نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) المتأصلة في أجهزة الاستشعار المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) ، كان قياس إشارات cAMP صعبا ، خاصة في ثلاثة أبعاد مكانية. هنا، نقوم بوصف منهجية التصوير والتحليل فائقة الطيفية FRET التي تسمح بقياس توزيع cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Cyclic AMP هو رسول الثاني الذي يشارك في مجموعة واسعة من الأنشطة الخلوية والفسيولوجية. تشير العديد من الدراسات إلى أن إشارات cAMP مجزأة ، وأن التقسيم يساهم في خصوصية الإشارات داخل مسار إشارات cAMP. وقد عزز تطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية القائمة على نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) القدرة على قياس وتصور إشارات cAMP في الخلايا. غير أن هذه القياسات كثيرا ما تقتصر على بعدين مكانيين، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير للبيانات. وحتى الآن، لم تكن هناك سوى قياسات محدودة جدا لإشارات CAMP في ثلاثة أبعاد مكانية (س، ص، وz)، وذلك بسبب القيود التقنية في استخدام أجهزة استشعار FRET التي تظهر بطبيعتها نسبة إشارة منخفضة إلى ضوضاء (SNR). بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون أساليب التصوير التقليدية القائمة على الفلتر غير فعالة للقياس الدقيق لإشارات cAMP في المناطق شبه الخلوية المترجمة بسبب مجموعة من العوامل، بما في ذلك الكلام الطيفي المتقاطع، وقوة الإشارة المحدودة، والفلوروريشن التلقائي. للتغلب على هذه القيود والسماح باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET مع فلوروفورس متعددة ، قمنا بتطوير نهج التصوير والتحليل FRET الطيفية الفائقة التي توفر خصوصية طيفية لحساب كفاءات FRET والقدرة على فصل إشارات FRET الطيفية عن الفلورة التلقائية المحيرة و / أو الإشارات من تسميات فلورية إضافية. هنا، نقدم منهجية لتنفيذ التصوير FRET مفرط الطيفية، فضلا عن الحاجة إلى بناء مكتبة الطيفية المناسبة التي ليست أقل من المخ أو الإفراط في الاختزال لأداء التجهم الطيفي. بينما نقدم هذه المنهجية لقياس توزيعات CAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) ، يمكن استخدام هذه المنهجية لدراسة التوزيعات المكانية لل CAMP في مجموعة من أنواع الخلايا.
المقدمة
الأدينوسين الدوري أحادي الفوسفات (cAMP) هو رسول الثاني المشاركة في العمليات الخلوية والفسيولوجية الرئيسية بما في ذلك انقسام الخلايا، وتدفق الكالسيوم، ونسخ الجينات، ونقل الإشارات. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى وجود مقصورات cAMP في الخلية التي من خلالها يتم تحقيقخصوصيةالإشارات 1 ،2،3،4،5،6،7. حتى وقت قريب، تم الاستدلال على تجزئة cAMP على أساس تأثيرات فسيولوجية أو خلوية متميزة ناجمة عن ناهضات مستقبلات G-coupled المختلفة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع هذا البروتوكول الإجراءات التي وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة جنوب ألاباما.
1. إعداد الخلية والعينة والكواشف للتصوير
- عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية للفئران (PMVECs) كما هو موضح سابقا35.
ملاحظة: تم عزل الخلايا واستزراعها من قبل نواة ثقافة الخلية في جامعة جنوب ألاباما، موبايل، AL على أطباق ثقافة الخلية عيار 100 ملم. - البذور PMVECs معزولة على 25 ملم يغطي الزجاج جولة والسماح لهم بالنمو في الحاضنة في 37 درجة مئوية حتى الخلايا تحقيق ما لا يقل عن 80٪ التقاء (على الأقل 24 ساعة).
ملاحظة: قد تختلف الخلايا ونوع الخلية من دراسة إلى أخرى، وبالتالي يجب ات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول استخدام نهج التصوير والتحليل فائق الطيفية FRET لقياس تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية في الخلايا الحية. وهناك عدة خطوات رئيسية في تحقيق هذه النتائج، يلزم إيلاء اهتمام دقيق لها أثناء تحليل البيانات وقياسها كميا. وتشمل هذه الخطوات الرئيسية بناء مكتبة طيفية مناسبة، وطيافات خلفية، وتحديد عتبات لتحديد حدود الخلايا، وحسابات كفاءة FRET. يوضح الشكل 1 التدفق التخطيطي لجميع الخطوات التي ينطوي عليها قياس كفاءة FRET ومستويات CAMP في الخلايا الحية. وعند تنفيذ خطوات التصوير والتحليل هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد سمح تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية FRET قياس وتصور إشارات النيوكليوتيدات الدورية في خلايا واحدة، وهناك وعد كبير لتصور الأحداث الإشارات دون الخلوية13،22،37،38. ومع ذلك ، فإن استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET يمثل العديد من القيود ، بما في ذلك خصائص الإشارة المنخفضة إلى الضوضاء للعديد من مراسلي FRET القائمين على البروتين الفلوري وضعف كفاءة العدوى أو التعبير لمراسلي FRET (قد يكون هذا تحديا خ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الدكتوران ليفسلي وريتش يكشفان عن اهتمامهما المالي بشركة ناشئة، SpectraCyte، ذ.م.م، التي تم تشكيلها لتسويق تقنيات التصوير الطيفي. ومع ذلك، تم إجراء جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول باستخدام المنتجات المتاحة تجاريا غير المرتبطة SpectraCyte، ذ م م.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن نعترف الدكتور كيس Jalink (معهد السرطان الهولندي ومركز فان ليوينهوك للمجهر المتقدم ، أمستردام ، هولندا) لتزويدنا H188 cAMP FRET الاستشعار البيولوجي وكيني ترينه (كلية الهندسة ، جامعة جنوب ألاباما) للمساعدة التقنية في الحد من الوقت الذي استغرقه لتشغيل العرف لدينا وضعت البرامج النصية.
ويود المؤلفون أن يعترفوا بمصادر التمويل: رابطة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة العلوم الوطنية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم( 160004). (1725937) المعاهد القومية للصحة، S100D020149، S10RR027535، R01HL058506، P01HL066299).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
يحتوي Institute الغطاء من نيكون A1R NIST المضادات الحيوية شرائح مسبقا
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor على غرف خلايا فولاذية وحلقة مطاطية O. غرفة الخلية تحمل الغطاء وتوفر الحلقة O آلية قفل لعقد العازلة في غرفة الخلية مع تسرب |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | فيشر Scientific | BP231-100 | المذيب المستخدم لإعداد محلول المخزون فورسكولين. |
| DRAQ5 محلول مسبار الفلورسنت | Thermo Scientific | 62252 | الملصق النووي |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | يحتوي على العناصر الغذائية وعوامل النمو للخلايا لتنمو وتنقسم في أطباق الاستزراع. |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | سيجما | F6178 | إمداد عامل النمو الذي يضاف إلى وسط الاستزراع, DMEM |
| فورسكولين | سيجما | F3917 | أدينيلي سيكلاز المنشط. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute ، Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid الذي يشفر الفيروز (فلوروفور المانح) ، كوكب الزهرة (فلوروفور المتقبل) ، ومجال الربط الذي تم الحصول عليه من Epac. |
| Image J | image.net | تحميل مجاني | منصة أخرى لمعالجة الصور تستخدم لتوسيع المعلومات الطيفية ومعالجة الصور. |
| دمج بصريات المحيط الكروي | FOIS-1 | تستخدم لقياس شدة إضاءة خط الليزر بكثافة ليزر مختلفة (؟). | |
| بروتين الفأر اللامينين ، | الطبيعي Invitrogen | 23017-015 | مغلفة باللامينين وهذا يساعد في ارتباط الخلايا ونموها وحركتها. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | كاشف التعداء المستخدم لنقل الخلايا باستخدام المستشعر الحيوي H188 FRET |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | يتم تنفيذ عمليات معالجة الصور (فك الخلط الخطي وحسابات كفاءة FRET) عن طريق كتابة برامج مخصصة في بيئة برمجة MATLAB |
| مجهر متحد البؤر نيكون A1R | نيكون إنسترومنتومنتس | نيكون نيكون A1R | يتم الحصول على الصور الطيفية باستخدام المجهر متحد البؤر. |
| برنامج عناصر نيكون | دونجل برنامج | نيكون للأدوات | يستخدم لتصدير ومعالجة ملفات صور nd2 (ملفات الصور متعددة الأبعاد) التي يتم الحصول عليها باستخدام مصباح |
| المعايرة القابل للتتبع | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | مصباح ذو طيف معروف للاستخدام كمعيار |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly يستخدم ثقافة |
| الخلايا المؤقتةالخلايا البطانية الرئوية للأوعية الدموية الدقيقة (PMVECs) | في المنزل - نواة زراعة الخلايا ، جامعة جنوب ألاباما | معزولة من الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية | للفئران تشكل PMVECs البطانة الداخلية للأوعية الدموية. |
| تضاف البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | Gibco | 15140-122 | إلى مزرعة medum لمنع تلوث الخلايا. |
| مجهر دقيقة منظفة | من الشرائح الصغيرة كلاي آدامز | 3010 | مجهر تستخدم لتثبيت الخلايا |
| إطالة وسائط تركيب الماس المضادة للتلاشي | Invitrogen | P36961 | إذا تم إصلاح العينات باستخدام حامل مضاد للبهتان ، فإن اللاحق يحمي الأصباغ الفلورية والكروموفورات من التلاشي. |
| مطياف | بصريات المحيطات | QE65000 | يستخدم لقياس الاستجابة الطيفية لمصدر الضوء (؟) |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) | Gibco | 25200-056 | يهضم رابطة البروتين والبروتين بين الخلية ومصفوفة الخلية ويساعد على تفكيك الخلايا ورفعها أثناء طلاء الخلايا. |
| Tyrodes Buffer | صنع داخليا يستخدم | المخزن المؤقت Tyrodes المصنوع داخليا لصنع حلول العمل والحفاظ على الخلايا في محلول مائي أثناء الحصول على الصور. | |
| 6 لوحة ثقافة خلية الآبار | Corning | 3506 | يتم وضع أغطية مطلية بطبقة Laminin في طبق ثقافة من 6 آبار (غطاء واحد / بئر). تضاف الخلايا مع الوسط إلى كل بئر. |
| 25 مم غطاء مجهر دائري زلات | Fisher Scientific | 12545102 | Cells نمت على أغطية زجاجية مستديرة |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X / 1.2 WI &infin ؛ / 0.15-0.18 WD 0.27 | الغمر في الماء والهدف الشائع الاستخدام للخلايا |
المراجع
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
