Method Article

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يساهم عزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتوصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي بشكل كبير في فهم نمط الاستجابة المناعية ضد الغرسات. يصف هذا البحث طريقة دقيقة لعزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتلطيخها لتحليل التدفق الخلوي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يخضع نجاح زرع الأنسجة المزروعة في المختبر أو جهاز طبي في الفرد للاستجابة المناعية للمضيف المتلقي. بالنظر إلى الغرسة كجسم غريب ، قد تؤدي الاستجابة المناعية العدائية وغير المنظمة إلى رفض الغرسة ، في حين أن الاستجابة المنظمة واستعادة التوازن يمكن أن تؤدي إلى قبولها. يمكن أن يساعد تحليل البيئات الدقيقة للغرسات التي تم تشريحها تحت إعدادات الجسم الحي أو خارج الجسم الحي في فهم نمط الاستجابة المناعية ، والتي يمكن أن تساعد في النهاية في تطوير أجيال جديدة من المواد الحيوية. قياس التدفق الخلوي هو تقنية معروفة لتوصيف الخلايا المناعية ومجموعاتها الفرعية بناء على علامات سطح الخلية. تصف هذه المراجعة بروتوكولا يعتمد على التقطيع اليدوي والهضم الأنزيمي والترشيح من خلال مصفاة خلوية لعزل معلقات الخلايا الموحدة من أنسجة الزرع المقطعة. علاوة على ذلك ، تم شرح بروتوكول تلطيخ قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، إلى جانب خطوات إعدادات مقياس الخلايا الأولية لتوصيف هذه الخلايا المعزولة وقياسها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى التقدم في مجال الطب إلى الاستخدام المتكرر للمواد المزروعة لدعم وظيفة أو إعادة نمو الأنسجة التالفة 1,2. وتشمل هذه الأجهزة مثل أجهزة تنظيم ضربات القلب ، والغرسات التجميلية الترميمية ، ولوحات تقويم العظام المستخدمة لتثبيت كسور العظام 3,4. ومع ذلك ، فإن المواد المستخدمة في صنع هذه الغرسات والمواقع التي يتم زرعها فيها تلعب أدوارا مهمة في تحديد نجاح هذه الغرسات5،6،7. كأجسام غريبة ، يمكن أن تولد هذه الغرسات استجابة مناعية من المضيف يمكن أن تؤدي إما إلى الرفض أو ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يقدم الشكل 1 لمحة عامة عن بروتوكول قياس التدفق الخلوي.

1) إعداد الكاشف

  1. تحضير الوسائط لتخفيف الإنزيمات وزراعة الأنسجة.
    1. أضف 5 مل من محلول عازلة 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينإيثان سلفونيك (HEPES) إلى 500 مل من وسط RPMI ويهز جيدا. قم بتخزين الوسط على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  2. احسب حجم محلول الإنزيم.
    ملاحظة: حجم محلول الإنزيم هو حجم الوسط الذي يحتوي على الإنزيمات (كولاجيناز و DNase I) التي ستكون ضرورية لهضم الأنسجة المقطعة في ألواح ذات 6 آبار ؛ ذلك يعتمد على عدد العينات.
    1. استخدم المعادلة التالية لحساب الحجم المطلوب:
      (عدد العينات المراد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تعتمد عملية تطوير لوحات قياس التدفق الخلوي للتحليل المناعي على مقارنة النتائج بالبيانات الموجودة والأدبيات في هذا المجال. إن معرفة كيفية ظهور السكان في قياس التدفق الخلوي أمر بالغ الأهمية للتفسير الصحيح للبيانات. بغض النظر ، يمكن أن تظهر المجموعات وأنواع الخلايا بشكل مختلف في الأنسجة المختلفة ، لذلك من المتوقع حدوث بعض التباين. في سياق أنسجة التحكم المحددة جيدا ، يمكن تقييم تحسين التلوين هذا مقابل الأنسجة المعروفة التي تحتوي على أنواع خلايا مدروسة جيدا. يوضح .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المراجعة منهجية مفصلة لعزل الخلايا من غرسات المواد الحيوية للحصول على تعليق خلية موحد. بالإضافة إلى ذلك ، تم توفير بروتوكول مفصل لتلطيخ تعليق الخلية لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، إلى جانب خطوات تكوين مقياس التدفق الخلوي للحصول على أفضل النتائج. يمكن أن تتضمن طرق عزل الخلايا خطوات متعددة ، وغالبا ما تستخدم تشريح الأنسجة اليدوي متبوعا بالهضم الأنزيمي مع الإنزيمات المحللة للبروتين لفصل المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة وتعطيل تقاطعات الخلايا الخلوية لتحرير الخلايا الفردية من الأنسجة. بعد الهضم ، هناك حاجة إلى مز.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، بما في ذلك المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية. إخلاء المسؤولية: لا توصي المعاهد الوطنية للصحة ومسؤولوها وموظفوها أو تصادق على أي شركة أو منتج أو خدمة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 مل أنابيب مخروطيةالشكل فيشر Scientific14-432-22
6 لوحة جيدةفيشر Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655لتثبيت الخلايا فقط
ألبومين مصل الأبقارMillipore SigmaA7906لتحضير FACS تلطيخ المخزن
CD11b AF700Biolegend101222استنساخ: M1 / 70
CD11c PerCP / Cy5.5Biolegend117325استنساخ: N418
CD197 PE / Dazzle594Biolegend120121استنساخ: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207استنساخ: استنساخ Ba13
CD206 PEBiolegend141705: C068C2
CD45 استنساخ BUV737BD Biosciences612778: 104 / A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199استنساخ: GL1
CD8a BV421Biolegend100737استنساخ: 53-6.7
Comp Bead المضادة للفأرBD Biosciences552843للتحكم في التعويض
DNase IMillipore Sigma11284932001deoxyribonuclease البنكرياس البقري I (DNase Iاستنساخ
F4 / 80 PE / Cy7Biolegend123113: استنساخ BM8
Fc BlockBiolegend101301: 93
مجموعة حلول التثبيت / النفاذيةBD Biosciences554714 لتثبيت الخلايا ونفاذها.
عازلة HEPESThermo Fisher15630080Buffer لتكملة وسائط الخلية
LiberaseMillipore Sigma5401127001مزيج من الكولاجيناز المنقى I و Collagenase II
الحي / الميت طقم بقع الخلايا الميتة الزرقاء القابل للإصلاحThermo FisherL23105صبغة الجدوى
Ly6c AF488Biolegend128015استنساخ: HK1.4
Ly6g BV510Biolegendاستنساخ 127633: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894استنساخ: M5 / 114.15.2
محلول ملحي عازل للفوسفاتThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176وسائط زراعة الخلايا
Siglec F BV605BD Biosciences740388استنساخ: E50-2440
صفيحةV-bottom 96-well
المؤقت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles