تحدد هذه المقالة الشروط المختبرية الأساسية والبروتوكولات لنظام درجة الحرارة التدريجي لتحفيز التفريخ الأقصى في رباعية Astyanax المكسيكيةالمكسيكية ، وهو نموذج ناشئ للدراسات التنموية والتطورية.
مقالة منهجية
تحدد هذه المقالة الشروط المختبرية الأساسية والبروتوكولات لنظام درجة الحرارة التدريجي لتحفيز التفريخ الأقصى في رباعية Astyanax المكسيكيةالمكسيكية ، وهو نموذج ناشئ للدراسات التنموية والتطورية.
رباعية المكسيكية, Astyanax mexicanus, هو نظام نموذج الناشئة للدراسات في التنمية والتطور. وجود سطح العينين (الأسماك السطحية) وكهف أعمى (أسماك الكهوف) يتحول في هذا النوع يمثل فرصة لاستجواب الآليات الكامنة وراء التطور المورفولوجي والسلوكي. وقد تطورت أسماك الكهوف سمات بناءة وتراجعية جديدة. وتشمل التغييرات البناءة زيادات في براعم الذوق والفكين، والأعضاء الحسية الجانبية الخط، والدهون في الجسم. وتشمل التغييرات التراجعية فقدان العينين أو تقليلها. تصبغ الميلانين، والسلوك المدرسي، والعدوان، والنوم. لاستجواب هذه التغييرات تجريبيا، من المهم الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة التي ولدت. منذ أن تم جمع الأسماك السطحية الأصلية A. mexicanus وأسماك الكهوف في تكساس والمكسيك في التسعينيات ، تم تحفيز أحفادهم بشكل روتيني على تربية وتفريخ أعداد كبيرة من الأجنة كل شهرين في مختبر جيفري. على الرغم من أن يتم التحكم في التربية من خلال وفرة الغذاء والجودة، ودورات ضوء الظلام، ودرجة الحرارة، وجدنا أن التغيرات في درجة الحرارة الإضافية تلعب دورا رئيسيا في تحفيز التفريخ القصوى. وتوفر الزيادة التدريجية في درجة الحرارة من 72 درجة فهرنهايت إلى 78 درجة فهرنهايت في الأيام الثلاثة الأولى من أسبوع التكاثر يومين إلى ثلاثة أيام تفريخ متتالية مع أعداد قصوى من الأجنة عالية الجودة، ثم يتبع ذلك انخفاض تدريجي في درجة الحرارة من 78 درجة فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام الثلاثة الأخيرة من أسبوع التفريخ. الإجراءات المبينة في هذا الفيديو تحدد سير العمل قبل وأثناء أسبوع تربية المختبر لدرجة الحرارة الإضافية حفز تفريخ.
وteleost Astyanax mexicanus لديه العينين سطح المسكن (سطح السمك) شكل والعديد من مختلف أعمى كهف المسكن (كهف الأسماك) أشكال1،2. تطورت أسماك الكهوف في ظلام دائم وتحت قيود الغذاء ، مما أدى إلى ظهور سمات بناءة وتراجعية جديدة3. وتشمل الصفات البناءة زيادات في براعم الذوق وحجم الفك، والأعضاء الحسية للخط الجانبي، واحتياطيات الدهون. وتشمل الصفات التراجعية فقدان أو الحد من تصبغ الميلانين، والعينين، والسلوكيات، مثل النوم، والتعليم، والعدوان. سمة من سمات نظام Astyanax هي الخصوبة الكاملة بين الشكلين ، مما يسمح باستخدام رسم خرائط سمة كمية لتحديد المنطقة الجينومية المرتبطة بالتطور البناء والتراجعي4و5و6و7. A. mexicanus يقدم نظاما مفيدا لدراسة التنمية لأنه يمكن حث على تفريخ في كثير من الأحيان في المختبر. أجنة A. mexicanus شفافة ، أكبر قليلا من تلك التي من حمار وحشي ، تنتج بكميات كبيرة ، وتتطور إلى البالغين الناضجين جنسيا في حوالي 8-12 شهرا. فترة طاقة التفريخ القصوى حوالي 5 سنوات. يصف هذا البروتوكول سير العمل المطلوب في منشأة زراعة مكسيكية خلال أسبوع تربية نموذجي ويتضمن تفاصيل صيانة نظام الأسماك ونظام التحكم في درجة الحرارة للتفريخ الأقصى.
أ. المكسيكية هي سمكة استوائية تعيش في الأنهار التي تنشأ في الهضاب الجيرية (الأسماك السطحية) وفي برك في كهوف الحجر الجيري (أسماك الكهوف)8. يذوب الحجر الجيري لإنتاج المياه الصلبة، و A. mexicanus يزدهر في الماء الصلب. الأسماك تتكيف مع ظروف المياه الصلبة يمكن أن تتسامح مع مجموعة من الظروف المالحة، ولكن تولد عموما في تلك محددة9. يتم تحقيق تحريض سلوك التفريخ من خلال مجموعة من العوامل. لأن الأسماك بدم بارد وتعتمد على بيئتها للحفاظ على التوازن، والتمثيل الغذائي لها حساسة للتغيرات البيئية وأنها تتفاعل بسرعة أكبرللضغوطات 10. A. يجب أن تكون مثقفة المكسيكي في النظم المائية في ظل ظروف منظمة بعناية من تدفق المياه، درجة الحموضة، الموصلية، الضغط التناضحي، والإضاءة، ودرجات حرارة المياه.
في مختبر جيفري، يتم الحفاظ على الأسماك في نظامين للمياه الجارية: (1) "نظام الطفل" للأسماك البالغة الصغيرة قبل النضج الجنسي و (2) نظام الكبار (أو الرئيسي) للبالغين الناضجين جنسيا. ويتكون "نظام الأطفال" من خزانات 8 لتر و 15 لتر مزودة بالمياه الجارية. يتم زرع "نظام الطفل" عن طريق الزريعة والأحداث الشباب المتحولين الذين يزرعون من اليرقات في خزانات أصغر (1-10 لتر) ، حيث يتم تبادل المياه أسبوعيا. تعتمد اليرقات والقلي والأحداث بشكل كبير على الطعام ويجب إطعامهم طعاما حيا (جمبري ملحي) مرة واحدة في اليوم لضمان معدل عال من البقاء على قيد الحياة. ويوضع الأحداث الصغار من "نظام الأطفال" في نظام البالغين بعد حوالي سنة إلى 1.5 سنة. في البداية ، يتم إطعامهم رقائق رباعية المسحوق ، وبعد مزيد من النمو يتم نقلهم إلى نظام تغذية البالغين العادي. ويمكن تقييم النضج الجنسي من خلال حجم البطن في الإناث، وقد وصفت أساليب لتحديد الجنس11. في نظام البالغين، يتم تبادل المياه تلقائيا في 42 خزان لتر 3 مرات لكل 24 ساعة. يتم مراقبة نظام البالغين يوميا من خلال الفحص البصري ودرجة الحرارة التلقائية ودرجة الحموضة وقراءات التوصيلية من المسابير. درجة الحموضة المثلى حوالي 7.4 ويمكن أن تتراوح بين 6.8-7.5، ودرجة الحرارة الأساسية للنظام هو 72/73 درجة فهرنهايت، والموصلية المثالية تتراوح بين 600-800 متر. يتم إجراء فحوصات مستقلة على جودة المياه أسبوعيا من خلال اختبار درجة الحرارة وقياس معايير جودة المياه لhh والأمونيا والنترات باستخدام اختبار colorimetric. يتم الاحتفاظ مستويات الأمونيا والنترات عند أو بالقرب من الصفر بإضافة البكتيريا المفيدة (مثل، دورة نوتافين) إلى النظام. يتم التحكم في إضاءة الغرفة بواسطة مؤقت يتم ضبطه على فترات ضوئية مدتها 14 ساعة و10 ساعات مظلمة. بالإضافة إلى معايير جودة المياه الشاملة المذكورة أعلاه، فإن الاعتبارات التالية تحتاج إلى اهتمام خاص خلال أسبوع التربية.
الاعتبار الأول هو photoperiod ، والأسماك (حتى الأسماك كهف في المختبر) تعتمد على دورات الضوء لضبط الساعة circadian بهم. يمكن أن تؤثر الإيقاعات الإيقاعية على كل شيء من التربية والتغذية إلى صحة الجهاز المناعي12و13 ويجب أن تكون متسقة لتحقيق أقصى قدر من الفوائد الصحية. يتم الحفاظ على الأسماك في نظام المياه الجارية على ضوء 14 ساعة و 10 ساعة ضوئية داكنة. تبدأ الأسماك السطحية بشكل عام في التفريخ بعد ساعة من سواد النظام ، ويمكن للضوء الذي تم إدخاله خلال هذه الفترة أن يتداخل مع التفريخ وينهيه. تفريخ أسماك الكهوف العمياء أقل إزعاجا من الضوء. وبالمقارنة مع تفريخ الأسماك السطحية، يتأخر تفريخ أسماك الكهوف، وعادة ما يبدأ بعد أربع إلى خمس ساعات من سواد النظام.
والاعتبار الثاني هو التغذية. وعادة ما تتغذى الأسماك البالغة اتباع نظام غذائي من رقائق رباعية مرة واحدة في اليوم. قبل التفريخ، يتم تغذية الأسماك بنظام غذائي غني بالبروتين تكمله كميات إضافية من رقائق رباعية وغيرها من المواد الغذائية: رقائق صفار البيض والديدان السوداء كاليفورنيا الذين يعيشون في بعض الأحيان(Lumbriculus variegatus)للتعويض عن فقدان البروتين بسبب إنتاج البيض خلال دورة التفريخ السابقة. خلال أسبوع التربية، يتم تغذية الأسماك مرتين في اليوم، مرة في الصباح ومرة أخرى في فترة ما بعد الظهر / المساء. وينبغي تجنب تغذية الأسماك مرة واحدة فقط في اليوم ولكن مع جزء واحد كبير جدا من الغذاء، لأن هذا يمكن أن يسبب سوء التغذية14.
الاعتبار الثالث هو الفضاء. وتستند متطلبات الفضاء على متوسط كتلة الجسم من الكبار، فضلا عن الاعتبارات السلوكية، مثل ما إذا كان الأسماك لديها سلوك التعليم أو السلوك العدواني. يمكن أن تؤدي الدبابات المفرطة أو الناقصة إلى زيادة العدوان والإجهاد المستمر ، مما يجعل الأسماك عرضة للإصابة من زملائها في الدبابات ومترددة في المشاركة في تفريخ15. نحن عادة منزل 10-20 الأسماك لكل خزان 42 لتر.
النظر الرابع هو درجة الحرارة. كما ذكر أعلاه، الأسماك بدم بارد وتعتمد على البيئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. لأن درجة الحرارة لها تأثير مباشر على عمليات التمثيل الغذائي، يمكن أن تؤدي التغيرات في درجة الحرارة إلى تغييرات سلوكية في الأسماك16. يتكون برنامج التربية هذا من دورات لمدة أسبوعين في درجة الحرارة: الأسبوع الأول يدخل ارتفاع درجة الحرارة إلى 78 درجة فهرنهايت ، ويحافظ الأسبوع التالي على درجة حرارة ثابتة تبلغ 72 درجة فهرنهايت. خلال الأسبوع الأول (التربية) ، يتم وضع شبكات التربية ذات الحواف البلاستيكية في الجزء السفلي من الخزانات كل مساء. وتستخدم شباك التربية كحاجز بين الأسماك الموجودة في الخزانات والبيض المفرخ، الذي كان سيستهلك لولا ذلك. يتم رفع درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت في اليوم إلى 78 درجة فهرنهايت كحد أقصى بحلول منتصف الأسبوع ، ويتم تحريض التفريخ وفقا لدورة الضوء في أول 2-3 أمسيات من هذا الأسبوع. ثم يتم تخفيض درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام المتبقية من الأسبوع، ويتم الحفاظ على درجة الحرارة الأساسية حتى بداية أسبوع التكاثر التالي. وعادة ما يتم تحفيز تربية ما لا يزيد عن مرتين في الشهر للسماح للأسماك الوقت لاسترداد.
وعموما، تسمح هذه الطريقة بتكاثر كميات كبيرة من الأجنة عالية الجودة على مدى فترة زمنية أطول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وقد تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوان من جامعة ميريلاند، كوليدج بارك (حاليا IACUC 469 #R-NOV-18-59؛ المشروع 1241065-1).

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 التقويمات خلال أسبوع التكاثر وأسبوع غير التكاثر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. الاثنين
2. الثلاثاء
3. الأربعاء
4. الخميس
5. الجمعة
6. السبت
7. الأحد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نحن عموما تولد وتفرخ أحفاد الأسماك السطحية التي تم جمعها أصلا في Nacimiento ديل ريو تشوي في سان لويس بوتوسي، المكسيك (أسماك سطح ريو تشوي) وسان سولومون سبرينغز في حديقة ولاية بالمورهيا، تكساس (أسماك سطح تكساس) وأسماك الكهوف المستمدة من كويفا دي إل باشون (أسماك كهف باشون) في تاماوليباس، المكسيك، وكويفا دي لوس سابينوس (أسماك كهف لوس سابينوس) وسوتانو دي لا تيناجا (أسماك كهف تيناخا) في سان لويس بوتوسي المكسيك.
طوال أسبوع التربية، يتم جمع البيانات لمختلف الدبابات. لوحظ الأجنة التي ولدت في كل دبابة ل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
Astyanax mexicanus هو نموذج بيولوجي جديد يولد بشكل متكرر ويمكن تربيته بسهولة في المختبر1،2. ولأننا مهتمون بالآليات التنموية التي تكمن وراء التغيرات التطورية في أسماك كهف أ. المكسيكية، فإن إنتاج واستخدام الأجنة أمر حيوي لأهدافنا البحثية. والغرض الرئيسي من الحفاظ على مخزون بالغ من الأسماك هو إنتاج الأجنة والقلي الصغير لاستخدامه في التجارب التنموية وتجديد مخزونات تربية البالغين. في بعض الأحيان، يمكن استخدام البالغين أيضا في إجراء التجارب الفسيولوجي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
نشكر ديفيد مارتاسيان، ديدري هيسر، إيمي باركهورست، كريغ فوت، وماندي نغ على المساهمات القيمة في مختبر جيفري A. mexicanus مرفق الثقافة. ويدعم البحث في مختبر جيفري حاليا من قبل المعاهد القومية للصحة منحة EY024941.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الديدان السوداء المائية | الشرقية ، لانكستر ، بنسلفانيا | لا شيء | |
| شبكات تربية بيض | المصنوع | ||
| AquaCave Lake Forest ، IL. | لا شيء | ||
| طقم اختبار قياس الألوان | Petco | SKU:11916 | API مجموعة اختبار الأس الهيدروجيني للمياه العذبة |
| رقائق صفار البيض | Pentair ، Minneapolis ، MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological | Supply 741004 | أطباق الثقافة ، 4.5 بوصة ، 250 مل |
| شباك محمولة باليد أي | متجر | ||
| للأجنة | فيشر Scientific | 51-029-321HPM | 405 لتر |
| أملاح البحر الفورية | للمحيطات Spectrum Brands ، Blacksburg ، VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 بوصة. |
| محلول النقع الصافي | أي متجر | ||
| دورة Nutrafin أمازون | لا شيء | ثلاجة تعزيز بكتيرية | |
| للتغذية الحية | أي مصدر | ||
| مجهر مجسم | أي مصدر | ||
| ميزان حرارة | أي مصدر | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands ، Blacksburg ، VA | None |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن