مقالة منهجية

حفظ البويضات المسترجعة بالتبريد من أنسجة المبيض لتحسين الحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات والنساء قبل البلوغ

6.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61777

⸱

أكتوبر 23, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Développement Embryonnaire Précoce Humain et Pluripotence, Univ Montpellier, INSERM 1203, 2Département de Biologie de la Reproduction, Biologie de la Reproduction/DPI et CECOS, CHU Montpellier, Univ Montpellier, 3Centre d'AMP-CECOS, CHU Grenoble-Alpes, Univ Grenoble-Alpes

في هذه المقالة

ملخص

نقترح بروتوكولا للحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات قبل البلوغ والنساء المعرضات لخطر قصور المبيض المبكر. فهو يجمع بين تجميد أنسجة المبيض وحفظ البويضات المسترجعة من أنسجة المبيض. تعمل هذه الاستراتيجية على تحسين السلامة وتحسين الإمكانات الإنجابية للحفاظ على الخصوبة ، مما يزيد من فرصة الولادة.

الملخص

يستخدم حفظ أنسجة المبيض البشري بالتبريد (OTC) بشكل متزايد في جميع أنحاء العالم للحفاظ على خصوبة الإناث لدى الفتيات قبل البلوغ والنساء المعرضات لخطر قصور المبيض المبكر (POI) في سياق العلاجات العاجلة السامة للغدد التناسلية أو جراحة المبيض. يعد الحفاظ على الخصوبة أمرا صعبا لأنه لا يوجد إجماع بشأن إدارة المريض أو استراتيجيات الحفاظ على الخصوبة أو حتى بروتوكولات المختبر الفنية ، مما يعني أنه يجب تكييف كل إجراء مع خصائص ملف المريض ونسبة المخاطر إلى الفوائد الخاصة به. أثناء OTC ، يمكن شفط البويضات الناضجة / غير الناضجة مباشرة من البصيلات الشعرية الكبيرة / الصغيرة داخل عينات أنسجة المبيض و / أو يتم إطلاقها في وسط المزرعة من البصيلات النامية أثناء تشريح أنسجة المبيض في الفتيات والنساء قبل البلوغ. في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا يجمع بين تجميد أنسجة المبيض وحفظ البويضات الناضجة / غير الناضجة بالتبريد التي تم استردادها من عينات أنسجة المبيض ، مما يحسن القدرة الإنجابية للحفاظ على الخصوبة. سيتم وصف الجمع المناسب لأنسجة المبيض والبويضات والتعامل معها وتخزينها قبل وأثناء وبعد الحفظ بالتبريد. كما ستتم مناقشة الاستخدام اللاحق وسلامة عينات أنسجة المبيض والبويضات المحفوظة بالتبريد / المذابة ، بالإضافة إلى التوقيت الأمثل للنضج المختبري للبويضات غير الناضجة. نوصي بالاستخدام المنهجي لهذا البروتوكول في الحفاظ على الخصوبة للفتيات والنساء قبل البلوغ لأنه يزيد من الإمكانات الإنجابية الكاملة للحفاظ على الخصوبة (أي تزجيج البويضات بالإضافة إلى OTC) ويحسن أيضا سلامة واستخدام الحفاظ على الخصوبة (أي ذوبان البويضات مقابل طعم المبيض) ، مما يزيد من فرصة الولادة الناجحة للمرضى المعرضين لخطر POI.

المقدمة

نما مجال الحفاظ على الخصوبة على مدى العقدين الماضيين بسبب العدد المتزايد من المرضى المعرضين لخطر قصور المبيض المبكر (POI) 1،2،3. الخيارات الطبية المتاحة حاليا للحفاظ على الخصوبة هي حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) 4 ، وتجميد البويضات / الأجنة بعد تحفيز المبيض5 ، وإعطاء نظائر GnRH6 ، أو تبديل المبيض7. يعد OTC تقدما كبيرا في الحفاظ على الخصوبة ، لا سيما عند الفتيات قبل البلوغ ، حيث هو الخيار الوحيد المتاح حاليا للحفاظ على الخصوبة وأيضا في النساء اللواتي لا يستطعن تأخير بدء العلاج السام للغددالتناسلية 2،4.

يسمح OTC بالحفاظ على عدد كبير من البصيلات البدائية ، والتي تقع في الجزء الخارجي 1 مم من قشرة المبيض2. يمكن استخدام أنسجة المبيض المجمدة / المذابة لاحقا عن طريق الكسب غير المشروع (تقويم العظام أو غير المتجانس ، الذاتي أو المتبرع) أو زراعتها في المختبر للحصول على بويضات ناضجة2. ثبت أن طعم عينات أنسجة المبيض قبل البلوغ المجمدة المذابة يحفز البلوغ8،9. في النساء ، تكون النتائج الإنجابية بعد التطعيم الذاتي لتقويم قشرة المبيض المجمدة المذابة مطمئنة ، حيث تصل معدلات المواليد الأحياء إلى 57.5٪ بعد الحمل الطبيعي10 وبين 30٪ إلى 70٪ بعد الحمل المساعد على الإنجاب (ART)11. منذ أول ولادة حية من زرع تقويم العظام لأنسجة المبيض البشري المجمدة / المذابة في عام 200412 ، سمحت هذه التقنية بولادة ما لا يقل عن 130 طفلا في جميع أنحاءالعالم 2. تستمر الوظائف الهرمونية والتناسلية لأنسجة الكسب غير المشروع بشكل عام لعدة سنوات11،13،14 ، مما يؤكد وظيفتها على المدى الطويل.

ومع ذلك ، فإن الزرع الذاتي لعينات أنسجة المبيض ينطوي على خطر نظري لإعادة إدخال خلايا خبيثة قابلة للحياة في بعض المرضى15،16،17،18 ، خاصة في الناجين من سرطانالدم 19. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن أي حالة انتقال للسرطان عن طريق طعم قشرة المبيض المجمدة / المذابة في الناجين الأصحاء من السرطان11 ، مما يشير إلى أن الطبيعة اللاوعائية الليفية لقشرة المبيض يمكن أن تمثل بيئة مكروية غير مضيافة لنشر الخلايا الخبيثة. ومع ذلك ، لا يزال تطعيم أنسجة المبيض يمثل تقنية تجريبية وصعبة ، مما يشير إلى أنه يجب اعتبار استخدام البويضات حاليا نهجا أسهل وأكثر أمانا من ترقيع أنسجة المبيض لاستعادة الخصوبة. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن استرداد البويضات غير الناضجة بسهولة من أنسجة المبيض أثناء OTC في كل من الفتيات والنساء في سن البلوغ16 ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يمثل مصدرا موثوقا به لتعظيم إمكانات استعادة الخصوبة بالإضافة إلى تجميد الأنسجة القشرية المبيضية. يمكن شفط هذه البويضات يدويا خارج الجسم الحي في مختبر العلاج المضاد للفيروسات القهقرية من البصيلات الباطنة المرئية أو عزلها عن الوسائط المستهلكة بعد تشريح أنسجة المبيض. يمكن بعد ذلك تزجيج البويضات المسترجعة مباشرة في مرحلة غير ناضجة أو أن تنضج قبل خطوة التزجيج باستخدام النضج في المختبر (IVM) 20،21.

في هذه المخطوطة ، نقترح بروتوكولا يجمع بين حفظ أنسجة المبيض بالتبريد مع عزل وحفظ التبريد للبويضات الناضجة (البويضات في مرحلة MII) و / أو البويضات غير الناضجة (أي الحويصلة الجرثومية (GV) والبويضات في مرحلة Metaphase I (MI)) المسترجعة من أنسجة المبيض. يحدد هذا البروتوكول جميع الخطوات المحددة المطلوبة لتعظيم إمكانات الحفاظ على الخصوبة لدى كل من الفتيات والنساء قبل البلوغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقعت جميع النساء (فوق سن 18 عاما) وكذلك جميع الفتيات القاصرات وأولياء أمورهن على نموذج موافقة مستنيرة للحفاظ على خصوبة المريض المعرضة لخطر الإصابة ب POI. يعتبر هذا البروتوكول إجراء روتينيا للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية في مركزنا للحفاظ على الخصوبة. يتبع إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسساتنا.

1. مراقبة الجودة

  1. تشمل سن الإناث ≤ 38 عاما ، وتحتوي على تركيز الهرمون المضاد للمولر المنتشر >1 نانوغرام / مل ويظهر وجود خطر متزايد للإصابة ب POI بسبب العلاج السام للتنادل. استبعاد النساء المؤهلات لتزجيج البويضات لإجراء الحفاظ على الخصوبة ، والنساء اللواتي يعانين من حالة تمنع إعطاء موافقة مستنيرة تماما أو النساء المعرضات لخطر كبير من مضاعفات التخدير أو الجراحة.
  2. تأكد من وجود موافقة موقعة للمريض قبل البدء في هذا الإجراء.
  3. حدد موقعين شاغرين داخل صهريجين متميزين لتخزين الحفظ بالتبريد. سيتم الاحتفاظ بنصف أنابيب التبريد / القش في خزان التخزين الأول بينما سيتم الاحتفاظ بالنصف الآخر من أنابيب التبريد / القش في الخزان الآخر لتقليل مخاطر الفقد الكلي للعينات في حالة تعطل الخزان.
  4. تحقق من توفر ووظائف جميع الأجهزة الطبية المطلوبة في هذا البروتوكول. يوصى باستخدام مقص تشريح جراحي معقم بشفرات مستقيمة حادة ونقاط حادة ونقاط حادة بدقة بالإضافة إلى ملقط الأنسجة اللارضحي المعقم لخطوة التشريح.
  5. تأكد من احترام جميع خطوات مراقبة الجودة لجميع الأجهزة الطبية (على وجه الخصوص ، التحقق من الصحة والتحكم الروتيني في عمليات التعقيم ، والتحقق من رقم انتهاء الصلاحية / الدفعة وتتبعها).
  6. حافظ على بيئة معقمة / معقمة طوال العملية وتأكد بحذر من جميع احتياطات السلامة.
  7. استخدم أطباق وماصات وأدوات جراحية مختلفة لكل مريض.

2. اليوم السابق للحفظ

  1. قم بإعداد طبق بتري معقم 60 مم يحتوي على وسيط أطفال الأنابيب مغطى بالزيت المعدني واحتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ O2 و 5٪ CO2. استخدم هذا الطبق لجمع مجمعات البويضات الركامية (COCs) التي من المحتمل استرجاعها من الأنسجة (انظر القسم 7.2).
  2. قم بإعداد طبق بتري معقم 35 مم يحتوي على وسط التلقيح الاصطناعي واحتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ O2 و 5٪ CO2. استخدم هذا الطبق لخطوة تعرية البويضات (انظر القسم 9.1).
  3. قم بإعداد طبق بتري معقم 35 مم يحتوي على التلقيح الاصطناعي المتوسط المغطى بالزيت المعدني واحتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ O2 و 5٪ CO2. استخدم هذا الطبق لجمع البويضات بعد خطوة التعرية (انظر القسم 9.4).

3. جمع أنسجة المبيض ونقلها

  1. قم بإجراء الجراحة بالمنظار تحت التخدير العام باستخدام منفذ واحد مقاس 10 مم في السرة ومنفذين مقاس 5 مم ، أحدهما في الربع الأيسر السفلي والآخر على اليمين.
  2. إجراء استئصال المبيض الجزئي أو الكامل من جانب واحد وفقا لقرار الإجماع من طبيب الأورام والجراح والطاقم الطبي لوحدة العلاج المضاد للفيروسات القهقرية بناء على احتياطي المبيض والحجم والجانب العياني لكلا المبيضين (الشكل 1 ، A1-B1) وبروتوكول السمية للغدد التناسلية المخطط له. قم بإجراء استئصال المبيض بمقص حاد أو دعامة جراحية. لا تستخدم أي جهاز تشريح يمكن أن يسبب إصابة جانبية أو كهربائية أو حرارية لأنسجة المبيض المراد الحفاظ عليها.
    ملاحظة: يتم إجراء استئصال المبيض الكامل من جانب واحد بشكل عام في الفتيات قبل البلوغ16،22 ، في حين أن استئصال المبيض الجزئي من جانب واحد يمكن تحقيقه بشكل شائع في المرضى البالغين الذين يعانون من تكاثر المبايض الكبيرة و / أو احتياطي المبيض العالي.

عملية تشريح المبيض والتقطيع. تظهر الصور المبيض ، قطع SAF ، القشرة ، النخاع ، CL.
الشكل 1: حفظ أنسجة المبيض بالتبريد. حفظ أنسجة المبيض بالتبريد في فتاة قبل البلوغ (أ ، مريضة تبلغ من العمر 7 سنوات) وفي امرأة (B ، مريضة تبلغ من العمر 28 عاما) كلاهما يعاني من سرطان الدم النخاعي الحاد. (أ1 - ب 1) منظر بالمنظار للمبيض. (أ2 - ب 2 - ب 3) تشريح أنسجة المبيض. (ب 4) أنسجة المبيض القشرية. CL: الجسم الأصفر. SAF: جريب ضئيل صغير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بإجراء إخلاء أنسجة المبيض باستخدام كيس استرجاع عينات بالمنظار يدويا أو تجاري.
  2. ضع أنسجة المبيض في أنبوب معقم يحتوي على وسط مزرعة عند 4 درجات مئوية. يجب غمر الأنسجة تماما في وسط الثقافة.
  3. انقل أنسجة المبيض على الفور في كيس معزول عند 4 درجات مئوية إلى مختبر العلاج المضاد للفيروسات القهقرية للحصول على أفضل النتائج.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن نقل أنسجة المبيض في درجات حرارة باردة (حوالي 4 درجات مئوية) إلى المختبر لمدة تصل إلى 26 ساعة بعد التجميع دون تهديد جودة الأنسجة23.

4. تحضير أنسجة المبيض

  1. انقل أنسجة المبيض إلى طبق بتري معقم 90 مم يحتوي على 20 مل من وسط المزرعة المبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية.
  2. ضع طبق بتري الذي يحتوي على أنسجة المبيض على صفيحة باردة (عند 4 درجات مئوية) موضوعة على مقعد نظيف عمودي للتدفق الصفحي لتقليل مخاطر تلوث الكائنات الحية الدقيقة.

5. الشفط اليدوي للجريب من عينات أنسجة المبيض

  1. استنشق البصيلات التاجية المرئية (إذا كانت موجودة على سطح أنسجة المبيض) بإبرة حقنة 21 جم متصلة بحقنة 1 مل يمكن التخلص منها.
    ملاحظة: قد تكون هذه الخطوة صعبة. قد يكون البديل هو فتح كل بصيلة غاضية مرئية برفق بمشرط وشطف الجزء الداخلي من كل بصيلة بوسائط التلقيح الاصطناعي من أجل إطلاق COCs برفق داخل وسط التشريح.
  2. اغسل السوائل المسامية المجمعة في طبق بتري معقم مقاس 60 مم يحتوي على 5 مل من وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي في درجة حرارة الغرفة.
  3. اشطف المحقنة ب 1 مل من وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي في درجة حرارة الغرفة واغسل السائل في نفس طبق بتري التلقيح الاصطناعي. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. تحديد وعزل COCs تحت مجهر مقلوب (تكبير 50x-200x).
  5. انقل COCs السليمة باستخدام ماصة إلى طبق بتري معقم جديد مقاس 60 مم يحتوي على وسط أطفال الأنابيب المتوازن مسبقا المغطى بالزيت عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2.
    ملاحظة: تحتوي COCs الصحية على بويضة شفافة. تخلص من COCs الأذينية التي تقدم بويضة بنية اللون.
  6. قم بتخزين طبق بتري التلقيح الاصطناعي في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2 حتى خطوة التعرية (انظر الخطوة 9).

6. تشريح أنسجة المبيض

  1. تحضير محلول التجميد الطازج في أنبوب معقم سعة 50 مل. يحتوي محلول التجميد على 1.5 مليون ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 10٪ من ألبومين المصل البشري في وسط زراعة أطفال الأنابيب. دوامة بلطف.
    ملاحظة: يجب تحضيره قبل الاستخدام مباشرة.
  2. قطع أنسجة المبيض وإزالة النخاع قدر الإمكان (الشكل 1 ، ب 4).
  3. قطع قشرة المبيض إلى شرائح بقياس 10 مم × 10 مم × 1 مم أو 0.5 مم × 0.5 مم × 1 مم في حالة استئصال المبيض من جانب واحد بالكامل أو جزئي ، على التوالي (الشكل 1 ، A2 - B2 - B3). يتم إجراء القطع بمقص حاد جراحي معقم وملقط غير رضحي.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بشريحة واحدة من أنسجة المبيض سليمة مع كل من قشرة المبيض والنخاع لمزيد من التحليل النسيجي (انظر الخطوة 8).
  4. بعد التشريح ، قم بإجراء خطوتي غسيل (أو أكثر ، إذا لزم الأمر) لكل عينة قشرية للمبيض في 1 مل من وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي لإزالة الدم. بعد الغسيل ، انقل جميع عينات المناديل إلى طبق بتري جديد مقاس 60 مم مع وسط ثقافة أطفال الأنابيب الطازج.
  5. ضع كل عينة من قشرة المبيض في أنبوب تبريد يحتوي على 1 مل من محلول التجميد.
    ملاحظة: الخلط غير ضروري. لا يتم حفظ شريحة أنسجة المبيض المحفوظة لمزيد من التحليل النسيجي بالتبريد (انظر الخطوة 8).
  6. احتفظ بالعينات لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتحقيق التوازن مع محلول التجميد.
  7. حفظ جميع العينات بالتبريد بتقنية التجميد البطيء. معدل التبريد هو -2 درجة مئوية / دقيقة من +4 درجة مئوية حتى -9 درجة مئوية ، -50 درجة مئوية / دقيقة حتى -30 درجة مئوية ؛ استمر خلال 1 دقيقة ، +4 درجة مئوية / دقيقة حتى -15 درجة مئوية ، -2 درجة مئوية / دقيقة حتى -40 درجة مئوية ؛ وأخيرا -25 درجة مئوية / دقيقة حتى -150 درجة مئوية باستخدام فريزر قابل للبرمجة.
  8. قم بإزالة الأنابيب المبردة على الفور واغمرها في النيتروجين السائل عند -196 درجة مئوية.
  9. ضع نصف أنابيب التبريد في خزان تخزين النيتروجين السائل الأول والنصف الآخر من أنابيب التبريد في خزان النيتروجين السائل الثاني.

7. عزل COC يدويا عن وسائط التشريح المستهلكة

  1. حدد COCs من وسائط التشريح المستهلكة تحت المجهر (تكبير 50x-200x) (الشكل 2).

مراحل نضوج البويضات. صور مجهرية مع الركام المسمى ، الهالة الإشعاعية ، البويضات الرصينية.
الشكل 2: COCs الناضجة وغير الناضجة المسترجعة من أنسجة المبيض. COCs الناضجة (A) وغير الناضجة (B1-B3 ، C1-C2) التي تم استردادها من أنسجة المبيض. (أ) COC الناضج الذي يحتوي على بويضة ناضجة (وجود الجسم القطبي الأول ، بويضة المرحلة الثانية). (ب 1) COC صحي غير ناضج يحتوي على بويضة غير ناضجة (بدون جسم قطبي ، بويضة المرحلة الأولى). (ب 2 - ب 3) COCs صحية غير ناضجة تحتوي على بويضات غير ناضجة في مرحلة الحويصلة الجرثومية (بدون جسم قطبي ، بويضات المرحلة الأولى). (ج1 - ج2) COCs غير الصحية التي تحتوي على بويضة بنية اللون الأذني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. انقل COCs السليمة باستخدام ماصة إلى طبق بتري معقم جديد مقاس 60 مم يحتوي على وسيط أطفال الأنابيب المتوازن مسبقا المغطى بالزيت عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2 (انظر الخطوة 2.1).
    ملاحظة: تخلص من COCs الكرياتية.
  2. قم بتخزين طبق بتري التلقيح الاصطناعي في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2 حتى خطوة التعرية (انظر الخطوة 9).

8. التحليل النسيجي لأنسجة المبيض

  1. قم بإصلاح الشريحة المتبقية من أنسجة المبيض (التي تحتوي على كل من قشرة المبيض والنخاع) في محلول فورمالين بنسبة 3٪ في مقعد كيميائي نظيف للفحص النسيجي.
    ملاحظة: يجب إجراؤه فقط بمجرد تجميد العينات القشرية وتخزينها بنجاح.
    تنبيه: محلول الفورمالين مزعج وتآكل وسام. يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية وخارج مختبر أطفال الأنابيب.
  2. وصف تحليل نسيجي كامل لعينة أنسجة المبيض هذه مع تقييم الوجود المحتمل للخلايا الخبيثة بالإضافة إلى وصف لعدد ونوع بصيلات المبيض (أي البصيلات البدائية والأولية والثانوية والجراحية ، على التوالي).

9. تعرية البويضات واختيارها

  1. إجراء تعرية البويضات. قم بتعريض COCs لفترة وجيزة لمحلول الهيالورونيداز (80 وحدة دولية / مل أو التركيز النهائي 0.1 مجم / مل) مع سحب العينة اللطيف (الشفط المتكرر وطرد COCs في محلول التعري) باستخدام طرف ماصة كبير القطر (الحجم 0.1-20 ميكرولتر ، الطول: 40.5 مم ، قطر مخروط العمل: 6 مم ، فتحة القطر: 0.36 مم) لمدة 30 ثانية ، تليها مباشرة خطوتان للغسيل في وسط متوازن مسبقا مغطى بالزيت المعدني لإزالة الإنزيم الزائد (انظر الخطوة 2.1).
  2. قم بتحسين إزالة الخلايا الركامية والهالة عن طريق سحب العينة اللطيف باستخدام طرف ماصة 150 ميكرومتر في وسط التلقيح الاصطناعي المتوازن مسبقا (انظر الخطوة 2.1).
  3. قم بإجراء خطوة اختيار من البويضات السليمة باستخدام مجهر مقلوب (تكبير 200x-400x). يمكن أن تكون مرحلة نضج البويضات السليمة هي بويضات GV أو MI أو MII (الشكل 3). تتميز البويضات السليمة بالخصائص المورفولوجية التالية: سيتوبلازم سليم ومستدير ، وحجم يتراوح بين 100-150 ميكرومتر ، ولون شاحب.
    ملاحظة: تخلص من البويضات الرشيقية وغير الصحية (الشكل 3 ، D1-D3).

صور مجهرية لمراحل نضج البويضات. الحويصلة الجرثومية (GV) التي تم تحديدها في بعض الخلايا.
الشكل 3: البويضات الناضجة وغير الناضجة المسترجعة من أنسجة المبيض. (أ) البويضة الناضجة (بويضة المرحلة الثانية: وجود جسم قطبي أول (PB ، سهم) ، لا توجد نواة مرئية) ، (B1-B2) البويضات غير الناضجة (بويضة المرحلة الأولى: لا يوجد جسم قطبي ، لا نواة مرئية) ، (C1-C3) البويضات غير الناضجة (بويضات المرحلة الجرثومية (VG): لا يوجد جسم قطبي ، وجود هالة كبيرة مع نوى داخل السيتوبلازم (السهم)). في C1 ، تظهر بويضات المرحلة الجرثومية حجما غير متجانس. (D1 - D3) البويضات الكريمية. PB: الجسم القطبي. الأصوات العالمية: الحويصلة الجرثومة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. احتضان البويضات السليمة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ O2 و 5٪ CO2 حتى خطوة التزجيج (انظر الخطوة 2.1).

10. تزجيج البويضات

  1. تأكيد تحديد المريض / العينة.
  2. قم بإجراء خطوة اختيار جديدة للبويضات السليمة باستخدام مجهر مقلوب (تكبير 200x-400x).
    ملاحظة: تخلص من البويضات الرشيقية وغير الصحية.
  3. التقط صورة لكل بويضة صحية باستخدام مجهر مقلوب قبل خطوة التزجيج مباشرة. لاحظ مرحلة نضج كل بويضة.
    ملاحظة: إرفاق كل هذه البيانات (الصورة ، الحجم ، مرحلة النضج) في ملف المريض.
  4. استخدم أرقام تعريف مختلفة لكل قشة للتمييز بينها في حالة حفظ أكثر من ماصة واحدة بالتبريد لكل مريض.
  5. حافظ بالتبريد على بويضة واحدة أو اثنتين لكل قشة.
    ملاحظة: يجب حفظ البويضات الناضجة وغير الناضجة القابلة للحياة بالتبريد بشكل منفصل. عند حفظ بويضتين بالتبريد معا في نفس القش ، يوصى باختيار البويضات ذات الخصائص المورفولوجية المماثلة.
  6. حافظ على البويضات الصحية بالتبريد باستخدام مجموعة التزجيج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  7. قم بتحميل البويضات المحفوظة بالتبريد على جهاز مناسب للتخزين بالتبريد في النيتروجين السائل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  8. ضع نصف القش في خزان تخزين النيتروجين السائل الأول والنصف الآخر من القش في خزان نيتروجين سائل ثان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء ما مجموعه 81 فتاة بدون وصفة طبية من 81 مريضة بين عامي 2007 و 2020 ، بما في ذلك 43 فتاة قبل البلوغ و 38 امرأة. كان متوسط عمر المريضات (الفتيات والنساء قبل البلوغ) 14.21 ± 9.61 سنة (متوسط ± الخطأ المعياري). كان أصغر مريض يبلغ من العمر 5 أشهر وأكبرهم يبلغ من العمر 33.6 عاما (الجدول 1). كان متوسط عمر الفتيات والنساء قبل البلوغ 6.84 ± 4.81 سنة (الحد الأدنى - الحد الأقصى: 0.5-15.1) و 22.76 ± 5.92 سنة (الحد الأدنى - الحد الأقصى: 14.2-33.6) ، على التوالي (مان ويتني ، ص = 3.37 × 10-10).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر المخطوطة الحالية بروتوكولا يجمع بين تجميد أنسجة المبيض وحفظ البويضات المسترجعة بالتبريد من أنسجة المبيض ، مما يزيد من احتمالية الخصوبة لدى الفتيات قبل البلوغ والنساء المعرضات لخطر الإصابة ب POI. نوصي بشدة بتنفيذ هذا البروتوكول قبل بدء أي علاج سام للغدد التناسلية من أجل تحسين الكمية (أي عدد البويضات القابلة للحياة) بالإضافة إلى الجودة (أي سلامة الحمض النووي وكفاءة السيتوبلازم) للبويضات المحفوظة ، وتحسين سلامتها للاستخدام السريري24. إذا لم يكن من الممكن تنفيذ ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى أي من المؤلفين مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر جميع أعضاء مراكزنا المشاركين في نشاط الحفاظ على الخصوبة (أطباء أمراض النساء وعلماء الأحياء وأطباء الأورام وأخصائيي تشريح الأمراض). أجريت الدراسة كجزء من الإجراءات الروتينية للحفاظ على الخصوبة. ولم يتلق أي تمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل حقنة يمكن التخلصمنها CDD1323101 / 7002655قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
إبرة حقنة قياس21Merck Z192481قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
35 مم IVF Petri DishNunc150255قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
60 مم IVF Petri DishNunc150270تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا تكون مناسبة
90 مم التلقيح الاصطناعي بتري طبقNunc150360قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
ملقط غير رضحيMedlanePI 299 04قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
ثقافة واحدة مستمرة كاملة مع HSAIrvine Scientific90165وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي لجمع السوائل الجرابية وحضانة COCs وتعرية البويضات وحضانة البويضات حتى خطوة التزجيج.
CryotubeThermo Scientific368632قد تكون المنتجات الأخرى مناسبة أيضا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)MILTENYI BIOTEC SAS170-076-303CryoMACS DMSO 10 (EP)
GT40Air Liquide1،13،517خزان
تخزين HSV قش تزجيج عالي الأمانإيرفين Scientific25251قش التزجيج البشري
Vitrolife10064قد تكون المنتجات الأخرى مناسبة أيضا
Leibovitz L15 mediumEurobioCM1L15000UCulture Medium لجمع أنسجة المبيض ونقلها وتشريح
الأنسجة Leibovitz L15 mediumEurobioCM1L15000UCulture medium لمحلول
تجميد Mars-IVF Class II Workstation / L126 IVF DualCooperSurgicalWM1500 / 6-133-911-121محطة عمل
الفريزر القابل للبرمجةKRYO 500Kryo 560-16قد تكون المعدات الأخرى مناسبة أيضا
مقص بشفرات مستقيمة حادة ونقاط حادةMedlaneCI 034 03قد تكون المواد والأحجام الأخرى مناسبة أيضا
متجردCooperSurgicalMXL3-STR-CGRقد تكون المنتجات الأخرى مناسبة أيضا
نصائح (150 & micro ؛ م) للمتجردCooperSurgicalMXL3-150قد تكون المنتجات الأخرى مناسبة أيضا
مجموعة التزجيجIrvine Scientific90133في http://www.irvinesci.com/products/90133-so-vitrification-freeze-solutions. قد تكون المنتجات الأخرى مناسبة أيضا
قد مخطط بدقة تتوفر بروتوكولات

المراجع

  1. Ataman, L. M., et al. Creating a global community of practice for oncofertility. Journal of Global Oncology. 2 (2), 83-96 (2016).
  2. Rivas Leonel, E. C., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
  3. Chae-Kim, J. J., Gavrilova-Jordan, L. Premature ovarian insufficiency: procreative management and preventive strategies. Biomedicines. 7 (1), (2018).
  4. Anderson, R. A., Wallace, W. H. B., Telfer, E. E. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation: clinical and research perspectives. Human Reproduction Open. 2017 (1), (2017).
  5. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  6. Lambertini, M., et al. Ovarian suppression using luteinizing hormone-releasing hormone agonists during chemotherapy to preserve ovarian function and fertility of breast cancer patients: a meta-analysis of randomized studies. Annals of Oncology. 26 (12), 2408-2419 (2015).
  7. Gubbala, K., et al. Outcomes of ovarian transposition in gynaecological cancers; a systematic review and meta-analysis. Journal of Ovarian Research. 7, 69(2014).
  8. Poirot, C., et al. Induction of puberty by autograft of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 379 (9815), 588(2012).
  9. Ernst, E., Kjaersgaard, M., Birkebaek, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. European Journal of Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  10. Pacheco, F., Oktay, K. Current success and efficiency of autologous ovarian transplantation: a meta-analysis. Reproductive Sciences. 24 (8), 1111-1120 (2017).
  11. Silber, S., Kagawa, N., Kuwayama, M., Gosden, R. Duration of fertility after fresh and frozen ovary transplantation. Fertility and Sterility. 94 (6), 2191-2196 (2010).
  12. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  13. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertility and Sterility. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  14. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  15. Abir, R., et al. Occasional involvement of the ovary in Ewing sarcoma. Human Reproduction. 25 (7), 1708-1712 (2010).
  16. Abir, R., et al. Cryopreservation of in vitro matured oocytes in addition to ovarian tissue freezing for fertility preservation in paediatric female cancer patients before and after cancer therapy. Human Reproduction. 31 (4), 750-762 (2016).
  17. Abir, R., et al. Ovarian minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia. Reproductive BioMedicine Online. 28 (2), 255-260 (2014).
  18. Dolmans, M. M., Luyckx, V., Donnez, J., Andersen, C. Y., Greve, T. Risk of transferring malignant cells with transplanted frozen-thawed ovarian tissue. Fertility and Sterility. 99 (6), 1514-1522 (2013).
  19. Soares, M., et al. Eliminating malignant cells from cryopreserved ovarian tissue is possible in leukaemia patients. The British Journal of Haematology. 178 (2), 231-239 (2017).
  20. Son, W. Y., Henderson, S., Cohen, Y., Dahan, M., Buckett, W. Immature oocyte for fertility preservation. Frontiers in Endocrinology. 10, 464(2019).
  21. Yang, Z. Y., Chian, R. C. Development of in vitro maturation techniques for clinical applications. Fertility and Sterility. 108 (4), 577-584 (2017).
  22. Imbert, R., et al. Safety and usefulness of cryopreservation of ovarian tissue to preserve fertility: a 12-year retrospective analysis. Human Reproduction. 29 (9), 1931-1940 (2014).
  23. Duncan, F. E., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction. 152 (6), 201-210 (2016).
  24. Abir, R., et al. Selection of patients before and after anticancer treatment for ovarian cryopreservation. Human Reproduction. 23 (4), 869-877 (2008).
  25. Yasui, T., et al. Factors associated with premature ovarian failure, early menopause and earlier onset of menopause in Japanese women. Maturitas. 72 (3), 249-255 (2012).
  26. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  27. Mohsenzadeh, M., Salehi-Abargouei, A., Tabibnejad, N., Karimi-Zarchi, M., Khalili, M. A. Effect of vitrification on human oocyte maturation rate during in vitro maturation procedure: A systematic review and meta-analysis. Cryobiology. 83, 84-89 (2018).
  28. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  29. Revel, A., et al. At what age can human oocytes be obtained. Fertility and Sterility. 92 (2), 458-463 (2009).
  30. Margulis, S., et al. morphogenetic protein 15 expression in human ovaries from fetuses, girls, and women. Fertility and Sterility. 92 (5), 1666-1673 (2009).
  31. Kedem, A., et al. Alginate scaffold for organ culture of cryopreserved-thawed human ovarian cortical follicles. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (9), 761-769 (2011).
  32. Lerer-Serfaty, G., et al. Attempted application of bioengineered/biosynthetic supporting matrices with phosphatidylinositol-trisphosphate-enhancing substances to organ culture of human primordial follicles. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1279-1288 (2013).
  33. Ben-Haroush, A., Sapir, O., Fisch, B. Aspiration of immature oocytes during cesarean section for fertility preservation and future surrogacy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (1), 12-14 (2010).
  34. Farhi, J., Sapir, O., Maman, M., Fisch, B., Ben-Haroush, A. Novel protocol for scheduling oocyte retrieval in IVM cycles in PCOS patients: a case series. Reproductive BioMedicine Online. 23 (6), 765-768 (2011).
  35. Segers, I., et al. In vitro maturation (IVM) of oocytes recovered from ovariectomy specimens in the laboratory: a promising "ex vivo" method of oocyte cryopreservation resulting in the first report of an ongoing pregnancy in Europe. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1221-1231 (2015).
  36. Ellenbogen, A., Shavit, T., Shalom-Paz, E. IVM results are comparable and may have advantages over standard IVF. Facts, Views & Vision in ObGyn. 6 (2), 77-80 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة