مقالة منهجية

قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)

2.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61720

⸱

أكتوبر 27, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

في هذه المقالة

ملخص

نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) المتأصلة في أجهزة الاستشعار المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) ، كان قياس إشارات cAMP صعبا ، خاصة في ثلاثة أبعاد مكانية. هنا، نقوم بوصف منهجية التصوير والتحليل فائقة الطيفية FRET التي تسمح بقياس توزيع cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية.

الملخص

Cyclic AMP هو رسول الثاني الذي يشارك في مجموعة واسعة من الأنشطة الخلوية والفسيولوجية. تشير العديد من الدراسات إلى أن إشارات cAMP مجزأة ، وأن التقسيم يساهم في خصوصية الإشارات داخل مسار إشارات cAMP. وقد عزز تطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية القائمة على نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) القدرة على قياس وتصور إشارات cAMP في الخلايا. غير أن هذه القياسات كثيرا ما تقتصر على بعدين مكانيين، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير للبيانات. وحتى الآن، لم تكن هناك سوى قياسات محدودة جدا لإشارات CAMP في ثلاثة أبعاد مكانية (س، ص، وz)، وذلك بسبب القيود التقنية في استخدام أجهزة استشعار FRET التي تظهر بطبيعتها نسبة إشارة منخفضة إلى ضوضاء (SNR). بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون أساليب التصوير التقليدية القائمة على الفلتر غير فعالة للقياس الدقيق لإشارات cAMP في المناطق شبه الخلوية المترجمة بسبب مجموعة من العوامل، بما في ذلك الكلام الطيفي المتقاطع، وقوة الإشارة المحدودة، والفلوروريشن التلقائي. للتغلب على هذه القيود والسماح باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET مع فلوروفورس متعددة ، قمنا بتطوير نهج التصوير والتحليل FRET الطيفية الفائقة التي توفر خصوصية طيفية لحساب كفاءات FRET والقدرة على فصل إشارات FRET الطيفية عن الفلورة التلقائية المحيرة و / أو الإشارات من تسميات فلورية إضافية. هنا، نقدم منهجية لتنفيذ التصوير FRET مفرط الطيفية، فضلا عن الحاجة إلى بناء مكتبة الطيفية المناسبة التي ليست أقل من المخ أو الإفراط في الاختزال لأداء التجهم الطيفي. بينما نقدم هذه المنهجية لقياس توزيعات CAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) ، يمكن استخدام هذه المنهجية لدراسة التوزيعات المكانية لل CAMP في مجموعة من أنواع الخلايا.

المقدمة

الأدينوسين الدوري أحادي الفوسفات (cAMP) هو رسول الثاني المشاركة في العمليات الخلوية والفسيولوجية الرئيسية بما في ذلك انقسام الخلايا، وتدفق الكالسيوم، ونسخ الجينات، ونقل الإشارات. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى وجود مقصورات cAMP في الخلية التي من خلالها يتم تحقيقخصوصيةالإشارات 1 ،2،3،4،5،6،7. حتى وقت قريب، تم الاستدلال على تجزئة cAMP على أساس تأثيرات فسيولوجية أو خلوية متميزة ناجمة عن ناهضات مستقبلات G-coupled المختلفة8و9و10و11. وفي الآونة الأخيرة، قدمت مسابير التصوير الفلوري المستندة إلى FRET مقاربات جديدة للقياس المباشر وإشارات CAMP ومراقبتها فيالخلية 12و13و14.

Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هي ظاهرة المادية التي نقل الطاقة يحدث بين جزيئات المانحة والمقبل بطريقة غير إشعاعية عندما تكون الجزيئات على مقربة15،16. مع تطوير مؤشرات الفلورسنت FRET المستندة ، تم استخدام هذه الظاهرة الفيزيائية في التطبيقات البيولوجيةلدراسة التفاعلاتالبروتين البروتين 17 ، البروتين المشارك توطين18، كا+2 مما يشير إلى19، التعبير الجيني20، انقسام الخلية21 والإشارات النيوكليوتيدات الدورية. وتتكون مؤشرات CAMP المستندة إلى FRET عادة من مجال ربط CAMP ، وفلوروفوري مانح ، وفلوروفوري مقبول22. على سبيل المثال، يتكون مستشعر H188 cAMP12،22 المستخدم في هذه المنهجية من نطاق ربط cAMP تم الحصول عليه من Epac ، يقع بين الفلوروفوريس الفيروزي (المانح) والزهرة (المقبول). في الظروف القاعدية (غير منضم)، الفيروز والزهرة في اتجاه مثل هذا FRET يحدث بين الفلوروفوريس. عند ربط cAMP بمجال الربط ، يحدث تغيير تشكيلي بحيث ينفصل الفيروز والزهرة مما يؤدي إلى انخفاض في FRET.

تقدم أساليب التصوير المستندة إلى FRET أداة واعدة للتحقيق في إشارات cAMP وتصورها داخل الخلية. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير المجهري الحالية القائمة على FRET غالبا ما تكون ناجحة جزئيا فقط في تحقيق قوة إشارة كافية لقياس FRET مع الوضوح المكاني دون الخلوي. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، بما في ذلك قوة الإشارة المحدودة للعديد من مراسلي FRET، والمستوى العالي من الدقة المطلوبة لتحديد التغيرات بدقة في كفاءة FRET، ووجود عوامل محيرة، مثل الفلورة الذاتية الخلوية23،24. والنتيجة هي في كثير من الأحيان صورة FRET التي تعاني من ضعف SNR ، مما يجعل تصور التغيرات دون الخلوية في FRET صعبا للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء التحقيق في إشارات cAMP المترجمة مكانيا بشكل حصري تقريبا في بعدين مكانيين فقط ونادرا ما اعتبر توزيع cAMP المحوري25. وهذا على الأرجح لأن انخفاض SNR أعاق القدرة على قياس وتصور تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. للتغلب على القيود المفروضة على استخدام أجهزة استشعار FRET مع انخفاض SNR، قمنا بتنفيذ التصوير والتحليل hyperspectral النهج لقياس FRET في خلايا واحدة25،26،27.

تم تطوير نهج التصوير الطيفي الفائق من قبل وكالة ناسا للتمييز بين الأجسام الأرضية الموجودة في صور الأقمار الصناعية28،29. وقد ترجمت هذه التقنيات منذ ذلك الحين إلى مجال المجهر الفلوري30، مع العديد من أنظمة المجهر confocal التجارية التي تقدم كاشفات الطيفية. في التصوير الفلوري التقليدي (غير الطيفي)، تكون العينة متحمسة باستخدام فلتر تمرير النطاق أو خط ليزر، ويتم جمع الانبعاثات باستخدام فلتر تمرير النطاق الثاني، الذي يتم اختياره غالبا لتتناسب مع الطول الموجي لذروة الانبعاثات للفلوروفور (الفلوروفور). وعلى النقيض من ذلك، تسعى نهج التصوير الطيفي الفائق إلى أخذ عينات من ملف طيفي كامل إما لانبعاثات الفلورية26أو31أو32 أو الإثارة33و34 على فترات طول موجية محددة. في دراساتنا السابقة، أظهرنا أن التصوير والتحليل الطيفي المفرط يمكن أن يقدم كمية محسنة لإشارات FRET في الخلايا بالمقارنة مع تقنيات التصوير FRET التقليدية القائمة على التصفية26. هنا، نقدم منهجية لأداء التصوير والتحليل عالي الطيفية (x و y و z و λ) ثلاثي الأبعاد لقياس وتصور توزيعات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. وقد سمحت هذه النهج التصور من التدرجات المكانية cAMP الناجمة عن ناهض في خلايا واحدة25. ومن المثير للاهتمام، اعتمادا على ناهض، قد تكون التدرجات cAMP واضحة في الخلايا. وتستخدم المنهجية المعروضة هنا الطيس الطيفي للخلفية غير الموحدة والفلورة الذاتية الخلوية لتحسين دقة قياسات FRET. في حين يتم إثبات هذه المنهجية في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) باستخدام جهاز استشعار حيوي CAMP FRET ، يمكن بسهولة تعديل المنهجية لاستخدامها مع مراسلي FRET البديلين أو خطوط الخلايا البديلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع هذا البروتوكول الإجراءات التي وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة جنوب ألاباما.

1. إعداد الخلية والعينة والكواشف للتصوير

  1. عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية للفئران (PMVECs) كما هو موضح سابقا35.
    ملاحظة: تم عزل الخلايا واستزراعها من قبل نواة ثقافة الخلية في جامعة جنوب ألاباما، موبايل، AL على أطباق ثقافة الخلية عيار 100 ملم.
  2. البذور PMVECs معزولة على 25 ملم يغطي الزجاج جولة والسماح لهم بالنمو في الحاضنة في 37 درجة مئوية حتى الخلايا تحقيق ما لا يقل عن 80٪ التقاء (على الأقل 24 ساعة).
    ملاحظة: قد تختلف الخلايا ونوع الخلية من دراسة إلى أخرى، وبالتالي يجب اتباع إجراءات زراعة الخلايا الخاصة بالخلايا لزرع الخلايا وتنميتها. يتوفر بروتوكول زرع الخلايا وزراعة الخلايا المستخدم في هذه الدراسات كمعلومات تكميلية في الملف المسمى "الثقافة التكميلية File_Cell والإصابة".
  3. مركبات PMVECs عبر البراز مع جهاز استشعار حيوي FRET واحتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم أيضا وصف بروتوكول لأجهزة PMVECs transfect في ملف معلومات تكميلية المسمى "الثقافة File_Cell التكميلية و Transfection".
  4. في يوم التصوير، دافئة ترود العازلة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت لتيرود من 145 مليون م كل، 4 م م كل، 10 م م HEPES، 10 mM الجلوكوز، 1 م مكل2 و 1 م م كاكل2
  5. جبل غطاء يحتوي على خلايا مصابة في غرفة الخلية وتأمين الجزء العلوي مع طوقا تصاعد لمنع تسرب.
  6. مسح الجزء السفلي من غطاء باستخدام مسح مهمة حساسة لتنظيف أي وسائل الإعلام الزائدة أو الخلايا الملتصقة.
  7. إضافة 800 ميكرولتر من العازلة العمل و 4 ميكرولتر من التسمية النووية 5 MM إلى غرفة الخلية والصخور بلطف لمدة 5 - 10 ثانية.
    ملاحظة: عند إضافة حلول عازلة أو كاشفة إلى الأغطية المحملة في غرفة الخلية، تأكد من إضافة الحل برفق وعلى جانب غرفة الخلية حتى لا يتم إزاحة الخلايا الملتصقة. إضافة 4 ميكرولتر من التسمية النووية 5 MM إلى 800 ميكرولتر من العازلة يجعل تركيز 25 ميكرومتر النهائي للتسمية النووية. بالنسبة للخلايا الملتصقة بشكل فضفاض مثل خلايا HEK293 ، اخلط الملصق النووي والعازل في قارورة أولا ثم أضف إلى الأغطية المثبتة في غرفة الخلية. وهذا سوف يمنع رفع الخلايا قبالة غطاء.
  8. قم بتغطية غرفة الخلية بورق الألومنيوم للحماية من الضوء واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. إعداد الكاشف: إضافة 1 ميكرولتر من 50 م م فورسكولين إلى 199 ميكرولتر من العازلة. وهذا سوف ينتج تركيز النهائي من forskolin من 50 ميكرومتر عند إضافتها إلى الخلايا التي تم إعدادها مع 800 ميكرولتر من العازلة. 1 ميكرولتر من DMSO في 199 μL من العازلة ينبغي أيضا أن تكون مستعدة لاستخدامها كتحكم في السيارة.
    ملاحظة: في هذه الدراسات، يستخدم فورسكولين كمنشط سيكلاسي أدينييليل لتحفيز إنتاج cAMP. إذا رغبت في ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذه المنهجية للسماح بالعلاج مع الكواشف البديلة لتحفيز أو تثبيط سيكلاز أدينييل، فوسفوديستيراسيس، الخ.

2. الحصول على صورة

  1. استخدم مجهرا كونفوجال مجهزا بجهاز كشف طيفي.
    ملاحظة: تم تطوير جميع خطوات الحصول على الصور الموضحة هنا باستخدام نظام مجهر نيكون A1R المتاح تجاريا. قد تحتاج هذه الخطوات إلى تعديل إذا كنت تستخدم مجهر طيفي بديل. تأكد من تشغيل جميع المعدات قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء التجربة للوصول إلى ظروف تشغيل مستقرة.
  2. حدد هدف غمر المياه 60x وإضافة قطرة ماء إلى الهدف.
    ملاحظة: بالنسبة للتصوير بالخلايا الحية عالي الدقة، يوصى باستخدام هدف فتحة رقمية عالية. يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على معلومات حول الهدف المستخدم في هذه الدراسات.
  3. ضع غرفة الخلية المحملة (من الخطوة 1.7) على مرحلة المجهر.
  4. حدد مرشح DFT (DAPI/ FITC/TRITC) الذي تم تعيينه بضبط مقبض الفلتر على الجانب الأيمن من المجهر.
  5. تشغيل المجهر في وضع واسع النطاق الفلوري باستخدام العدسة لتحديد مجال الرؤية التي تحتوي على خلايا تعبر عن جهاز استشعار CAMP FRET.
    ملاحظة: تأكد من أن متوسط كثافة إشارة FRET عند الطول الموجي لذروة الانبعاثات المانحة أو المقبولة في الخلية المختارة هو 100 وحدة كثافة على الأقل (A.U.) أو 4X على الأقل إشارة خط الأساس لمنطقة بدون خلايا معبرة. ويمكن تأكيد ذلك باستخدام عارض ملف تعريف الطيف المتوفر في برنامج NIS Elements. عند البحث عن خلية ذات إشارة جيدة ، من المستحسن التخلص من الخلايا الساطعة بشكل مفرط (قد تتعرض للخطر).
  6. فتح برنامج NIS، والتحول إلى وضع confocal، وفتح زر الليزر المتشابكة وانقر على لايف.
  7. استخدام مقبض التركيز للتركيز على الخلايا من خلال النظر في المعاينة على الشاشة.
  8. تكوين إعدادات الجهاز والحصول على و z-المكدس في البرنامج، كما هو موضح أدناه.
  9. إعدادات الاستحواذ:
    ملاحظة: يمكن تطبيق إعدادات اقتناء الكاميرا والجهاز باستخدام صورة تم الحصول عليها مسبقا. افتح الصورة وانقر بزر الماوس الأيمن وحدد إعادة استخدام إعدادات الكاميرا.
    1. افتح قائمة إعدادات A1، وحدد المربعات المطابقة لخطوط الليزر 405 نانومتر و561 نانومتر، وحدد SD للكشف الطيفي، وحدد 10 للدقة و31 للقنوات.
      ملاحظة: تظهر قائمة إعدادات A1 كرمز تروس صغير في الزاوية العلوية اليسرى من إطار إعدادات A1 Plus. يستخدم الليزر 405 نانومتر لإثارة المانحة ويستخدم الليزر 561 نانومتر لإثارة التسمية النووية.
    2. تعيين نطاق الطول الموجي (410 - 730 نانومتر) عن طريق تحديد قيم الطول الموجي للبدء والنهاية.
    3. انقر فوق رمز binning/skip في قائمة إعدادات A1 وحدد المربع المرقم 15، ثم انقر فوق موافق في قائمة إعدادات A1.
      ملاحظة: هذا هو لإزالة قناة الطول الموجي الذي يتوافق مع الليزر 561 نانومتر الإثارة (وهذا هو عادة قناة الطول الموجي 15). من المهم عدم استخدام هذا النطاق الطول الموجي لتجنب إشارة منخفضة اصطناعيا ، والتي يمكن أن تخلق قطعة أثرية طيفية. الإشارة أقل في هذا النطاق بسبب الإصبع الميكانيكي الذي يغطي عنصر الكاشف لحمايته من تلف الليزر.
    4. تعيين كثافة الليزر إلى 8٪ و 2٪ لليزر 405 نانومتر و 561 نانومتر، على التوالي، سي HV (كسب كاشف) في 149، ونصف قطرها ثقب من 2.4 وحدات القرص متجدد الهواء (الاتحاد الافريقي).
      ملاحظة: قد يلزم تعديل كثافة الليزر اعتمادا على عمر الجهاز وحالة الليزر. إذا كان ضبط كثافة الليزر بين عينات مختلفة أو مجموعات تجريبية، فمن المهم للحفاظ على نفس النسبة من كثافة الليزر (على سبيل المثال، 8:2). بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تحديد كثافة الليزر التي ليست مشرقة بحيث تخلق photobleaching السريع. يجب تعديل كسب الكاشف لزيادة كثافة الإشارة مع تقليل ضوضاء الكاشف. لهذه الدراسات، تم استخدام مكسب من 149. تم اختيار حجم الثقب من 2.4 الاتحاد الافريقي كتوازن بين الحصول على الصور مع إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء (SNR) والحفاظ على المقاطع البصرية (confocality). زيادة في حجم الثقب يزيد SNR ولكن يقلل من الكونفكاليتي.
    5. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 0.25 إطارات الطيفية في الثانية، حدد الرمز المقابلة أحادي الاتجاه للمسح اتجاه، أدخل 4 للعد، وتعيين 1024 × 1024 لحجم المسح الضوئي.
      ملاحظة: إشارات FRET ضعيفة، وغالبا ما تكون سرعة المسح بطيئة مطلوبة. باستخدام سرعة المسح الضوئي من 0.25 ، واكتملت الحصول على الطيفية z - كومة في ~ 3 دقائق. يمكن زيادة سرعة المسح الضوئي أو تقليلها اعتمادا على الفلوروفوريس المستخدم. على سبيل المثال، بالنسبة للفلوروفورات الأكثر سطوعا مثل eGFP، يمكن استخدام سرعة مسح أسرع (إطاران/ثانية). الرقم الذي تم إدخاله تحت العد يتوافق مع قيمة متوسط الإطار 4 ، مما يساعد في تقليل الضوضاء أثناء الحصول على الصورة. بالنسبة للعينات المستقرة جدا وحيث الوقت ليس قيدا ، يمكن استخدام قيم متوسط أعلى (تصل إلى 16) للحصول على صور مع تحسين SNR.
  10. تعريف معلمات اكتساب z-stack:
    ملاحظة: قد تحتاج القيم المدخلة في الخطوات 2.10 إلى تعديل لاستيعاب التغييرات في ربط التسمية الفلورية أو تركيزها، ونوع التسمية، وعدد التسميات المستخدمة، وخط الخلية، والتغييرات الأخرى في إعداد العينة التي قد تؤثر على كثافة وضع العلامات على الخلايا و/أو الفلورة الذاتية الخلوية. عند ضبط معلمات الاستحواذ، ينبغي توخي الحذر لتحقيق خدمة SNR كافية مع تقليل الbleaching الضوئي. بالإضافة إلى ذلك، عند تكوين المقايسة الطيفية FRET، ينبغي توخي الحذر لضمان أن المعلمات تعمل بشكل جيد عبر جميع مجموعات العلاج. من المستحسن تشغيل تجربة لكل مجموعة علاج مع إعدادات المعلمة المقترحة لضمان أن SNR كافية وتقليل الbleaching الضوئي.
    1. افتح نافذة الاستحواذ على ND بالنقر فوق عرض التحكم في الاستحواذ → → اكتساب ND.
    2. أدخل المسار/الوجهة واسم ملف لحفظ الملف ND على الإطار المنبثق.
    3. حدد المربع المطابق لسلسلة z.
    4. انقر على العيش في نافذة إعدادات A1 زائد. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة عرض مباشرة.
    5. ضبط مقبض التركيز على المجهر لتحديد الجزء العلوي من الخلية وانقر فوق الأعلى في إطار اكتساب ND لتعيين الموضع الحالي كأعلى.
      ملاحظة: يقترح التركيز قليلا فوق الجزء العلوي من الخلية للتأكد من أن كافة الخلية يتم أخذ عينات في سلسلة z.
    6. ضبط مقبض التركيز على المجهر لتحديد الجزء السفلي من الخلية وانقر على أسفل في إطار اكتساب ND لتعيين الموقف الحالي كما في الجزء السفلي.
      ملاحظة: التركيز قليلا أسفل أسفل الخلية للتأكد من أن يتم أخذ عينات من كافة الخلية.
    7. أدخل 1 ميكرومتر لحجم الخطوة، وحدد الجزء العلوي السفلي للاتجاه z-المسح الضوئي وانقر فوق تشغيل على إطار اكتساب ND للحصول على z-كومة.
      ملاحظة: يحدد حجم الخطوة عدد شرائح z التي سيتم الحصول عليها اعتمادا على المواقع العلوية والسفلية (أي المسافة المقطوعة). تم اختيار حجم خطوة 1 ميكرومتر كحل وسط بين سرعة التصوير وأخذ عينات محور z وbleaching. باستخدام قطر الثقب confocal من 2.4 الاتحاد الافريقي والهدف 60x الغمر المياه أدى إلى سمك المقطع البصري من 1.73 ميكرومتر. وبالتالي، فإن حجم خطوة 1 ميكرومتر أقل قليلا من معايير أخذ العينات Nyquist، ولكن هذا هو الحل الوسط الذي تم إجراؤه لتقليل الوقت اللازم للحصول على z-كومة. بالنسبة للعينات المستقرة جدا، والتي لا تعتبر السرعة حرجة بالنسبة لها، يمكن استخدام خطوة أصغر من محور z وربما قطر ثقب كونفوج أصغر لزيادة دقة المحور z. يجب أن يؤدي الجزء السفلي العلوي إلى نتائج مماثلة ويمكن استخدامه لتقييم أي آثار للbleaching الضوئية التي قد تحدث أثناء الفحص z.
  11. إعداد نظام التركيز المثالي (PFS) إذا كان متوفرا:
    ملاحظة: يسمح PFS للنظام بالتعويض عن التقلبات في العمق البؤري أثناء الحصول على الصورة. قد يتم استخدام الخطوات التالية لإعداد PFS، وقد تختلف هذه الخطوات قليلا استنادا إلى إصدار نيكون A1R وإصدار NIS Elements المستخدم.
    1. تمييز الوضع المتماثل المعرف بواسطة رمز النطاق في إطار اكتساب ND.
    2. قم بتشغيل زر PFS على الوجه الأمامي للمجهر (تأكد من أن مقبض المرآة الديكهروي الموجود في القسم أسفل مرحلة العينة هو 'في').
    3. أعد تعريف الجزء العلوي (تدوير عكس عقارب الساعة) والسفلي (تدوير باتجاه عقارب الساعة) باستخدام المقبض على الوجه الأمامي لوحدة تحكم إزاحة PFS.
    4. تعريف نسبي z-position/z-العمق بالنقر فوق 'النسبي' على إطار اكتساب ND.
    5. انقر فوق الذاكرة على الوجه الأمامي للمجهر بحيث يحفظ البرنامج عمق z النسبي.
  12. بعد اكتمال عملية الاستحواذ على z-stack، أضف الكاشف المطلوب برفق (forskolin أو التحكم في السيارة) باستخدام ماصة وانتظر لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إضافة الكاشف بلطف شديد حتى لا تزعج الخلايا أو تحريك موضع غرفة الخلية داخل المجهر XY المرحلة; من المفيد التحقق في عرض مباشر لاحق أو صورة من أن حقل الرؤية لم يتغير أثناء إضافة الكاشف. وقت الانتظار لمدة 10 دقائق هو لعلاج فورسكولين حيز التنفيذ. إذا تم استخدام علاج بديل، قد تحتاج إلى تعديل وقت الانتظار.
  13. بعد 10 دقائق تغيير اسم الملف ثم انقر فوق تشغيل في إطار الحصول على ND.
  14. كرر الخطوات 2.11 - 2.13 كما هو موضح أعلاه لما لا يقل عن 5 يغطي الأغطية وذلك لتحقيق نتائج كافية للتحليل الإحصائي (ن = 5 لكل مجموعة العلاج - فورسكولين والتحكم في السيارة).
  15. إعداد عينات وعينات فارغة لبناء المكتبة الطيفية والحصول على صور طيفية باستخدام إعدادات اقتناء مماثلة كما هو موضح في الخطوتين 2-9 و 2-10.

3. تحليل الصور

ملاحظة: سيتم استخدام هذه الصور لبناء مكتبة طيفية تحتوي على الأطياف النقية لجميع أعضاء النهاية الفردية الموجودة في الدراسة. قد تختلف الأعضاء النهائية في المكتبة الطيفية من دراسة إلى أخرى إذا تم استخدام الفلوروفوريس المختلفة. 10- وترد إجراءات مفصلة لبناء المكتبة الطيفية في ملف معلومات تكميلي يسمى "مكتبة File_Spectral التكميلية". هنا، نقوم بوصف تصدير البيانات إلى ملفات .tiff، والطياف الطيفي الخطي، وقياسات كفاءة FRET، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وتقدير مستويات cAMP. يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام أنظمة تحليل وبرمجة مختلفة للصور مثل ImageJ أو Python أو MATLAB أو CellProfiler. في هذه الدراسات، تم استخدام نصوص MATLAB.

  1. تصدير بيانات الصور:
    1. إنشاء مجلدات جديدة بنفس اسم الملف المطابق للصور الطيفية z-المكدس المكتسبة في الخطوتين 2.13 و 2.14.
      ملاحظة: الخطوات التالية الموضحة لتصدير البيانات محددة ل NIS عناصر AR الإصدار 4.30.01. قد تختلف هذه الخطوات قليلا استنادا إلى إصدار البرنامج.
    2. انقر فوق ملف، الذي سيفتح نافذة ملف. تصفح وحدد ملف الصورة الطيفية المكتسبة في الخطوة 2.12 وانقر فوق فتح.
    3. بمجرد تحميل الملف، انقر فوق ملف→ استيراد/تصدير→ تصدير مستند ND.
    4. في النافذة المنبثقة: استعرض وحدد المجلد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.1، وحدد تنسيق الصورة المعلمة (TIF) لنوع الملف، ثم حدد صورة أحادية لكل قناة والحفاظ على عمق البت.
      ملاحظة: سيتم إنشاء بادئة الملف مسبقا; تغيير هذه القيمة من أجل الراحة. سيتغير ترتيب الفهرس اعتمادا على القنوات المحددة، ويجب أن يعرض "z, c" للفهرسة وفقا لموقع شريحة z أولا ورقم النطاق الطول الموجي الثاني. تأكد من أن المربعات المطابقة لتطبيق LUTs أو إدراج تراكبات أو استخدام أسماء النقاط غير محددة.
    5. انقر فوق تصدير لتصدير ملفات tiff إلى مجلد وجهة كملفات tiff الفردية.
    6. كرر الخطوات 3.1.2 - 3.1.5 لتصدير ملفات الصور الطيفية المكتسبة في الخطوة 2.13.
  2. الطيز الطيفي الخطي:
    1. افتح برنامج البرمجة.
      ملاحظة: يتم توفير مخصص النصي البرمجة المتقدمة إلى الصور الطيفية الخام unmix على جامعة جنوب ألاباما بيوماينج وموقع BioSystems، تحت علامة التبويب الموارد (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. افتح الملف المسمى "خطي Unmixing.m" وانقر فوق زر التشغيل في شريط أدوات المحرر.
    3. استعرض وحدد المجلد الذي يحتوي على تسلسل الملف *.tif المصدر الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج NIS Elements.
    4. انقر فوق موافق للمتابعة، والتي ستفتح نافذة جديدة تسمى الطول الموجي و Z-شريحة.
    5. نسخ اسم الملف الأول (بدون شريحة z ورقم القناة) في المجلد المحدد في الخطوة 3.2.4 ولصقه في الخطوة الأولى من مربع الحوار المسمى "أدخل اسم الصورة".
    6. أدخل عدد القنوات في الخطوة الثانية المسماة "أدخل عدد نطاقات الطول الموجي"، وعدد شرائح z في الخطوة الثالثة المسماة "أدخل عدد شرائح Z" وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: قد يتغير عدد نطاقات الأطوال الموجية إذا تم إجراء تغييرات على إعدادات الامتلاك، مثل ضبط نطاق الطول الموجي أو حجم خطوة الطول الموجي. قد يتغير عدد شرائح Z أيضا اعتمادا على ارتفاع الخلية.
    7. تصفح وحدد ملف الطول الموجي المسمى "Wavelength.mat" في النافذة المنبثقة المسماة "حدد ملف معلومات الطول الموجي" وانقر فوق فتح.
    8. استعرض وحدد ملف "Library.mat" في النافذة المنبثقة الجديدة المسماة "حدد ملف المكتبة الطيفية"، وانقر فوق فتح وانتظر حتى يتم الانتهاء من إلغاء تقسيم الشرائح.
      ملاحظة: ملف Library.mat هو ملف يحتوي على أطياف نقية لكل فلوروفوري عضو نهاية مع الفلورورسينس الخلية والتوقيعات الطيفية الخلفية. في هذه الحالة، تشمل الفلوروفوريس الأعضاء النهائية الفيروز والزهرة وDRAQ5. وتشمل التوقيعات الطيفية الخلفية الفلورة الخلوية أو المصفوفة، وفلورة الأغطية، والحيود coverslip. ملف Wavelength.mat هو ملف يحتوي على معلومات قناة الطول الموجي المستخدمة للحصول على الصورة الطيفية. يتوفر ملف مكتبة مثال وملف الطول الموجي على موقع الويب الخاص بالتمييم الحيوي والنظم الحيوية (انظر الملاحظة تحت 3.2.1). لمزيد من المعلومات حول كيفية إنشاء مكتبة طيفية وملفات الطول الموجي، راجع ملف معلومات تكميلية باسم "مكتبة File_Spectral التكميلية". سيتم حفظ الصور غير المهولة المقابلة لكل شريحة z في المجلد المسمى "Unmixed" الذي تم إنشاؤه أثناء عملية الدمج داخل المجلد الذي تم تحديده في الخطوة 3.2.3.
  3. حساب الكفاءة FRET:
    1. افتح البرنامج النصي البرمجي المسمى "multiFRRCF.m" وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: يتوفر ملف البرمجة هذا من موقع جامعة جنوب ألاباما للتصوير الحيوي والنظم الحيوية (انظر الملاحظة تحت الخطوة 3.2.1).
    2. أدخل عدد التجارب التجريبية لتحليلها في مربع الحوار المنبثق المسمى "كم عدد المجلدات التي يجب إعادة تشريحها" وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يجب حفظ بيانات الصورة من كل تجربة في مجلد صورة غير مطلق منفصل. تسمح هذه الخطوة ببساطة رمز التحليل حلقة عبر العديد من المجلدات كخطوة توفير الوقت.
    3. تصفح وحدد المجلد (المجلدين) غير المهولين وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يعتمد عدد المرات التي يفتح إطار منبثق "استعراض للمجلد" على الرقم الذي تم إدخاله في مربع الحوار "كم عدد المجلدات لإعادة تشريحها" في الخطوة السابقة. استعرض وحدد المجلدات واحدا تلو الآخر.
    4. في النافذة المنبثقة الجديدة، أدخل المعلومات التالية في المربعات المعنية: عامل القياس هو 12.4، والعتبة هي 5.6، X، Y، وZ Frequency هي 5 و5 و1 على التوالي، وخوارزميات التنعيم هي غاوسية.
      ملاحظة: عامل القياس قيمة بالبكسل/ميكرومتر وسيتم استخدامه في قياس أخذ العينات اتجاه Z إلى أن الاتجاه XY. يتم الحصول على عامل التحجيم من حجم بكسل الصورة ، والذي يتم توفيره عادة كالبيانات الوصفية في الصورة لمعظم أنظمة المجهر confocal. على سبيل المثال، إذا تم الحصول على الصورة مع تباعد 0.08 ميكرومتر/بكسل، يجب أن يكون عامل القياس 12.5 بكسل/ميكرومتر. سيتم استخدام قيمة العتبة عتبة الصور وتوليد قناع ثنائي للخلية. أنشأنا قائمة بالقيم المثلى استنادا إلى كثافة المتبرع +المقبول للصورة. استخدم 4.5 كقيمة عتبة إذا كانت الصورة تحتوي على كثافة متبرع + مقبول مشرق وخلفية منخفضة ، وقيمة تتراوح بين 5.6 إلى 6.5 للصور التي تحتوي فقط على كثافة متوسطة + متبرع + مقبول و / أو خلفية أعلى ، وقيمة 7.5 وما فوق للصور التي تحتوي على كثافة المانح + المقبول التي هي أقل من الخلفية. تتوافق قيمة التكرار مع الفاصل الزمني، بعدد وحدات البكسل، حيث يتم تنفيذ التقطيع في الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، إذا كان عمق Z للخلية هو 17 ميكرومتر بحجم خطوة 1 ميكرومتر ويتم استخدام عامل قياس 12.5 بكسل/ميكرومتر في اتجاه XY، إعادة ختم عمق مجموعة بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد عند 212 بكسل (اتجاه Z). استنادا إلى قيمة التردد Z التي تم إدخالها (على سبيل المثال، بكسل واحد)، سيتم إعادة تقسيم مجموعة بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد بداية من أعلى مجموعة بيانات الصورة ثم تتحرك بزيادات بمقدار بكسل واحد إلى الأسفل. وينتج عن ذلك 212 صورة أعيد تقطيعها. إذا تم إدخال فاصل زمني أكبر لقيمة التردد لتردد Z، إنشاء عدد أقل من الصور التي تم إعادة تقطيعها. يتم حفظ الصور التي تم إعادة تقطيعها في خطوات لاحقة.
    5. انقر فوق تشغيل وانتظر حتى يتم تنفيذ كافة القياسات FRET وإعادة تقطيع.
      ملاحظة: يتم إنشاء مجلد منفصل داخل الدليل الأصل الذي يتم حفظ الصور كفاءة FRET تدرج الرمادي resliced والصور ذات اللون (تطبيق خريطة ملونة) FRET الكفاءة. على سبيل المثال، يتم حفظ كافة الصور FRET الرمادي وخريطة اللون resliced في الاتجاه X (YZ plane) في مجلد يسمى "Resliced_XFRET".
    6. كرر التحليل مع إعدادات مماثلة لجميع التجارب – قبل وبعد علاجات فورسكولين وضوابط السيارة.
      ملاحظة: توضح الخطوات المذكورة في المقطع 3.3 القيم لإدخال مخصص FRET تحليل البرمجة النصية لإنشاء بيانات صورة FRET ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، ينفذ هذا البرنامج النصي عدة عمليات أثناء التشغيل، بما في ذلك: تحميل بيانات الصور، وإنشاء مداخن الصور، والتنعيم، وحسابات كفاءة FRET، وإنشاء وتطبيق قناع حدود الخلية، وإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد، وإعادة تقطيع الصور ثلاثية الأبعاد على فترات محددة (الترددات)، وتطبيق خريطة ملونة لتصور تغييرات FRET، وحفظ بيانات الصورة التي تم إعادة تقطيعها إلى نفس الدليل. تم تضمين تفاصيل إضافية كتعليقات في البرنامج النصي للبرنامج.

4. رسم خرائط كفاءة FRET لمستويات cAMP

  1. افتح ملف البرمجة المسمى "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" وانقر فوق تشغيل على النافذة الرئيسية.
    ملاحظة: الملف متوفر على موقع "بيو إيماجينج" و "النظم الحيوية" (انظر الملاحظة تحت 3.2.1). يقرأ هذا الملف الصور ذات التدرج الرمادي من الكفاءة FRET ويحولها إلى مستويات cAMP استنادا إلى منحنى مميز. يستخدم هذا المنحنى المميز علاقة cAMP-to-FRET الموثقة في الأدب15،36 الموضحة في معادلة هيل (المعادلة الثالثة الموضحة أدناه). ومع ذلك ، من الصعب تقدير Kd من المسبار في الخلايا السليمة وافترضنا أنه 1 ميكرومتر في حساباتنا. ومن ثم، تظهر النتائج كدالة ل Kd. (أي [ cAMP ] = x * Kd). وترد أدناه المعادلات المستخدمة لقياس كفاءة FRET ورسم خرائط FRET لمستويات CAMP:
    figure-protocol-1
    حيث E هو كفاءة FRET،وظاهر و دواضحة هي كثافة بكسل unmixed من الصور المقبولة والمانحة، على التوالي.
    Qa و Qd هي غلة الكم من المقبول والمتبرع. لاحظ أن Qa و Qd يلغيان عندما يتم دمج معادلة kλ في معادلة الكفاءة FRET ، kλ هو عامل تصحيح:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3figure-protocol-4وهي معاملات الانقراض من المانح والمقبل في الطول الموجي الإثارة المانحة، i (405nm).
    figure-protocol-5
    E هو كفاءة FRET وKD = ثابت التفكك = 1 ميكرومتر.
  2. انتقل وحدد أول صورة FRET مقياس رمادي (حفظها في الخطوة 3.3.5) وانقر فوق موافق.
  3. افتح صور FRET/cAMP لفحص توزيع إشارات cAMP في ثلاثة أبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يصف هذا البروتوكول استخدام نهج التصوير والتحليل فائق الطيفية FRET لقياس تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية في الخلايا الحية. وهناك عدة خطوات رئيسية في تحقيق هذه النتائج، يلزم إيلاء اهتمام دقيق لها أثناء تحليل البيانات وقياسها كميا. وتشمل هذه الخطوات الرئيسية بناء مكتبة طيفية مناسبة، وطيافات خلفية، وتحديد عتبات لتحديد حدود الخلايا، وحسابات كفاءة FRET. يوضح الشكل 1 التدفق التخطيطي لجميع الخطوات التي ينطوي عليها قياس كفاءة FRET ومستويات CAMP في الخلايا الحية. وعند تنفيذ خطوات التصوير والتحليل هذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد سمح تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية FRET قياس وتصور إشارات النيوكليوتيدات الدورية في خلايا واحدة، وهناك وعد كبير لتصور الأحداث الإشارات دون الخلوية13،22،37،38. ومع ذلك ، فإن استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET يمثل العديد من القيود ، بما في ذلك خصائص الإشارة المنخفضة إلى الضوضاء للعديد من مراسلي FRET القائمين على البروتين الفلوري وضعف كفاءة العدوى أو التعبير لمراسلي FRET (قد يكون هذا تحديا خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الدكتوران ليفسلي وريتش يكشفان عن اهتمامهما المالي بشركة ناشئة، SpectraCyte، ذ.م.م، التي تم تشكيلها لتسويق تقنيات التصوير الطيفي. ومع ذلك، تم إجراء جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول باستخدام المنتجات المتاحة تجاريا غير المرتبطة SpectraCyte، ذ م م.

شكر وتقدير

الكتاب يود أن نعترف الدكتور كيس Jalink (معهد السرطان الهولندي ومركز فان ليوينهوك للمجهر المتقدم ، أمستردام ، هولندا) لتزويدنا H188 cAMP FRET الاستشعار البيولوجي وكيني ترينه (كلية الهندسة ، جامعة جنوب ألاباما) للمساعدة التقنية في الحد من الوقت الذي استغرقه لتشغيل العرف لدينا وضعت البرامج النصية.

ويود المؤلفون أن يعترفوا بمصادر التمويل: رابطة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة العلوم الوطنية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم( 160004). (1725937) المعاهد القومية للصحة، S100D020149، S10RR027535، R01HL058506، P01HL066299).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

يحتوي Institute الغطاء من نيكون A1R NIST المضادات الحيوية شرائح مسبقا
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Attofluor Cell ChamberInvitrogenA7816Attofluor على غرف خلايا فولاذية وحلقة مطاطية O. غرفة الخلية تحمل الغطاء وتوفر الحلقة O آلية قفل لعقد العازلة في غرفة الخلية مع تسرب
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)فيشر ScientificBP231-100المذيب المستخدم لإعداد محلول المخزون فورسكولين.
DRAQ5 محلول مسبار الفلورسنتThermo Scientific62252الملصق النووي
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092يحتوي على العناصر الغذائية وعوامل النمو للخلايا لتنمو وتنقسم في أطباق الاستزراع.
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيجماF6178إمداد عامل النمو الذي يضاف إلى وسط الاستزراع, DMEM
فورسكولينسيجماF3917أدينيلي سيكلاز المنشط.
H188 Cyclic AMP FRET biosensorNetherland Cancer Institute ، Dr. K. JalinkGiftPlasmid الذي يشفر الفيروز (فلوروفور المانح) ، كوكب الزهرة (فلوروفور المتقبل) ، ومجال الربط الذي تم الحصول عليه من Epac.
Image Jimage.netتحميل مجانيمنصة أخرى لمعالجة الصور تستخدم لتوسيع المعلومات الطيفية ومعالجة الصور.
دمج بصريات المحيط الكرويFOIS-1تستخدم لقياس شدة إضاءة خط الليزر بكثافة ليزر مختلفة (؟).
بروتين الفأر اللامينين ،الطبيعي Invitrogen23017-015مغلفة باللامينين وهذا يساعد في ارتباط الخلايا ونموها وحركتها.
Lipofectamine 3000 Transfection KitInvitrogenL3000-015كاشف التعداء المستخدم لنقل الخلايا باستخدام المستشعر الحيوي H188 FRET
MATLABMathworksR2019aيتم تنفيذ عمليات معالجة الصور (فك الخلط الخطي وحسابات كفاءة FRET) عن طريق كتابة برامج مخصصة في بيئة برمجة MATLAB
مجهر متحد البؤر نيكون A1Rنيكون إنسترومنتومنتسنيكون نيكون A1Rيتم الحصول على الصور الطيفية باستخدام المجهر متحد البؤر.
برنامج عناصر نيكوندونجل برنامجنيكون للأدواتيستخدم لتصدير ومعالجة ملفات صور nd2 (ملفات الصور متعددة الأبعاد) التي يتم الحصول عليها باستخدام مصباح
المعايرة القابل للتتبعOcean OpticsLS-1-CAL-INTمصباح ذو طيف معروف للاستخدام كمعيار
PBS pH 7.4 (1X)Gibco10010-023coomonly يستخدم ثقافة
الخلايا المؤقتةالخلايا البطانية الرئوية للأوعية الدموية الدقيقة (PMVECs)في المنزل - نواة زراعة الخلايا ، جامعة جنوب ألابامامعزولة من الأوعية الدموية الدقيقة الرئويةللفئران تشكل PMVECs البطانة الداخلية للأوعية الدموية.
تضاف البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)Gibco15140-122إلى مزرعة medum لمنع تلوث الخلايا.
مجهر دقيقة منظفةمن الشرائح الصغيرة كلاي آدامز3010مجهر تستخدم لتثبيت الخلايا
إطالة وسائط تركيب الماس المضادة للتلاشيInvitrogenP36961إذا تم إصلاح العينات باستخدام حامل مضاد للبهتان ، فإن اللاحق يحمي الأصباغ الفلورية والكروموفورات من التلاشي.
مطيافبصريات المحيطاتQE65000يستخدم لقياس الاستجابة الطيفية لمصدر الضوء (؟)
Trypsin-EDTA (0.25٪)Gibco25200-056يهضم رابطة البروتين والبروتين بين الخلية ومصفوفة الخلية ويساعد على تفكيك الخلايا ورفعها أثناء طلاء الخلايا.
Tyrodes Bufferصنع داخليا يستخدمالمخزن المؤقت Tyrodes المصنوع داخليا لصنع حلول العمل والحفاظ على الخلايا في محلول مائي أثناء الحصول على الصور.
6 لوحة ثقافة خلية الآبارCorning3506يتم وضع أغطية مطلية بطبقة Laminin في طبق ثقافة من 6 آبار (غطاء واحد / بئر). تضاف الخلايا مع الوسط إلى كل بئر.
25 مم غطاء مجهر دائري زلاتFisher Scientific12545102Cells نمت على أغطية زجاجية مستديرة
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X / 1.2 WI &infin ؛ / 0.15-0.18 WD 0.27الغمر في الماء والهدف الشائع الاستخدام للخلايا

المراجع

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031(2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513(2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586(2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453(2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

cAMP F rster

مقالات ذات صلة