Method Article

تحميل عينة المبردة في زاوية سحرية الغزل مطياف الرنين المغناطيسي النووي الذي يحافظ على الجدوى الخلوية

DOI:

10.3791/61733

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هنا بروتوكول لنقل العينات المجمدة المبردة إلى مسبار الرنين المغناطيسي النووي الديناميكي للاستقطاب النووي (DNP) الذي يدور (MAS). ويتضمن البروتوكول توجيهات لتخزين الدوار قبل التجربة واتجاهات لقياسات الجدوى قبل وبعد التجربة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يزيد الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) بشكل كبير من حساسية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (MAS) للزاوية السحرية. تزداد مكاسب الحساسية هذه مع انخفاض درجات الحرارة وهي كبيرة بما يكفي لتمكين دراسة الجزيئات بتركيزات منخفضة جدا في درجات حرارة التشغيل (~ 100 K) لمعظم مطياف NMR التجاري المجهز ب DNP. وهذا يؤدي إلى إمكانية البيولوجيا الهيكلية داخل الخلية على الخلايا المبردة للجزيئات الكبيرة في مستوياتها الذاتية في بيئاتها الأصلية. ومع ذلك، يتم تجاوز معدلات التجميد المطلوبة لالتبريد الخلوي أثناء معالجة العينة النموذجية ل DNP MAS NMR وهذا يؤدي إلى فقدان سلامة الخلوية وقابليتها للحياة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل لإعداد ونقل عينة مجمدة من خلايا الثدييات إلى مطياف MAS NMR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن لإدخال الاستقطاب النووي الديناميكي للزاوية السحرية التي تدور حول التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أن يزيد من حساسية التحليل بالرنين المغناطيسي النووي (MAS NMR) بعدة أوامر من الحجم. وقد مكن ذلك من الكشف عن الجزيئات الحيوية عند تركيزاتها الفسيولوجية أو بالقرب منها. DNP يمكن ولا توفر الحساسية اللازمة للكشف عن البروتين المسمى نظائريا في تركيزات الذاتية (~ 1 ميكرومتر) في البيئة البيولوجية المعقدة1. ولأن هناك بروتوكولات راسخة لإدخال جزيئات مسماة بالنظائر في خلايا الثدييات غير المسماة دون التأثير على قدرتها على البقاء، فإن هذا يفتح إمكانية دراسة الجزيئات الحيوية المخصبة بالنظائر عند مستوياتها الذاتية في بيئتها الأصلية. وعلاوة على ذلك، لأن التحسينات DNP هي أكثر كفاءة في درجات حرارة أقل2،3،4، ودرجات الحرارة التجريبية لDNP MAS NMR تتماشى بدقة مع تلك المطلوبة لتخزين طويل الأجل من خلايا الثدييات قابلة للحياة5. ومع ذلك ، فإن الطريقة التقليدية لنقل عينة إلى مطياف DNP MAS NMR تخضعها لمعدلات تقلب درجة الحرارة التي تمزق خلايا الثدييات.

تتطلب تجارب MAS NMR أن يتم تدوير العينة حول الزاوية السحرية بترددات تساوي أو تزيد عن حجم التفاعل النظيري بحيث يتم متوسطها إلى الصفر ، وعادة ما تكون على الأقل 4 كيلوهرتز وغالبا ما تكون أعلى بكثير6و7و8و9. ولذلك، فإن العينات معبأة في الدوارات التي تحتوي على طرف زعانف يستخدم لدفع دوران الدوار عن طريق تيار من الغاز ولها علامة في الطرف الآخر بحيث يمكن رصد تردد الدوران بواسطة مقياس سرعة الدوران. يتم نقل العينة لمعظم أجهزة MAS NMR عن طريق حقن الدوار من السطح الخارجي للأداة في الدعامة في نهاية مسبار NMR مع تيار من الهواء الجاف أو غاز النيتروجين. بعد أن يصل الدوار إلى الدعامة ، التي تحمل الدوار في الزاوية السحرية ، يتم دفع دوران العينة بواسطة آلية توربينات الهواء. تيارات منفصلة من دعم الغاز، ودفع والتحكم في درجة حرارة الدوار. يتطلب إدخال الدوار في مطياف NMR وتحقيق غزل MAS مستقر نصائح محرك الأقراص بدقة وتحكما محكما في درجة حرارة وضغط تيارات الغاز المنفصلة. على الرغم من هذه المطالب التقنية، يتم إدخال وتحقيق MAS مستقرة مؤتمتة إلى حد كبير للمسابير التجارية MAS NMR لتطبيقات درجة حرارة الغرفة.

ومع ذلك ، فإن الوضع أكثر تعقيدا بالنسبة للتطبيقات ذات درجات الحرارة المنخفضة. عادة ما يتم إدخال عينات لتطبيقات درجة الحرارة المنخفضة في المطياف في درجة حرارة الغرفة وتجميدها في الدعامة. في الدقيقة الأولى، تنخفض درجة حرارة العينة بسرعة (> -100 درجة مئوية /دقيقة) وتتطلب درجة حرارة النظام عدة دقائق للتوازن. بسبب التفاعل بين درجة الحرارة والضغط، غالبا ما يتم التعامل مع إدراج والاقتراب من ماس المطلوب يدويا لتطبيقات درجة الحرارة المنخفضة. على الرغم من الحاجة للتدخل اليدوي ، فإن تجميد الدوار داخل الجهاز مفيد لأنه يقلل من إدخال الماء والتكثيف في المسبار ، وهو أمر بالغ الأهمية لنجاح الغزل. ليس فقط يمكن للتكثيف والجليد تراكم من خطوط الغاز كتلة الرطوبة المحيطة، والتكثيف، أو الصقيع على الدوار نفسه يمكن أن تمنع ميكانيكيا ماس. وهكذا، عادة ما يتم تجميد عينات لانخفاض درجة الحرارة MAS NMR داخل الصك بمعدلات تتجاوز -100 درجة مئوية / دقيقة.

يمكن للخلايا الثديية الاحتفاظ بسلامتها من خلال دورة التجميد والذوبان إذا كان التبريدبطيئا5و10و11و12بمعدل يساوي أو أبطأ من 1 درجة مئوية / دقيقة. بدلا من ذلك تحتفظ الخلايا أيضا سلامتها إذا كان معدل التبريد فائقالسرعة 13،14،15، بمعدل أسرع من 104 درجة مئوية / دقيقة. معدلات وسيطة لهذين النقيضين تمزق وقتل خلايا الثدييات بسبب تشكيل الكريستال الجليد داخل وخارج الخلايا، حتى في وجود عوامل الصفن الجليدي16. تقع معدلات تبريد العينة الخاصة بدوار درجة حرارة الغرفة داخل مسبار تم تبريده مسبقا بين هذين النقيضين ، وبالتالي لدراسة خلايا الثدييات السليمة السليمة المحفوظة بالتبريد ، يجب تجميد العينات قبل نقلها إلى الجهاز ونقلها إلى الجهاز دون تقلبات في درجة الحرارة يمكن أن تضر بالعينة أو تراكم الصقيع على الدوار الذي يمكن أن يمنع الدوار من الدوران. يصف البروتوكول طريقة لإدراج الدوار الخالي من الصقيع والمبرد مسبقا في نظام MAS NMR المبرد لدراسة عينات خلايا الثدييات السليمة المحفوظة بالتبريد. تم تطوير نقل العينة المبردة الموصوفة هنا لتوصيف NMR للخلايا السليمة القابلة للحياة. ومع ذلك، فإنه ينطبق على أي نظام حيث تقلبات درجة الحرارة قد تهدد سلامة العينة. وهذا يشمل أي مجموعة متنوعة من النظم المعقدة، مثل تجميد التفاعلات المروية لتوصيف الكيميائية والهيكلية من وسيطة رد الفعل المحاصرين17،18، الأنزيمولوجيا19،20 أو البروتين للطي21،22.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة والتبريد من خلايا الثدييات

  1. زراعة وحصاد خلايا الثدييات
    1. إذابة اليكوت من خلايا الكلى الجنينية البشرية المجمدة (HEK 293).
    2. ثقافة HEK 293 خلايا في وسائل الإعلام النمو (على سبيل المثال، DMEM مع 10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ القلم-ستريب) في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في 100 مم لوحات لمدة سنتين إلى ثلاث مقاطع (7-10 أيام).
    3. تقسيم الخلايا والثقافة في لوحة 150 ملم حتى الخلايا تحقيق التقاء 90-95٪.
      ملاحظة: لوحة 150 ملم في > 90٪ التقاء ستكون كافية لملء اثنين من الدوارات الياقوت مع قطر 3.2 ملم.
    4. حصاد الخلايا باستخدام 4 مل من التريبسين (انظر جدول المواد)و 10 مل من وسائل الإعلام. نقل التعليق إلى جهاز طرد مركزي ومخروطي معقم سعة 15 مل عند 673 × جم (1000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أزل الناتنات الفائق.
    5. غسل بيليه الخلية مع الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) (درجة الحموضة 7.4، −CaCl2، −MgCl2).
  2. حماية الخلايا من التبريد
    1. جمع بيليه الخلية 50 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. إعداد خليط من 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 18 ميكرولتر من الجلسرين في أنبوب منفصل.
    2. مزيج بلطف بيليه الخلية 50 ميكرولتر مع 68 ميكروغرام من خليط الجلسرين-PBS بإضافة خليط الجلسرين-PBS إلى الجزء العلوي من بيليه وإعادة تعليق بيليه عن طريق التنصت بلطف على جانب الأنبوب حتى لا تبقى كتل.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأنابيب لطيف لإعادة تشغيل الخلية، ومع ذلك، تأكد من أن سلامة الخلوية لا للخطر.

2. التبريد من خلايا الثدييات في الدوار NMR

  1. نقل الخلايا إلى دوار الياقوت 3.2 ملم.
    1. لجعل قمع، وقطع تلميح ماصة 200 ميكرولتر وإدراج نهاية ضيقة من طرف ماصة قطع في الدوار 3.2 ملم.
    2. نقل الخلايا إلى القمع يجلس على الدوار. ضع الدوار مع القمع في أنبوب الطرد المركزي الدقيق و بيليه الخلايا في الجزء السفلي من الدوار عن طريق الطرد المركزي في 673 × ز لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. إزالة supernatant وأي عينة الزائدة من الدوار. كرر هاتين الخطوتين حتى يتم تعبئة الدوار بالكامل مع الخلايا.
      ملاحظة: اختياريا، حدد صلاحية الخلوية للعينة قبل التجميد. Resuspend 10 ميكرولتر من بيليه الخلية الزائدة في 100 ميكرولتر من DMEM خالية من FBS. مزيج 10 ميكرولتر من التعليق مع 0.4٪ الحل الأزرق تريبان وتقييم على الفور الجدوى باستخدام عداد الخلية الآلي. استخدام فقط FBS وسائل الإعلام الحرة لتمييع الخلايا كما يتداخل المصل مع تلطيخ الأزرق تريبان.
    4. ختم الدوار مع المكونات السيليكون باستخدام أداة التعبئة المتاحة تجاريا.
    5. أغلق الدوار بطرف محرك خزفي بالضغط عليه عموديا لأسفل. تجنب لمس الزعانف الحساسة على جانب طرف محرك الأقراص.
    6. وضع علامة على نصف الحافة السفلية من دوار الياقوت مع علامة دائمة فضية والنصف الآخر من الحافة السفلية للدوار مع علامة دائمة سوداء للسماح بمراقبة دقيقة للغزل الدوار داخل المطياف.
      ملاحظة: عيوب في وضع علامة على الدوار سيمنع العد الدقيق للتردد الغزل، مما أدى إلى الفشل في تحقيق الغزل مستقرة. لأن علامات لن يكتب على الدوار المجمدة والدوار الاحترار يعرض للخطر سلامة العينة، ووضع علامة على الدوار قبل تجميد خطوة حاسمة.
  2. التبريد من الخلايا داخل الدوار الياقوت 3.2 ملم.
    1. ضع وسادة مصنوعة من قطعة من الأنسجة أو منشفة ورقية تحت الغطاء وفي الجزء السفلي من القارورة المبردة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يحمي ورق الأنسجة علامة الدوار من التلف الذي يحدثه الاصطدام بجوانب القنينات المبردة.
    2. ضع دوار الياقوت مقاس 3.2 مم في القارورة المبردة المبطنة بورق الأنسجة مع وضع علامة على النهاية التي تواجه الجزء السفلي من القارورة المبردة.
    3. تجميد بطيء الدوار عن طريق وضع قارورة المبردة في معدل التحكم (-1 درجة مئوية / دقيقة) حاوية التبريد ووضع الحاوية في -80 درجة مئوية الفريزر لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
    4. نقل قارورة التبريد التي تحتوي على الدوار المجمدة لتخزين النيتروجين السائل.

3. نقل المبردة عينة المجمدة في مطياف NMR

  1. نقل العينة المجمدة إلى مرفق NMR.
    1. نقل قارورة المبردة التي تحتوي على الدوار المجمدة إلى ديوار صغيرة مليئة النيتروجين السائل لنقلها إلى منشأة NMR.
  2. نقل الدوار المجمدة إلى حمام النيتروجين السائل.
    1. ملء الجافة، معزولة حراريا رغوة الفم واسعة ديوار مع 500 مل - 1 لتر من النيتروجين السائل.
    2. نقل الدوار من قارورة المبردة في رغوة الفم واسعة dewar مليئة النيتروجين السائل.
      1. خذ القارورة المبردة من ديوار نقل في اليد وعقد فقط فوق سطح النيتروجين السائل لحمايته من الغلاف الجوي.
      2. في حين عقد قارورة المبردة مع الفم مشيرا إلى أسفل قليلا، فك الغطاء والسماح للدوار الانزلاق إلى حمام النيتروجين السائل.
        ملاحظة: بمجرد فك الغطاء ، يجب أن يسقط الدوار من القارورة المبردة إلى حمام النيتروجين السائل بسرعة (أقل من ثانية واحدة) لمنع التكثيف من التجميع على الدوار. تبخر النيتروجين السائل يشكل "سحابة النيتروجين" في الفم واسعة رغوة ديوار ويمنع التكثيف على الدوار قبل أن يتم غمرها في النيتروجين السائل. التعرض لفترة أطول من الدوار إلى الهواء يمكن أن يؤدي إلى تكثيف الرطوبة على الجدران الدوارة التي سوف إعادة تكثيف في الجليد.
  3. نقل المبردة من الدوار إلى NMR عينة الماسك.
    1. Prechill أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل عن طريق غمره في حمام النيتروجين السائل. لا تغلق الأنبوب.
      ملاحظة: فحص الدوار قبل نقله إلى أنبوب الطرد الجزئي. باستخدام ملاقط، عقد الدوار فقط تحت سطح النيتروجين السائل والتحقق من أن علامات الدوار سليمة، وأنه لم تتشكل أي رواسب الجليد على جدرانه وأن طرف محرك الأقراص سليمة. تظهر رواسب الكريستال الجليدي على جدران الدوار كمسحوق أبيض. كن حذرا لعقد دائما الدوار من قبل الجسم وليس من طرف محرك الأقراص. لا تخدش وضع علامة قبالة الدوار مع ملاقط نصائح.
    2. تحت سطح حمام النيتروجين السائل، استخدم الملاقط لنقل الدوار إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع طرف محرك الأقراص الذي يواجه الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق والعلامات التي تواجه فتح الأنبوب.
      ملاحظة: دائما ملاقط الجافة قبل الغمر في النيتروجين السائل أو لمس الدوار.
    3. باستخدام ملاقط، عقد أنبوب يحتوي على الدوار تحت النيتروجين السائل من رقبته.
    4. مع زوج ثان من الملاقط في متناول اليد، تكون على استعداد لغمر الماسك عينة NMR في حمام النيتروجين السائل والاحتفاظ بها بحيث يميل في زاوية حادة فيما يتعلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      ملاحظة: تقليل الوقت الذي الماسك عينة على اتصال مع النيتروجين السائل لتجنب تجميد O-حلقة. إذا تجمدت حلقة O، سيكون من الصعب جدا إدراج الماسك في المطياف.
  4. نقل الدوار المبرد من الماسك عينة NMR إلى مطياف NMR
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة شخصين، أحدهما لتشغيل الكريوكابينيت وآخر لنقل العينة من النيتروجين السائل إلى المسبار.
    1. ضع cryocabinet في وضع القذف عن طريق الضغط على "EJECT" على الخزانة.
      ملاحظة: يقوم وضع القذف بتطهير تدفق غاز النيتروجين الجاف والبارد عند الضغط العالي من المسبار إلى الغلاف الجوي من أجل منع دخول رطوبة الغلاف الجوي.
    2. نقل الدوار إلى الماسك عينة NMR.
      1. أدخل الطرف المفتوح من الماسك عينة NMR في أنبوب الطرد المركزي الدقيق في حين لا يزال تحت سطح النيتروجين السائل.
      2. رفع كل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق وNMR عينة الماسك للسماح للدوار أن تقع في الماسك العينة. هز NMR عينة الماسك وأنبوب الطرد الدقيق في حالة تمسك الدوار على حافة الماسك العينة.
      3. اترك أنبوب الطرد المركزي الفارغ فوق الماسك عينة NMR لحماية الدوار من الهواء.
    3. إزالة أخرى فارغة NMR عينة الماسك من التحقيق ووضعها على الأرض.
    4. نقل NMR عينة الماسك التي تحتوي على الدوار إلى يدك الحرة، وإزالة أنبوب الطرد الدقيق وإدراجه على الفور في التحقيق.
      ملاحظة: إذا كان O-حلقة يتجمد، سيكون من الصعب تشديد الماسك عينة. استمر في تطبيق القوة حتى تنزلق إلى مكانها.
    5. إشارة الشخص الذي يشغل cryocabinet إلى 'STOP EJECT' و 'INSERT'.
      ملاحظة: يوجه وضع الإدراج الدوار من الماسك العينة إلى المسبار.
    6. قم بتدوير العينة إلى معدل الدوران المطلوب (على سبيل المثال، 12 كيلوهرتز) عن طريق ضبط ضغط التدفق الحامل والقيادة الذي يتحكم فيه الكريوكابينيت. (على سبيل المثال، قم على الفور بزيادة الغاز الحامل إلى ~200 mBar وغاز محرك الأقراص إلى 10 mBar. بمجرد دوران العينة، قم بزيادة الغاز الحامل إلى 1000 mBar وادفع الغاز إلى 200 mBar. كما يستقر الغزل، وزيادة تحمل إلى 2400 mBar ومن ثم زيادة الغاز محرك الأقراص من 200 mBar إلى 1700 mBar على مدى عدة دقائق. غاز التبريد VT ثابت عند ~1070 L/h.)
      ملاحظة: عند رفع أنبوب الطرد الدقيق وNMR عينة الماسك من حمام النيتروجين السائل، تأكد من أن أنبوب الطرد الدقيق لديه ما يكفي من النيتروجين السائل داخله لمحاصرة الدوار. تقليل الوقت بين نقل الدوار إلى الماسك عينة NMR وإدراج الماسك عينة NMR في مطياف. وينبغي استكمال جميع الخطوات في 3.4 في غضون 30 s.

4. إزالة المبردة للعينة من مطياف NMR

  1. إعداد حمام النيتروجين السائل وقارورة التبريد
    1. صب 500 مل - 1 لتر من النيتروجين السائل في رغوة الفم واسعة ديوار ووضع الحمام تحت مطياف.
    2. قبل تبريد القارورة المبردة. غمر القارورة المبردة الفارغة التي تحتوي على قطعة من ورق الأنسجة في حمام النيتروجين السائل.
  2. نقل المبردة من الدوار من مسبار إلى قارورة المبردة
    1. خفض معدل الغزل إلى 0 كيلو هرتز عن طريق تكثيف القيادة وتحمل تدفق الغاز وإخراج الدوار عن طريق التحول إلى وضع القذف.
    2. الحفاظ على وضع القذف على، وإزالة الماسك عينة من التحقيق، وإسقاط الدوار مباشرة في رغوة الفم واسعة ديوار تحتوي على النيتروجين السائل.
    3. باستخدام ملاقط مبردة مسبقا، نقل الدوار إلى قارورة المبردة مسبقا تحت سطح النيتروجين السائل.
    4. كب القارورة المبردة. Prechill غطاء القارورة المبردة عن طريق غمسه في النيتروجين السائل. إزالة قارورة المبردة التي تحتوي على الدوار والنيتروجين السائل من الحمام وغطاء الأنبوب مع غطاء prechilled. لا تشديد الغطاء بحيث يمكن إطلاق النيتروجين تبخير بأمان.
    5. إعادة غمر القارورة المبردة في النيتروجين السائل. يمكن نقل العينة إلى تخزين النيتروجين السائل على المدى الطويل أو تفريغها على الفور لمزيد من التحليل.

5. تفريغ الدوار وقياسات الجدوى

  1. تفريغ الدوار وقياس الجدوى
    1. وسائل الإعلام الحرة قبل الحارة المصل (DMEM) أو برنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية.
    2. إزالة الدوار من النيتروجين السائل. إزالة تلميح محرك الأقراص والمكونات السيليكون.
      ملاحظة: الياقوت هو موصل الحرارة ممتازة. تجنب لمس الدوار بأصابعك لأن نقل الحرارة يمكن أن يسبب أحداث التجميد والذوبان المحلية التي تعرض للخطر الجدوى الخلوية.
  2. قياس الجدوى
    1. إضافة 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدافئة إلى بيليه الخلية المجمدة في الدوار والخلايا resuspend. إزالة تعليق مع ماصة وخلط تعليق مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
    2. إزالة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ومزيج مع حجم متساو من 0.4٪ الحل الأزرق تريبان (v/v). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 s إلى 1 دقيقة.
    3. قياس قابلية البقاء باستخدام عداد الخلايا التلقائي.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدعم إدخال عينات مجمدة مسبقا من خلايا الثدييات في مطياف NMR الجدوى في جميع أنحاء تجربة NMR. تظهر مخططات نقل المبردة لعينة مجمدة إلى مسبار NMR المبرد مسبقا في الشكل 1. يمكن تقييم الجدوى الخلوية والسلامة باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. هنا استخدمنا مقياسا معياريا قائما على الصبغة لسلامة الغشاء ، والذي يتماشى بشكل جيد مع الطرق الأخرى23. الخلايا سليمة غير منفذة لمحاولةبان الأزرق في حين أن الخلايا مع سلامة الغشاء للخطر نفاذية. يمكن تقييم عدد الخلايا الزرقاء القابلة للتغلغل وغير منفذة بسرعة باستخدام عداد الخلايا الآلي. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، فإن نفاذية التريبان الزرقاء لخلايا الثدييات بعد MAS NMR (أي عند النقطة 5.2.3) تشبه نفاذية التريبان الزرقاء لخلايا الثدييات قبل أي تغيير في درجة الحرارة (أي النقطة 2.1.3). ومع ذلك، إذا كانت الخلايا مجمدة بطيئة، ثم تدفأ إلى درجة حرارة الغرفة قبل الإدراج (أي اتباع البروتوكول إلى النقطة 3 قبل تسخين الدوار إلى درجة حرارة الغرفة قبل إدراجها في المسبار المبرد)، فإن الجدوى الخلوية كما تم تقييمها بواسطة تريبان الأزرق تنخفض إلى أقل من 10٪ من الخلايا(الشكل 2). وهكذا، فإن تجميد الخلايا داخل المطياف يؤدي إلى فقدان سلامة الغشاء الخلوي في حين أن الإدراج المبرد للعينات المجمدة من خلايا الثدييات يدعم صلاحية الخلية في جميع أنحاء تجربة NMR.

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لنقل عينة مجمدة إلى مسبار NMR مبرد مسبقا. أ)الاقتراب من سطح النيتروجين السائل وفك الجزء العلوي من القارورة المبردة. (ب) حرك الدوار إلى حمام النيتروجين السائل. (ج) غمر أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ملاقط والاحتفاظ بها في مكانها حتى يبرد تماما. (D) أدخل الدوار في جهاز الطرد المركزي الدقيق مع طرف محرك الأقراص التي تواجه الجزء السفلي من الأنبوب. دفع ، بدلا من الاستيلاء عليها ، مع ملاقط. (E) عقد أنبوب الطرد الدقيق فقط تحت سطح حمام النيتروجين السائل وفحص بصريا الدوار للتأكد من أنه خال من الصقيع وعلامة جيدة. (F) عقد الماسك عينة في زاوية فوق السطح. (G) رفع العينة الماسك وأنبوب من النيتروجين السائل بمجرد أن يكون الماسك عينة داخل أنبوب microcentrifuge. (H) هز الماسك عينة إذا تم القبض على الدوار على الحافة. (I) إزالة الماسك عينة فارغة من التحقيق ووضعها على الأرض. (J) إزالة أنبوب الطرد الدقيق من الماسك عينة مع الدوار داخل, إدراج, تشديد الماسك عينة في التحقيق واضغط على "INSERT" على وحدة التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يؤدي إدخال عينة مجمدة مسبقا من خلايا الثدييات إلى قياسات سليمة خلوية تشبه عينات خلايا الثدييات التي لم يتم تجميدها أبدا. نسبة الخلايا غير منفذة الأزرق تريبان للعينات التي لم يتم تجميدها (مثل الخطوة 2.1.3) مماثلة لتلك التي من الخلايا لعينات بعد MAS NMR (مثل الخطوة 5.2.3 مع ماس 12 كيلوهرتز). الخلايا المجمدة البطيئة (مثل الخطوة 3) التي تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة قبل إدخالها في أداة NMR التي تم تبريدها مسبقا إلى 100 K كانت نسبها المئوية أقل بكثير من الخلايا السليمة بعد MAS NMR مع ماس 12 كيلوهرتز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نجح نقل العينات المجمدة المبردة إلى مطياف NMR في الحفاظ على صلاحية خلايا الثدييات المجمدة من خلال الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي. ويتجلى نجاح هذه المنهجية في قياسات جدوى ما قبل وبعد MAS NMR. هذا النهج ناجح وقابل للتعميم على أي نظام حيث تقلبات درجة الحرارة قد تعرض سلامة العينة للخطر. يتم تنفيذ البروتوكول المعروض حاليا مع خط الخلية HEK 293. لأن ظروف حفظ التبريد للعديد من خطوط خلايا الثدييات متشابهة جدا، فمن المرجح أن الظروف المبلغ عنها هنا قابلة للترجمة إلى أنظمة خلوية أخرى. ومع ذلك، فإنها قد تتطلب تحسين مزيد من المبردات، وحجم العينة، ومعدلات التجميد لتحقيق نفس النتائج.

ويمكن تحسين هذه المنهجية عن طريق تفريغ الدوار أسرع تجربة ما بعد NMR. هذه الخطوة حاليا دون المستوى الأمثل وتنفيذها يؤثر على صلاحية الخلايا. قبل أن يمكن إعادة إنفاق الخلايا في الوسائط، يجب إزالة طرف محرك الأقراص وقابس السيليكون من الدوار. العينة يذوب بشكل غير متساو عندما يتم عقد الدوار أثناء إزالة طرف محرك الأقراص والمكونات السيليكون حتى أقصر أوقات التعامل مع الدوار يؤدي إلى ارتفاع viabilities. إن تطوير حاملات الدوار أو غيرها من الأدوات لتسهيل ذوبان الجليد الموحد والإزالة السريعة لطرف محرك الأقراص وقابس السيليكون سيساعد في جعل تقييم ما بعد NMR للقدرة على البقاء أكثر دقة.

يقتصر النهج المتبع لتحميل العينة المبردة الموصوفة في هذه المقالة على مسابير NMR التي تدعم إدخال العينة وإخراجها مع وجود المسبار في مضجر مغناطيس NMR. بينما إدراج العينة الخارجية وإخراج هو المعيار لأنظمة DNP التجارية، تحقيقات مخصصة لا يكون دائما هذا الخيار. أيضا، قد يتطلب هذا النهج لتحميل العينة المبردة بعض التعديل للمسابير NMR بنيت لتكون متوافقة مع الدوارات مختلفة الحجم. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للدوار 3.2 ملم، وقد يتطلب التعديل إذا كان القطر الخارجي للعينة الماسك يتجاوز القطر الداخلي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق (مثل الخطوة 3.4.2).

مع تطبيق DNP على MAS NMR ، أصبح من الممكن الآن اكتشاف البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى بتركيزات فسيولوجية داخلية24و25و26. وهذا يفتح إمكانية دراسة الجزيئات الحيوية داخل بيئاتها الأصلية. ومن المرجح أن يكون الحفاظ على سلامة الخلوية وقابليتها للحياة طوال التجربة أمرا حاسما في ربط النتائج التجريبية للتنظير الطيفي بالظواهر البيولوجية. تجميد غير المنضبط من العينات التي تحتوي على البروتينات النقية أو اليسات الخلوية لا يعرض للخطر عادة جودة العينة7،27، على الرغم من أن هناك بعض المؤشرات على أن معدل التجمد قد يكون متغيرا هاما حتى في النظم المنقى28. ومع ذلك ، يجب تجميد عينات من خلايا الثدييات بمعدل مسيطر عليه إذا كان الحفاظ على سلامة الخلوية وقابليتها للحياة أمرا مهما للتفسير. هنا نقدم بروتوكولا لتجميد ونقل العينات المجمدة من خلايا الثدييات إلى أداة DNP MAS NMR المبردة مسبقا التي تتجنب تقلبات درجة الحرارة الضارة المحتملة وتدعم القياس على الخلايا القابلة للحياة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس [RR150076] ، والمؤسسة الوطنية للعلوم [1751174]؛ المعاهد الوطنية للصحة [NS-111236]، مؤسسة ويلش [1-1923-20170325]؛ مؤسسة لوب مورشيسون، ومؤسسة تيد ناش للحياة الطويلة، ومؤسسة القرابة (برنامج علماء سيرل) إلى K.K.F.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4٪ تريبان بلو لغمةInvitrogenT10282
100 مم طبق زراعة الخلاياتوماس ساينتفيك430167
150 مم طبق زراعة الخلاياNunc157150
3.2 مم دوار الياقوتBruker
45 & درجة ملقط بزاويةهامبتون ريسيرشHR4-859
AMUPolCortecnetC010P005
علامة باللونين الأسود والفضيأداة إزالة غطاء Sharpie
BrukerHZ16913
ماء بدرجة ثقافة الخليةHyCloneSH30529.03
سيراميكCortecnetHZ12372
CoolCellCorning / BiocisionUX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسةInvitrogenC10288
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآليInvitrogenAMQAF1000
أنابيب التبريدNalgene03-337-7Y
d8-glycerolAldrich447498
أكسيد الديوتيريوم ، 99.8٪ ذرة DAldrich756822-1
DMEMGibco10569-010
DNP نظام الرنين المغناطيسي النووي مع الدوران المتطابقالتردد رغوة بروكر
ديوارSpearlabFD-800
KimwipesKimwipes
أداة التعبئةBruker
Pen-StrepGibco15140-122
مسحوق PBSVWRVWRRV0780
بروتونات PBSGibco10010-023
قابس السيليكونBrukerB7089
السفينة القياسية
Tryp-LGibco12605010
غطاء مع ملقط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Sample LoadingMagic Angle Spinning NMRDynamic Nuclear PolarizationCellular Viability PreservationLiquid Nitrogen TransferSapphire Rotor HandlingControlled Rate CoolingNMR Spectrometer OperationMammalian Cell CryopreservationSample Integrity Maintenance

Related Articles