مقالة منهجية

التعبير غير المتجانس والتحليل الوظيفي لمستقبلات رائحة الزاعجة المصرية للروائح البشرية في بويضات Xenopus

DOI:

10.3791/61813

⸱

يونيو 8, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول يميز وظيفيا أو البعوض استجابة للروائح البشرية باستخدام نظام تعبير البويضات Xenopus إلى جانب مشبك جهد ثنائي القطب ، مما يوفر تقنية جديدة قوية لاستكشاف استجابات البعوض أو التعرض للروائح البشرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر البعوضة الزاعجة المصرية (Linnaeus)، وهي ناقل للعديد من الأمراض البشرية الهامة بما في ذلك الحمى الصفراء وحمى الضنك وحمى الضنك وحمى زيكا، تفضيلا قويا للمضيفين البشريين على الأخرى ذوات الدم الحار لوجبات الدم. تلعب الإشارات الشمية دورا مهما للبعوض أثناء استكشافه لبيئته والبحث عن مضيف بشري للحصول على وجبات الدم ، وبالتالي نقل الأمراض البشرية. من المعروف أن مستقبلات الرائحة (ORs) المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية الشمية مسؤولة عن تفاعل نواقل البعوض مع الروائح البشرية. لاكتساب رؤى أعمق حول فسيولوجيا الشم في Ae. aegypti والتحقيق في تفاعلاتهم مع البشر على المستوى الجزيئي ، استخدمنا بروتوكولا محسنا للتعبير غير المتجانس ل Xenopus Ovcytes للتحليل الوظيفي Ae. مستقبلات الرائحة المصرية استجابة للروائح البشرية. يتم تقديم ثلاثة أمثلة على التجارب: 1) استنساخ وتوليف cRNAs من ORs والمستقبلات المشتركة لمستقبلات الرائحة (Orco) من أربعة إلى ستة أيام Ae. aegypti الهوائيات. 2) الحقن المجهري والتعبير عن ORs و Orco في بويضات Xenopus ؛ و 3) تسجيل تيار الخلية الكاملة من بويضات Xenopus التي تعبر عن البعوض ORs / Orco بمشبك جهد ثنائي القطبين. توفر هذه الإجراءات المحسنة طريقة جديدة للباحثين للتحقيق في استقبال الرائحة البشرية في بعوض الزاعجة والكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم نشاطهم في البحث عن المضيف على المستوى الجزيئي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تنقل بعوضة الحمى الصفراء Ae. aegypti العديد من الأمراض الفتاكة بما في ذلك الحمى الصفراء وحمى الضنك وحمى زيكا ، مما يسبب ضائقة هائلة وخسائر في الأرواح. يستخدم البعوض إشارات متعددة مثل ثاني أكسيد الكربون2 ورائحة الجلد وحرارة الجسم لتحديد موقع مضيفيه1. بالنظر إلى أن كلا من البشر ذوات الدم الحار ينتجون ثاني أكسيد الكربون2 ولديهم درجات حرارة جسم متشابهة ، يبدو من المحتمل أن الأنثى Ae. aegypti تعتمد بشكل أساسي على رائحة الجلد لتمييز المضيف2. هذا يخلق صورة معقدة ، مع دراسة مبكرة واحدة تعزل أكثر من 300 مركب من انبعاث الجلدالبشري 3. أشارت المزيد من المقايسات السلوكية إلى أن عددا من هذه المركبات تثير استجابات سلوكية في Ae. egypti4،5،6،7 ، ولكن كيف يكتشف البعوض هذه المركبات بالضبط لا يزال غير معروف إلى حد كبير. حددت الأبحاث الحديثة التي أجرتها مجموعتنا العديد من الروائح البشرية التي قد تكون متورطة في Ae. aegypti نشاط البحث عن المضيف ، على الرغم من أن أدوارها لم يتم تأكيدها بعد من خلال المزيد من المقايسات السلوكية8. كيف يتم فك تشفير هذه الروائح البشرية الأساسية في النظام الحسي المحيطي ل Ae. aegypti لم يتم تحديدها بعد.

تكتشف الحشرات الروائح من خلال الحس الكيميائي على الزوائد الشمية. داخل كل من الحساسيات ، يتم التعبير عن مستقبلات حاسة الشم المختلفة ، بما في ذلك مستقبلات الرائحة (ORs) والمستقبلات المؤثرة للأيونات (IRs) والمستقبلات الذوقية (GRs) ، على غشاء الخلايا العصبية الحسيةالشمية 9. هذه الغرف مسؤولة عن استشعار العديد من الروائح التي تواجهها الحشرات ، وخاصة الروائح المرتبطة بالطعام والمضيفين وشركاء التزاوج10،11،12،13. وجدت دراسة سابقة تركز على إزالة الأيتام من وظيفة ORs في Anopheles gambiae باستخدام نظام تعبير Xenopus إلى جانب مشبك جهد ثنائي القطب أن Anopheles ORs مضبوطة بشكل خاص على العطريات التي تعد المكونات الرئيسية في الانبعاثات البشرية14. حددت دراسة الجينوم الحديثة ما يصل إلى 117 جينا من جينات OR في Ae. egypti15. وبالتالي ، فإن طريقة لمعالجة وظائف هذه الزاعجة بشكل منهجي استجابة للروائح المهمة بيولوجيا أو بيئيا مثل الروائح البشرية أو محفزات وضع البيض من شأنها أن توفر معلومات مفيدة لأولئك الذين يسعون إلى فهم المزيد من البيئة الكيميائية أو علم الأعصاب ل Ae. aegypti.

تم تطوير تقنية مشبك الجهد ثنائي القطب (TEVC) في الأصل لفحص وظيفة القنوات الأيونية الغشائية في منتصف التسعينيات16،17. منذ ذلك الحين ، تم استخدام TEVC للتحقيق في ORs من عدد من أنواع الحشرات المختلفة14،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32، 33،34. ساهم هذا الفحص الوظيفي للغرف بشكل كبير في الإجابة على الأسئلة البيئية المهمة في الحشرات ، بما في ذلك: 1) كيف تحدد الحشرات مصادر الغذاء؟ 2) كيف تنجذب إلى الفيرومونات الجنسية المتطايرة التي يطلقها شركاؤهم في التزاوج؟ 3) كيف يجدون موقعا مثاليا لوضع البيض لذريتهم؟ و 4) هل هناك أي مركبات ، مشتقة من النباتات أو اصطناعية ، يمكنها حماية البشر بكفاءة من الحشرات القارضة؟ الإجابات على هذه الأسئلة ضرورية للسيطرة على نواقل الأمراض المهمة مثل البعوض.

كما تم استخدام عدد من الأساليب الأخرى ، بما في ذلك تلك القائمة على خط خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) ، وذبابة الفاكهة نظام الخلايا العصبية الفارغة ، ونوكليز إصبع الزنك ، والنوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ ، ونظام تحرير الجينات CRISPR / Cas9 ، في الدراسات الوظيفيةOR 12،20،35،36،37. ومع ذلك ، تتطلب جميع هذه التقنيات مهارات عالم الأحياء الجزيئية المتمرس وتنطوي على العديد من العوامل المربكة المحتملة. تعبير TEVC / البويضة قادر على قياس تيارات المستقبلات التي تثيرها الرائحة والتوصيل الأيوني مباشرة وله ميزة إضافية تتمثل في وقت الإعداد السريع المطلوب للتعبير عن المستقبلات من الحمض النووي الريبي. في هذه الدراسة ، استخدمنا TEVC لفحص استجابات Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) ضد العديد من الروائح ذات الأهمية البيولوجية المحتملة ، وكشفوا أن البويضات المعبر عنها باستخدام AaegOR55 • AaegOrco أظهرت استجابة تعتمد على الجرعة لرائحة البنزالديهايد البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على بروتوكول هذا الإجراء ، رعاية واستخدام المختبر ، ومراقبته (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة أوبورن: البروتوكول المعتمد # 2016-2987).

ملاحظة: يعد تخليق الجينات المخصص بديلا قابلا للتطبيق لاستنساخ جينات البعوض أو البعوض.

1. جمع الزوائد البعوضية والشمية (الهوائيات)

  1. حافظ على Ae. aegypti البعوض (تم الحصول عليه من الدكتور جيمس بيكنيل ، وزارة الزراعة الأمريكية ، ARS ، وحدة أبحاث البعوض والذباب) عند 25 ± 2 درجة مئوية وفترة ضوئية 12: 12 (L: D) h (الأضواء في الساعة 8 صباحا).
  2. تخدير ~ 800 أنثى بعوض عمرها 4-6 أيام بدون تغذية الدم باستخدام ثاني أكسيد الكربون2. اقطع هوائيات البعوض (الأنسجة الشمية) تحت المجهر (40x) باستخدام مقص واجمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل محفوظ على الثلج الجاف.
    ملاحظة: يمكن تخزين الهوائيات المجمعة في الفريزر عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

2. أو الاستنساخ من هوائيات Ae. aegypti

  1. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من الهوائيات باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي الكلي المتوفرة تجاريا باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. استيعاب الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام المجموعة التجارية الخالية من الحمض النووي لإزالة DNase والأيونات الأخرى باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. قم بتجميع (كدنا) من 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي باستخدام نظام توليف Oligo d (T) 20 SuperScript IV First-Strand13،30.
  4. تصميم بادئات PCR لجينات OR وفقا للتسلسلات المتوفرة في VectorBase (https://www.vectorbase.org/) والمتطلبات الخاصة لموقع قطع الإنزيم. أضف تسلسل Kozak (GCCACC) ، الذي يبدأ الترجمة في معظم الكائنات حقيقية النواة ، بين موقع القطع وكودون البداية في كل كتاب تمهيديأمامي 30.
  5. استنساخ تسلسلات ترميز جينات OR بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات خاصة بالجينات تحتوي على مواقع نوكلياز داخلي مقيدة وتسلسل Kozak باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  6. اكتشف منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال جل الاغاروز بنسبة 1٪ وقم بتنقيتها باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  7. إجراء بناء البلازميد المؤتلف من خلال استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في ناقل pT7Ts بعد الهضم بواسطة إنزيمات التقييد التي تتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تحقق من البلازميدات المؤتلفة عن طريق تسلسل Sanger وقم بالتأكيد باستخدام قاعدة بيانات VectorBase.

3. توليف الحمض النووي الريبي

  1. خطي البلازميدات المبنية باستخدام إنزيم (إنزيمات) تقييد محددة.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحمض النووي البلازميدي خطيا بإنزيم تقييد في اتجاه مجرى الجين المراد نسخه.
  2. استخدم البلازميدات الخطية لتصنيع cRNAs مع مجموعة T7 التجارية بعد الوصف السابق13،30.
  3. قم بخلط cRNA من OR و Orco (1: 1) في أنبوب طرد مركزي وقم بتقسيم الحمض النووي الريبي المرمض النووي الريبي المختلط إلى حجم 2 ميكرولتر (250 نانوغرام / ميكرولتر / لكل منهما) لكل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتخزين الحمض النووي الريبي المفصل عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

4. مجموعة Xenopus Oocyte

ملاحظة: يتبع الإجراء تعليمات شنايدر وآخرون 38.

  1. قم بتخدير Xenopus laevis لمدة 20-30 دقيقة في 1 لتر من الماء فائق النقاء مع 1 جم من ملح إيثيل m-aminobenzoate methanesulfonate (الشكل 1 أ). قرصة أحد أصابع الضفدع باستخدام الأصابع ؛ إذا لم يكن هناك استجابة ، يتم تخدير الضفدع بدرجة كافية وجاهز للجراحة. انقل الضفدع المخدر على قاع الجليد.
  2. الجراحة
    1. افركي المنطقة البطنية للضفدع بمحلول بوفيدون اليود بنسبة 10٪ وامسح المحلول بكرات قطنية نظيفة. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
    2. قم بعمل شق صغير في البطن (10-15 مم ، الشكل 1 ب) بمشرط يمكن التخلص منه. تخترق الجلد ، طبقة اللفافة العضلية بشكل منفصل. يقع الشق في الجزء السفلي من البطن ، بشكل جانبي إلى خط الوسط.
      ملاحظة: لا تؤذي الأعضاء الداخلية.
    3. أمسك أجزاء من فصوص المبيض بالملقط واسحبها إلى الخارج برفق. ارفع المبيض واقطعه على مستوى جدار الجسم بالمقص. كرر عدة مرات حتى تحصل على ما يكفي من مواد المبيض (~ 200 بيضة ، الشكل 1 ج). انقل مواد المبيض إلى محلول غسيل (96 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 5 ملي مللي كلوريد2 • 6 ساعات2درجة ، 5 ملي مللي ملح الصوديوم HEPES ، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، درجة الحموضة 7.6).
    4. أغلق جروح الجراحة (العضلات والجلد) بخيوط قابلة للامتصاص تتحلل عادة وتسقط بشكل طبيعي في غضون 10-14 يوما.
    5. بعد كل عملية جراحية ، ضع الضفدع في 1 لتر من محلول التعافي (يحتوي على 3.4 جم من ملح التعليب والتخليل و 2 جم من ملح البحر الفوري للمحيط) حتى يستيقظ ثم أعده مرة أخرى إلى منشأة الضفدع.
      ملاحظة: يمكن إجراء ما يصل إلى 4 عمليات جراحية على كل ضفدع. يجب أن يكون الفاصل الزمني لتشغيل كل ضفدع أكثر من 2 أشهر.
  3. الهضم غير الأنزيمي وزراعة البويضات
    1. افصل البويضات (~ 200 بيضة ، الشكل 1 ج) إلى قطع صغيرة.
    2. انقل جميع البويضات إلى محلول هضم ، بما في ذلك 10 مل من محلول الغسيل (القسم 4.2.3) و 2 مجم / مل من الكولاجيناز B لمدة 40-60 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة من أجل إزالة طبقات الخلايا المسامية. فحص العينات تحت المجهر لتحديد ما إذا كان 80٪ من البويضات قد تم نزع فتيل منها بالكامل ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فتحقق كل 10 دقائق حتى تصبح معظم البويضات جاهزة.
    3. اشطف البويضات بمحلول 1x Ringer (96 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 5 ملي ملليجرام كلوريد2 ·6 ساعات2درجة ، 5 ملي ملح الصوديوم HEPES ، درجة الحموضة 7.6) ، محلول الغسيل (القسم 4.2.3) ، محلول بارث الملحي المعدل (78 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي كلوريد كولوريد ، 0.33 ملي كالسيوم (NO3) 2 · 4 ساعة2O ، 0.41 ملي CaCl2 · 2 ساعة2O ، 0.82 ملي مولار MgSO4 ·7H2O ، 2.4 ملي NaHCO3 ، 10 ملي مولار ملح الصوديوم HEPES ، 1.8 ملي بيروفات الصوديوم ، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 10 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، درجة الحموضة 7.6) بالتسلسل (5 مرات لكل مخزن مؤقت ، باستخدام 10 مل في كل مرة). شطف البويضات على نطاق واسع باستخدام مخازن مؤقتة لإزالة البويضات غير الناضجة وذات الجودة الرديئة.
    4. حصاد البويضات في المرحلة الخامسة والسادسة وفقا لتصنيف دومونت. انقل البويضات الصحية / عالية الجودة في المرحلة V-VI مع تقسيم أبيض / داكن واضح وعدم وجود ضرر واضح بصريا (الشكل 1D) إلى طبق بتري مقاس 100 مم × 15 مم يحتوي على محلول ملحي بارث معدل (القسم 4.3.3). تخلص من البويضات ذات الجودة الرديئة (الشكل 1E). الحفاظ على البويضات المهضومة في غرف نمو الحشرات عند 18 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل الحقن المجهري.

5. الحقن المجهري للحمض النووي الريبي والتعبير عن مستقبلات الرائحة (ORs) والمستقبلات المشتركة (Orco) في بويضات Xenopus

  1. ضع مصفوفة معدنية في طبق بتري مقاس 100 مم × 15 مم ، مع إضافة محلول بارث الملحي المعدل (القسم 4.3.3) حتى يتم غمر المصفوفة. انقل البويضات على المصفوفة ، وتخلص من البويضات التي لا تلبي الحجم. رتب البويضات مع الأعمدة النباتية على الجانب العلوي (الشكل 1F).
  2. اسحب شعيرات دموية زجاجية جديدة (1.0 مم OD × 0.5 مم ID، الطول = 100 مم) لكل عينة باستخدام مجتذب الأنابيب الدقيقة (الحرارة = 525، السحب = 50، السرعة = 50، الوقت = 250) وشحذها باستخدام شطوف ماصة دقيقة بزاوية 25 درجة. قم بتركيب الأنبوب الشعري على حاقن النانولتر.
  3. قبل الحقن ، قم بإزالة أنبوب واحد من الحمض النووي الريبي الممزوج مسبقا من OR و Orco (القسم 3.3) من الفريزر وضعه على الثلج حتى يذوب تماما. املأ الأنبوب الشعري بخليط OR / Orco بالضغط على زر التعبئة الخاص بحاقن النانولتر.
  4. حقن 10 نانوغرام (5 نانوغرام أو + 5 نانوغرام أوركو ؛ ~ 20 نانولتر) من الحمض النووي الريبي الممزوج مسبقا لكل بويضة باستخدام حاقن نانولتر في محطة خالية من الحمض النووي الريبي. (الشكل 1F).
    ملاحظة: قبل الحقن ، نضغط على الزر EMPTY لتفريغ القليل من الخليط لضمان عدم انسداد الأنبوب الشعري. الانتظار لمدة 5 ثوان للسماح ل cRNAs بدخول البويضة تماما.
  5. بعد الحقن ، قم بتخزين البويضات على صفيحة مزرعة خلوية معقمة مكونة من 24 بئرا مع محلول بارث الملحي المعدل عند 18 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام قبل تسجيل الخلية الكاملة.

6. تسجيل التيار للخلية الكاملة باستخدام نظام مشبك الجهد ثنائي القطب (الشكل 2)

  1. قبل تسجيل مشبك الجهد ثنائي القطب ، قم بإذابة مركبات الرائحة الفردية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للحصول على سلسلة من محاليل المخزون (100 ميكروغرام / ميكرولتر). قم بتخفيف محاليل المخزون هذه باستخدام 1x ND96 عازلة (91 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 1.8 ملي كلوريدأمبير 2 · 2 ساعة2درجة ، 2 ملي ملي ملليجرام كلوريد2 6 ساعة2درجة ، 5 ملي مولار ملح الصوديوم HEPES ، درجة الحموضة 7.6) 1000 أضعاف للحصول على مجموعة من محاليل العمل (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. تأكد من أن كل شيء على طاولة عزل الاهتزاز TMC ، بما في ذلك الدرع المعدني والمجهر ومصدر الضوء ومضخة النفايات ، مؤرض بعناية لتقليل تأثير الضوضاء الكهربائية الخارجية على تسجيل إشارة الخلية بأكملها.
  3. قم بإعداد أقطاب كهربائية دقيقة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية (1.20 مم OD × 0.94 مم ID، الطول = 750 مم) باستخدام مجتذب الأنابيب الدقيقة (الحرارة = 525، السحب = 50، السرعة = 50، الوقت = 250). املأ الشعيرات الدموية ب 3 M KCl. قم بالكلور في أسلاك Ag / AgCl لمدة 2-5 دقائق في مبيض الكلور بنسبة 10٪ حتى تتحول إلى اللون الرمادي الداكن (يجب أن تكون أسلاك Ag / AgCl الرمادية الباهتة مكلورة).
  4. قم بتشغيل الجهاز عن طريق تشغيل Ovcyte Clamp و Digidata Digitizer (الشكل 3 أ). افتح البرنامج (على سبيل المثال ، Clampex 10.3) وانقر فوق الزر تسجيل . قم بتشغيل المفتاح الخاص بالمخزن المؤقت 1x ND96 (القسم 6.1) والمضخة للمخزن المؤقت للنفايات.
  5. قم بإجراء اختبار مسبق عن طريق إدخال أقطاب كهربائية دقيقة في المخزن المؤقت المتدفق ثم الضغط على زر اختبار القطب الكهربائي Vm وزر اختبار القطب الكهربائي Ve للتحقق من مقاومة الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يجب أن تكون Vm < 40 mV و Ve يجب أن تكون < 40 μA. قم بإيقاف تشغيل تدفق المخزن المؤقت 1x ND96 (القسم 6.1) ومضخة النفايات بعد الاختبار المسبق.
  6. ضع كل بويضة في غرفة التروية (الشكل 2) المملوءة بمخزن مؤقت 1x ND96 (القسم 6.1) وضع البويضات برفق مع مواجهة الأعمدة النباتية لأعلى بواسطة اليرقة الزجاجية. أدخل الأقطاب الكهربائية ببطء في البويضة (الشكل 3 ب). اضبط المعلمة Vm على 0 ثم المعلمة Ve إلى 0. قم بتغيير زر المشبك من إيقاف التشغيل إلى FAST. اضبط زر الكسب على ~ -80 مللي فولت.
  7. تحقق من قيمة Ve ، والتي يجب أن تكون ثابتة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فهناك تسرب في واحد على الأقل من القطبين الدقيقين. إذا حدث هذا ، فاستبدل أي مكونات معيبة بشعيرات دموية جديدة.
  8. سجل تيارات الخلية الكاملة من البويضات المحقونة بمشبك البويضة عند إمكانية الاحتفاظ ~ −80 مللي فولت (الشكل 2).
  9. إجراء الحصول على البيانات وتحليلها.
    1. استأنف تدفق المخزن المؤقت 1x ND96 (القسم 6.1) وقم بتشغيل مضخة النفايات.
    2. تطبيق محلول الرائحة عبر نظام التروية: قم بإيقاف تشغيل المخزن المؤقت 1x ND96 (القسم 6.1) وقم بتدفق محلول الرائحة لمدة 10 ثوان. ثم سجل قيمة الذروة. للحصول على استجابة OR لرائحة الاختبار ، اطرح قيمة خط الأساس من قيمة الذروة.
    3. أوقف تدفق محلول الرائحة وانتقل إلى المخزن المؤقت 1x ND96 (القسم 6.1). اغسل البويضة باستخدام المخزن المؤقت حتى يتعافى الأثر الحالي من تحفيز الرائحة السابق. ثم تكون البويضة جاهزة للتحفيز بمحلول رائحة آخر. بشكل عام ، يمكن استخدام بويضة واحدة للكشف عن 20-30 تحفيزا كيميائيا.
      ملاحظة: عند اختبار الاستجابة المعتمدة على التركيز ، يجب دائما تطبيق أدنى تركيز أولا قبل الانتقال إلى التركيزات الأعلى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام تقنية تسجيل الحسم الفردي (SSR) ، حددنا مؤخرا الروائح البشرية التي يعتقد أنها مهمة ل Ae. aegypti سلوك البحث عن المضيف8. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية التي تقود عملية استشعار الروائح البشرية في النظام الحسي المحيطي ل Ae. aegypti لا تزال غير معروفة. تلعب ORs دورا مهما في الكشف عن ترابط الرائحة في معظم الحشرات10،11،12. لأداء وظيفتها ، يجب التعبير عن كل OR بشكل مشترك مع Orco لتشكيل ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TEVC هي تقنية كلاسيكية تستخدم على نطاق واسع لفحص وظيفة مستقبلات الغشاء. على الرغم من أن بروتوكولا مفصلا قد تم نشرهبالفعل 43 يشترك في تشابه كبير مع الإجراء المقدم هنا ، إلا أن الطريقة المقترحة هنا تقدم بعض التعديلات المهمة. على سبيل المثال ، هنا ، يتم خلط الحمض النووي الريبي لكل من OR و Orco مسبقا وتقسيسه في عينات صغيرة الحجم مباشرة بعد التوليف وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها بدلا من مزجها بشكل منفصل على البارافيلم مباشرة قبل الحقن43

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع بجائزة من محطة التجارب الزراعية في ألاباما (AAES) Multistate / Hatch Grants ALA08-045 و ALA015-1-10026 و ALA015-1-16009 إلى NL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة ثقافة الخلايا ذات 24 بئرCytoOneCC7682-7524تستخدم لزراعة البويضات
الضفدع الأفريقي المخالبNascoLM00535تستخدم لحصاد بويضات Xenopus
Ag / AgCl القطب الكهربائي الأسلاكWarner Instruments64-1282المستخدمة للأقطاب الكهربائية الدقيقة
Clampex 10.3AxonNA.تستخدم لتسجيل الإشارات
Clampfit 10.3شركة Axon Instruments Inc.ن.تستخدم لتحليل البيانات
كولاجيناز بسيجما11088815001يستخدم لهضم البويضات
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440Aيستخدم للحصول على البيانات
E.Z.N.A. طقم صغير للحمض النووي البلازميدأوميغاD6942-01يستخدم لتحضير البلازميد
ملح إيثيل إم أمينوبنزوات ميثان سولفوناتسيجما886-86-2يستخدم لتخدير الضفادع
الزجاج الشعيرات الدمويةFHC30-30-1تستخدم للحقن المجهري
الزجاجيةالشعرية Warner Instruments64-0801تستخدم لإعداد الأقطاب الكهربائية
الدقيقة GyroMini Nutating MixerLabnetS0500تستخدم لهضم البويضات
غرف نمو الحشراتمنتجات كارونموديل 6025تستخدم لحضانة البويضات
Leica MicroscopeLeicaS6 Dتستخدم لقطع هوائيات البعوض
مصدر الضوءSchottA20500توفير مصادر الضوء للمراقبة
الحامل المغناطيسيNarishigeGJ-1يستخدم لعقد القطب المرجعي
MicromanipulatorLeica115378تستخدم للحركة الطفيفة للقطب
الكهربائي مجتذب الأنابيب الدقيقةنموذج SutterP-97يستخدم لسحب الشعيرات الدموية
الماصة الدقيقة شطفنموذج Sutter BV-10تستخدم لشحذ الشعيرات الدموية
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344تستخدم لتصنيع حاقن cRNA
Nanoject II Auto-NanoliterDrummond3-000-204تستخدم للحقن الدقيق
Oligo d (T) 20-primed SuperScript IV أول حبلا نظامتوليف Invitrogen18091050 المستخدمة ل توليف (كدنا)
أوليمبوس مجهرأوليمبوسSZ61يستخدم للحقن المجهري
طلقة واحدة TOP10 خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائياC404003 Invitrogenتستخدم لتحويل
مضخم مشبك البويضةموديل وارنر إنستروكرتسOC-725Cتستخدم لتسجيل TEVC
طقم استخراج هلام سريعQiagen28704يستخدم للهلام تنقية
TMC طاولة عزل الاهتزازTMC63-500تستخدم لعزل الاهتزاز من المعدات مجموعة
TURBO الخالية من الحمض النوويInvitrogenAM1907تستخدم لإزالة DNase والأيونات الأخرى في الحمض النووي الريبي
أوليمبوس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus cRNA Orco
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة