخدم شرائح بسمك 400 ميكرومتر للحفاظ على أكبر قدر ممكن من الشبكة المحلية ، مع السماح بظروف الفحص المجهري المناسبة.
  9. قم بقص الشرائح لتحتوي فقط على الحصين والقشرة المغطى تحت مجهر تشريح. انقل الشرائح إلى حجرة 35 درجة مئوية الدافئة مسبقا بحيث يكون السطح الأمامي متجها لأعلى.
  10. تحديد غرفة التخزين بناء على التجربة المراد إجراؤها. للحصول على تسجيلات عالية الجودة لمشبك التصحيح أو خارج الخلية بالقرب من سطح الشريحة في غرف التسجيل المغمورة ، قم بتخزينها في غرف مغمورة. بدلا من ذلك ، قم بتخزينها في غرفة واجهة سائلة / غاز لتسجيلات نشاط الشبكة التذبذبية أو تسجيلات مجال الواجهة خارج الخلية.
  11. بالنسبة لظروف التخزين المغمورة ، اسمح للشرائح بالتعافي عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من وقت دخول آخر شريحة إلى غرفة التخزين. هذا يسمح بإعادة تنشيط عمليات التمثيل الغذائي وإعادة ختم الأعصاب المقطوعة. بعد 30 دقيقة ، انقل غرفة التخزين إلى درجة حرارة الغرفة.

3. تسجيل الخلايا العصبية الحصين الظهرية

  1. تصنيع ماصات تصحيح التسجيل من الزجاج الشعري. يستخدم هذا البروتوكول قطرا خارجيا 1.5 مم ، وزجاج البورسليكات بقطر داخلي 0.86 مم مع خيوط ، مما ينتج عنه مقاومة طرف تتراوح من 3 إلى 5 MΩ عند ملئه بمحلول داخل الخلايا (الجدول 1). احتفظ بالمحاليل داخل الخلايا مبردة على الثلج لمنع تدهور المكونات النشطة وتصفيتها قبل الاستخدام (مرشح الحقنة ، حجم المسام: 0.2 ميكرومتر).
  2. تسجيل الكربوجينات ACSF والتسخين المسبق في حمام مائي (35-40 درجة مئوية). قم بتوصيل ACSF المكربن والدافئ مسبقا إلى غرفة التسجيل عبر أنبوب التروية بمساعدة مضخة تمعجية. ابدأ التروية قبل عدة دقائق من نقل الشريحة إلى الغرفة.
  3. أوقف التروية وانقل شريحة دماغية إلى غرفة التسجيل بحيث يكون السطح الأمامي متجها لأعلى. ثبت الشريحة في مكانها بحلقة بلاتينية مع ألياف مفردة من الحرير متصلة لتشكيل شكل "القيثارة". ضع الشرائح بحيث تعمل الطبقة الهرمية من CA1 بشكل عمودي على محور ماصة التسجيل الأولى.
  4. أعد تشغيل تدفق تسجيل ACSF المكربوجيني والدافئ مسبقا (35-40 درجة مئوية) (الجدول 1) بالمعدل الأمثل 6-8 مل في الدقيقة -1.
    ملاحظة: معدلات التدفق العالية (6-8 مل∙ دقيقة-1) هي الأمثل للحفاظ على نشاط الشبكة في الشرائح32. يمكن استخدام معدلات التدفق المنخفضة (أي 2-3 مل ∙ دقيقة -1) للحفاظ على استقرار الشريحة لتجارب التصوير أو عندما لا يكون نشاط الشبكة ذي الصلة بيولوجيا مطلوبا.
  5. تقييم جودة الشريحة باستخدام بصريات تباين الاستدلال التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) مع تكبير موضوعي 40x (يتم تصورها بكاميرا CCD). افترض جودة شريحة جيدة إذا كان من الممكن رؤية عدد كبير من أجهزة كمبيوتر CA1 ذات الشكل البيضاوي والتباين المعتدل في شارع الهرمي على أعماق 20-30 ميكرومتر تحت سطح أملس ومدمل قليلا (الشكل 2 أ). تحتوي الشرائح ذات الجودة الرديئة على أعداد كبيرة من الخلايا شديدة التباين أو المنكمش أو المنتفخة ، مع سطح شريحة غير مستو.
  6. املأ الماصات اللاصقة بمحلول داخل الخلايا (على سبيل المثال، بناء على [Cl-] داخل الخلايا يبلغ 24 ملليمتر) للسماح بالمقارنة مع البيانات المنشورة الأخرى.
  7. قم بإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة كما هو موضحسابقا 22. استبعاد الخلايا من التحليل إذا كانت إمكانات الغشاء (VM) عند الاختراق أكثر استقطابا من -50 مللي فولت ، فإن مقاومة السلسلة هي >30 MΩ ؛ أو تتغير مقاومة السلسلة بنسبة >20٪ على مدار التسجيل. في ظل ظروف التسجيل هذه ، تكون مقاومة السلسلة عادة في حدود 8 - 25 MΩ ومستقرة لمدة تصل إلى ساعة واحدة.
  8. لفحص الاستثارة الجوهرية CA1 من الحصين الظهري ، اختبر الخصائص الفسيولوجية الجوهرية مع تسجيلات الخلية الكاملة باستخدام البروتوكولات التالية في تكوين المشبك الحالي:
    1. من إمكانات غشاء الراحة مع عدم تطبيق تيار التحيز ، قم بتطبيق خطوات حالية صغيرة (-10 باسكال ، 500 مللي ثانية) تتكرر 30 مرة.
    2. من -70 مللي فولت مع تطبيق تيار التحيز ، قم بتطبيق فرط على خطوات التيار لإزالة الاستقطاب لمدة 500 مللي ثانية (-100 إلى +400 باسكال ، 25 خطوة باسكال) مع 3 تكرارات لعائلة من الآثار.
    3. قم بتطبيق موجة جيبية تبلغ 100 pA من الذروة إلى الذروة ، بتردد متغير من 0.1 إلى 20 هرتز. كرر 3 مرات.
    4. قم بتطبيق محفزات 5x 2 nA و 2 مللي ثانية لدفع إمكانات الفعل عند 20 ، 40 ، 60 ، 80 ، 100 هرتز.
    5. من مشبك جهد -70 مللي فولت ، قم بتطبيق 5 دقائق من التيارات المثيرة التلقائية بعد المشبكي (EPSC) للتسجيل.
  9. لإعادة إغلاق الخلايا للتحليل النسيجي بعد التسجيل الناجح ، قم بإنتاج بقع خارجية للخارج عن طريق سحب ماصة التصحيح ببطء. عند ملاحظة زيادة في مقاومة السلسلة من المستويات التجريبية إلى >1 GΩ كما تم قياسها بواسطة نبضة اختبار -5 مللي فولت، ارفع إمكانات الاحتجاز إلى -40 مللي فولت وسحب الماصة بالكامل.
  10. قم بإجراء تسجيلات إضافية في نفس الشريحة لتلبية القوة الإحصائية المطلوبة للتصميم التجريبي.
  11. قم بإزالة شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا عصبية مسجلة من غرفة التسجيل ، وضعها في طبق مكون من 24 بئرا ، واستبدل ACSF بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (في محلول فوسفات 0.1 M) واتركه طوال الليل.
  12. في اليوم التالي ، استبدل PFA بمخزن فوسفات 0.1 M وقم بتخزينه حتى المعالجة النسيجية. تصور الخلايا التي تحتوي على الستربتافيدين المترافق بالفلورسنت كما هو موضحسابقا 22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح البروتوكول الموصوف أعلاه بإعداد شرائح قابلة للحياة من عمود الحاجز للحصين الظهري في الفئران الناضجة. العامل الرئيسي في هذا البروتوكول هو نضح السكروز المبرد ACSF ، قبل تحضير الشريحة ، مما ينتج عنه أجهزة كمبيوتر CA1 صحية قريبة من سطح الشريحة. يتم تقييم جودة الشريحة المنتجة بصريا تحت بصريات IR-DIC ، وتوجد الخلايا السليمة التي تم تحديدها على أنها تحتوي على أجسام خلوية كبيرة بيضاوية الشكل في جميع أنحاء النطاق الكامل للطبقة الهرمية ، من الطبقة المدمجة ، إلى الطبقة oriens (الشكل 2 أ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنتاج شرائح دماغية عالية الجودة من المدى الظهري ل CA1 للحصين ، مما يسمح بالتسجيلات من خلايا عصبية متعددة قابلة للحياة داخل هذه المنطقة. يعد النهج الاندماجي لتسجيل الخلية بأكملها من الشرائح القريبة من الإكليل متبوعا بتصور الخلايا العصبية أمرا بالغ الأهمية لتأكيد صلاحية الخلية وهويتها.

ينتج هذا البروتوكول بشكل موثوق شرائح قابلة للتطبيق لسببين رئيسيين. أولا ، يسمح تعديل زاوية القطع ، كانحراف عن الإكليل الحقيقي ، بالحفاظ بشكل أكبر على المحو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحب البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يود المؤلف أن يشكر البروفيسور ديفيد جيه إيه ويلي ، والدكتورة إيما بيركنز ، ولورا سيمويس دي أوليفيرا ، والبروفيسور بيتر سي كايند على التعليقات المفيدة حول تحسين المخطوطة والبروتوكول ، ومبادرة سيمونز لتطوير الدماغ لتوفير تكاليف النشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
برنامج الاستحواذالأجهزة الجزيئيةpClamp 10
الفئران البالغةالمختلفةN / Aأي سلالة من الفئران البالغة (60 يوما فما فوق)
مكبر للصوتالأجهزة الجزيئيةAxopatch 700B
برنامجتحليل مجانيStimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
مقص العظامFST16152-12أسلوب Littauer
شعريهارفاردجهاز 30-0060ماصات زجاجية من البورسليكات بخيوط بقطر خارجي 1.5 مم ، قطر داخلي 0.86 مم.
كربوجينBOCمختلف95٪ O 2 < / sub > / 5٪ CO2< / sub>
CCDالكاميرا ScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
المواد الكيميائية / الكواشفSigma Aldrichمختلفجميع الكواشف المختبرية التي تم شراؤها من Sigma Aldrich.
Cyanoacrylate (أي RS Pro 3)مكوناتRS 918-6872تجنب تركيبات cyanoacrylate القائمة على الهلام
جزيئيةمحول الأرقامتشريح Digidata 1550B
مختلفالاستخدامات المختلفة 16 إبر قياس (أعلاه)
نظام الفيزيولوجيا الكهربيةScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ مقص القزحية الناعم من الشرائح
العلمية FST14568-12مع نصائح كربيد التنجستن
طبق بتريزجاجي فيشر 12911408
العلمي الإبر تحت الجلدBD الرعاية الصحيةمختلف16 و 18 و 22
مقياس الأيزوفلوران 100٪ وزن / وزن (أي IsoFlo)Zoetis50019100
مقص من نوع MayoFST14110-17نصائح بلانت
معالجات دقيقةScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Paintbrush Art storen / aفرشاة رسم ذات شعيرات ناعمة ، تم شراؤها من متجر فني محلي.
ماصة باستورفيشر Scientific11546963ماصة باستور زجاجية ، ولكن مقطوعة بحيث يتم استخدام الطرف الحاد لنقل الماصة.
المضخة التمعجيةWatson Marlow12466260المضخة التمعجية أحادية القناة
مجتذب الماصةSutter InstrumentsP-97ستعمل النماذج والطرق الأخرى لإنتاج الماصة بشكل جيد.
محاقن بلاستيكية (1 ، 2 ، 5 مل)BD Healthcareأداة
FST16021-14
غرفة عقد شريحةمنزلية
/ القيثارةجهاز هارفاردSHD-22L / 15ستكون البدائل مناسبة.
الصوديوم Pentobarbital (أي Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 مجم / مل ؛ تركيبات أخرى من البنتوباربيتال ستكون مناسبة
ملعقةBochem3213متوفرة من
مرشحات حقنةفيشر Scientific10482012Corning ماركة مرشحات حقنة ، 0.22 ومايكرو ؛ م قطر المسام.
VibtratomeLeica1491200S001VT1200S موديل مع حمام مائي Vibrocheck
Fisher Scientific151670155 لتر حمام مائي ، على سبيل المثال: Grant Instruments & Trade ؛ JBA5 scientifica-scicam-pro
زجاج أجهزة دبابيس / إبر عظام Rongeur المختلفة الصنع

المراجع

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  3. Babiec, W. E., Jami, S. A., Guglietta, R., Chen, P. B., O'Dell, T. J. Differential regulation of NMDA receptor-mediated transmission by SK channels underlies dorsal-ventral differences in dynamics of schaffer collateral synaptic function. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1950-1964 (2017).
  4. Papatheodoropoulos, C. Striking differences in synaptic facilitation along the dorsoventral axis of the hippocampus. Neuroscience. 301, 454-470 (2015).
  5. O'Reilly, K. C., et al. Identification of dorsal-ventral hippocampal differentiation in neonatal rats. Brain Structure and Function. 220 (5), 2873-2893 (2015).
  6. Cembrowski, M. S., et al. Spatial gene-expression gradients underlie prominent heterogeneity of CA1 pyramidal neurons. Neuron. 89 (2), 351-368 (2016).
  7. Cembrowski, M. S., Wang, L., Sugino, K., Shields, B. C., Spruston, N. Hipposeq: a comprehensive RNA-seq database of gene expression in hippocampal principal neurons. elife. 5, 14997(2016).
  8. Leonardo, E., Richardson-Jones, J., Sibille, E., Kottman, A., Hen, R. Molecular heterogeneity along the dorsal–ventral axis of the murine hippocampal CA1 field: a microarray analysis of gene expression. Neuroscience. 137 (1), 177-186 (2006).
  9. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 77 (5), 955-968 (2013).
  10. Kjelstrup, K. B., et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science. 321 (5885), 140-143 (2008).
  11. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  12. Booker, S. A., Vida, I. Morphological diversity and connectivity of hippocampal interneurons. Cell and Tissue Research. 373 (3), 619-641 (2018).
  13. Freund, T. F., Buzsaki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347(1996).
  14. Pelkey, K. A., et al. Hippocampal GABAergic inhibitory interneurons. Physiological Reviews. 97 (4), 1619(2017).
  15. Barnes, C. A., Rao, G., Foster, T. C., McNaughton, B. L. Region-specific age effects on AMPA sensitivity: Electrophysiological evidence for loss of synaptic contacts in hippocampal field CA1. Hippocampus. 2 (4), 457-468 (1992).
  16. Potier, B., Jouvenceau, A., Epelbaum, J., Dutar, P. Age-related alterations of GABAergic input to CA1 pyramidal neurons and its control by nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampus. Neuroscience. 142 (1), 187-201 (2006).
  17. Ekonomou, A., Pagonopoulou, O., Angelatou, F. Age-dependent changes in adenosine A1 receptor and uptake site binding in the mouse brain: An autoradiographic study. Journal of Neuroscience Research. 60 (2), 257-265 (2000).
  18. Pyapali, G. K., Turner, D. A. Increased dendritic extent in hippocampal CA1 neurons from aged F344 rats. Neurobiology of Aging. 17 (4), 601-611 (1996).
  19. Blalock, E. M., et al. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3807-3819 (2003).
  20. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  21. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075(2006).
  22. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically-and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  23. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflügers Archive. 443 (3), 491-501 (2002).
  24. Aitken, P., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  25. Siwani, S., et al. OLMα2 cells bidirectionally modulate learning. Neuron. 99 (2), 404-412 (2018).
  26. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The rat hippocampal slice preparation as an in vitro model of ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  27. Dougherty, K. A. Differential developmental refinement of the intrinsic electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons from the rat dorsal and ventral hippocampus. Hippocampus. 30 (3), 233-249 (2020).
  28. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Reports. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  29. Newman, G. C., Qi, H., Hospod, F. E., Grundmann, K. Preservation of hippocampal brain slices with in vivo or in vitro hypothermia. Brain Research. 575 (1), 159-163 (1992).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Springer. 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  33. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  34. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. (10), Cold Spring Harbor Protocols. 4848(2007).
  35. Gee, C. E., Ohmert, I., Wiegert, J. S., Oertner, T. G. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), (2017).
  36. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  37. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-Clamp Analysis. , Springer. 135-193 (2002).
  38. Dougherty, K. A., et al. Differential expression of HCN subunits alters voltage-dependent gating of h-channels in CA1 pyramidal neurons from dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1940-1953 (2013).
  39. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 48(2013).
  40. Booker, S. A., et al. Presynaptic GABAB receptors functionally uncouple somatostatin interneurons from the active hippocampal network. Elife. 9, 51156(2020).
  41. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  42. Ordemann, G. J., Apgar, C. J., Brager, D. H. D-type potassium channels normalize action potential firing between dorsal and ventral CA1 neurons of the mouse hippocampus. Journal of Neurophysiology. 121 (3), 983-995 (2019).
  43. Arnold, E. C., McMurray, C., Gray, R., Johnston, D. Epilepsy-induced reduction in HCN channel expression contributes to an increased excitability in dorsal, but not ventral, hippocampal CA1 neurons. eNeuro. 6 (2), (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المنطقة CA1 في الحصينالجزء الظهري من الحصينتثبيت الرقعة للخلية الكاملةالتروية عبر القلبشرائح إكليلية معدلةالفيزيولوجيا الكهربائية للقوارضتحضير الشرائحالفيزيولوجيا الكهربائية الخلويةتحضير شرائح الدماغ

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.