Method Article

الحقن داخل القلبية وكمية من المعلمات العدوى في نموذج الماوس من التهاب Endophthalmitis البكتيرية

DOI:

10.3791/61749

⸱

February 6th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف هنا طريقة الحقن داخل في الواقع والكمية البكتيرية اللاحقة في نموذج الماوس من التهاب بطانة الرحم البكتيرية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لقياس الاستجابات المناعية المضيفة والبكتيرية والمضيفة الجينات التعبير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الالتهابات البكتيرية داخل العين تشكل خطرا على الرؤية. يستخدم الباحثون نماذج حيوانية للتحقيق في العوامل المضيفة والبكتيرية ومسارات الاستجابة المناعية المرتبطة بالعدوى لتحديد الأهداف العلاجية القابلة للتطبيق واختبار الأدوية لمنع العمى. وتستخدم تقنية الحقن داخل الجسم لحقن الكائنات الحية، والمخدرات، أو غيرها من المواد مباشرة في تجويف الزجاجة في الجزء الخلفي من العين. هنا، أظهرنا تقنية الحقن هذه لبدء العدوى في عين الماوس وتقنية تحديد البكتيريا داخل العين. نمت عصيات cereus في الدماغ ضخ القلب وسائل الإعلام السائلة لمدة 18 ساعة و resuspended إلى تركيز 100 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)/0.5 μL. تم تخدير فأر C57BL/6J باستخدام مزيج من الكيتامين والزيلازين. باستخدام الحقن المجهري البيوليتر والإبر الشعرية الزجاجية، تم حقن 0.5 ميكرولتر من تعليق عصيات في الزجاج الزجاجي منتصف عين الماوس. أما حقن العين التحكم في الاضلاع مع وسائل الاعلام العقيمة (السيطرة الجراحية) أو لم يتم حقن (السيطرة المطلقة). وفي 10 ساعات بعد الإصابة، تم قتل الفئران، وتم حصاد العيون باستخدام ملاقط جراحية معقمة ووضعت في أنبوب يحتوي على PBS معقم 400 ميكرولتر والخرز الزجاجي المعقم 1 ملم. بالنسبة لـ ELISAs أو مقايسات النخاع ، تمت إضافة مثبط البروتينات إلى الأنابيب. لاستخراج RNA، تمت إضافة المخزن المؤقت تحلل المناسبة. تم التجانس العينين في التجانس الأنسجة لمدة 1-2 دقيقة. تم تخفيف المتجانس بشكل متسلسل 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني وتتبع المخفف على لوحات أجار. تم تخزين ما تبقى من المتجانس في -80 درجة مئوية لم مقايسات إضافية. تم احتضان اللوحات لمدة 24 ساعة وتم تحديد كمية CFU لكل عين. هذه التقنيات تؤدي إلى التهابات قابلة للتكرار في عيون الماوس وتسهيل كمية البكتيريا القابلة للحياة ، والاستجابة المناعية المضيفة ، و omics للتعبير الجيني المضيف والبكتيري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب بطانة الدماغ البكتيري هو عدوى مدمرة تسبب الالتهاب ، وإذا لم يتم علاجه بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي إلى فقدان البصر أو العمى. نتائج Endophthalmitis من دخول البكتيريا إلى المناطق الداخلية للعين1,2,3,4,5. مرة واحدة في العين، والبكتيريا تكرار، وإنتاج السموم وغيرها من العوامل الضارة، ويمكن أن يسبب ضررا لا رجعة فيه لخلايا الشبكية الحساسة والأنسجة. يمكن أن يكون الضرر العيني أيضا بسبب التهاب، وذلك بسبب تنشيط الممرات الالتهابية مما يؤدي إلى تدفق الخلايا الالتهابية في المناطق الداخلية من العين1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات بناء على التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات وجمعية البحوث في الرؤية وبيان طب العيون لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الحيواني المؤسسية لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما (أرقام البروتوكول 15-103 و 18-043 و 18-087).

1. الإبر الزجاج العقيمة

  1. بدوره على إبرة سحب ماصة.
  2. اضبط مقبض المقبض حتى تظهر الشاشة 12.6.
  3. فتح الباب وتغذية يدويا أنبوب الشعيرات الدموية 5 ميكرولتر من خلال المشبك العلوي ودهم سخان حتى نصف أنابيب يمتد تحت خيوط (الشكل 1A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توليد inoculum استنساخ ودقة إجراء الحقن داخل فيريال هي الخطوات الرئيسية في تطوير نماذج من التهاب بطانة الرحم الميكروبية. هنا، أظهرنا إجراء الحقن داخل في الواقع باستخدام الغرام إيجابية عصيات cereus. حقننا 100 CFU/0.5 ميكرولتر من B. cereus في منتصف الزجاجي لخمسة فئران C57BL6. بعد 10 ح بعد الظهر، لاحظنا نمو العين من B. cereus إلى ما يقرب من 1.8 × 105 CFU / العين. يوضح الشكل 1 بناء إبر زجاجية لتوصيل البكتيريا إلى منتصف في منتصف عين الماوس. عصيات cereus

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى مع توافر المضادات الحيوية القوية ، والأدوية المضادة للالتهابات ، وجراحة استئصال فيريك ، يمكن أن يؤدي التهاب بطانة الأوعية البكتيرية إلى تعمية المريض. كانت الدراسات السريرية مفيدة في دراسة التهاب إندورفوم. ومع ذلك، فإن النماذج التجريبية من endophthalmitis توفر نتائج سريعة وقابلة للتكرار يمكن ترجمتها إلى التقدم في مستوى الرعاية، مما يؤدي إلى نتائج بصرية أفضل للمرضى.

حجم الزجاجة للعين الماوس هو ما يقرب من 7 ميكرولتر40. هذا الحجم الصغير يسمح فقط لكمية محدودة من المواد ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي منازعات مالية للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفان الدكتور فنغ لي ومارك ديتمار (أوهسك P30 الحية تصوير الحيوان الأساسية، عميد معهد أ. ماكغي للعيون، أوكلاهوما سيتي، OK، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم. وقد تم دعم أبحاثنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R01EY028810، R01EY028066، R01EY025947، وR01EY024140. كما تم دعم أبحاثنا من قبل P30EY21725 (منحة NIH CORE لتصوير الحيوانات الحية وتحليلها، والبيولوجيا الجزيئية، والتصوير الخلوي). كما تم دعم بحثنا من قبل برنامج التدريب ما قبل الدكتوراه في مجال الرؤية في NEI 5T32EY023202، ومنحة دعم أبحاث مؤسسة الصحة المشيخية، ومنحة غير مقيدة لعميد معهد أ. ماكغي للعيون من البحوث للوقاية من العمى.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 وميكرو ؛ L ماصةRANINL0696003GNA
37oC حاضنةفيشر Scientific11-690-625DNA
Bacto ضخ القلب للدماغBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument، Inc.PM2000NA
ملقط طرف ناعمThermo Fisher Scientific12-000-122NA
خرز زجاجي 1.0 ممBioSpec11079110NA
حاضنة شاكرنيو برونزويك ScientificNB-I2400NA
ماصات الشعيرات الدموية الدقيقة 5 ميكرولترKimble71900-5NA
Micro-Pipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
مجهر أكسيوستار بلسزايسNA
مجهر OPMI لوميرازايسNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
ماصة متعددة القنوات 30-300 & LBiohit15626090NA
ماصة متعددة القنوات 5-100 & micro; LBiohit9143724NA
إبرة / مجتذب ماصةKopf730NA
PBSGIBCOمثبط البروتياز من الدرجة الجزيئية
كوكتيلRoche4693159001ملقط العمل العكسي من الدرجة الجزيئية
KatenaK5-8228NA
1897315

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

Related Articles