مقالة منهجية

مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد

DOI:

10.3791/61824

⸱

ديسمبر 10, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو تنفيذ ثقافة مشتركة ديناميكية من الضامة البشرية و myofibroblasts في سقالات كهربائية أنبوبية للتحقيق في تجديد الأنسجة التي تحركها المواد ، وذلك باستخدام مفاعل حيوي يمكن من فصل إجهاد القص والتمدد الدوري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام المواد الحيوية القابلة للتك00 للحث على التجديد مباشرة في الجسم هو استراتيجية جذابة من منظور تحويلي. هذه المواد تحفز استجابة التهابية عند الزرع ، وهو المحرك لإعادة امتصاص المواد اللاحقة وتجديد الأنسجة الجديدة. هذه الاستراتيجية، والمعروفة أيضا باسم هندسة الأنسجة في الموقع، يتم اتباعها للحصول على بدائل القلب والأوعية الدموية مثل ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة. يتم تحديد كل من العمليات الالتهابية والتجددية من خلال الإشارات الميكانيكية الحيوية المحلية على السقالة (أي إجهاد التمدد والقص). هنا، ونحن نصف بالتفصيل استخدام مفاعل حيوي وضعت خصيصا التي تمكن بشكل فريد من فصل تمتد والقص الإجهاد على سقالة أنبوبي. وهذا يسمح للتقييم المنهجي والموحد للقدرة الالتهابية والتجديدية للسقالات الأنبوبية تحت تأثير الأحمال الميكانيكية التي يتم التحكم فيها بشكل جيد ، والتي نظهرها على أساس تجربة ديناميكية للثقافة المشتركة باستخدام الضامة البشرية والخلايا العضلية. وتناقش بالتفصيل الخطوات العملية الرئيسية في هذا النهج - بناء وإنشاء المفاعل الحيوي، وإعداد السقالات وبذر الخلايا، وتطبيق وصيانة تدفق التمدد والقص، وحصاد العينات للتحليل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية (TE) ويجري السعي كخيار علاج بديل لأطراف القلب والأوعية الدموية المستخدمة حاليا دائمة (على سبيل المثال، ترقيع الأوعية الدموية، واستبدال صمام القلب)، والتي هي دون المستوى الأمثل لأفواج كبيرة من المرضى1،2،3،4. وتشمل التطبيقات المطلوبة كثيرا بعد ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة (TEVGs)5و6 وصمامات القلب (TEHVs)7،8. في معظم الأحيان، تستخدم منهجيات TE القلبية الوعائية المواد الحيوية القابلة لإعادة التكثير (سواء كانت طبيعية أو اصطناعية) التي تعمل سقالة مفيدة للأنسجة الجديدة التي سيتم تشكيلها. تشكيل نسيج جديد يمكن إما أن تكون هندسية تماما في المختبر، عن طريق بذر السقالة مع الخلايا وزراعة في مفاعل حيوي قبل زرع (في المختبر TE)9،10،11، أو مباشرة في الموقع، والتي يتم زرع السقالة الاصطناعية دون زرع قبل من أجل الحث على تشكيل أنسجة جديدة مباشرة في الجسم (في الموقع TE)12،13،14. لكل من المختبر وفي الموقع نهج TE القلب والأوعية الدموية، وتجديد وظيفي ناجح يعتمد بشكل مهيمن على كل من الاستجابة المناعية المضيف لبناء مزروع وتحميل الميكانيكا الحيوية المناسبة.

أهمية التحميل الميكانيكي الحيوي لTE القلب والأوعية الدموية هو معترف به جيدا15. في حالة زراعة القلب والأوعية الدموية ، تتعرض الخلايا التي تملأ السقالة لإجهادات التمدد الدوري والقص التي تنشأ نتيجة للبيئة الدموية. وقد ذكرت العديد من الدراسات تأثير تحفيزي من (دوري) تمتد على تشكيل مكونات مصفوفة, مثل الكولاجين16,17,18,19, الجليكوسامينوجليكان (GAGs)20, والإيلاستين21,22, من قبل أنواع مختلفة من الخلايا. على سبيل المثال، أثبت هوانغ وآخرون أن امتداد ثنائي ساكسيال رفع ترسب وتنظيم الكولاجين والإيلاستين في المختبر TEVGs باستخدام مفاعل حيوي الأوعية الدموية23. في حين أن التركيز يكمن عادة على التمدد كحمل مهيمن ، فإن هذه الدراسات غالبا ما تستخدم المفاعلات الحيوية التي تحركها التدفق والتي تتعرض فيها العينة أيضا لتدفق القص. على الرغم من أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا عن التأثير المعزول لضغوط القص على تكوين الأنسجة والالتهاب في 3D ، إلا أن بعض البيانات متوفرة. على سبيل المثال، أظهر Hinderer et al. و Eoh وآخرون أن تدفق القص، بالإضافة إلى البنية الدقيقة للسقالة ثلاثية الأبعاد، كان مهما لتشكيل الإيلاستين الناضج بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية في نظام نموذج المختبر24،25. وإجمالا، توضح هذه النتائج أهمية كل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ل TE القلبي الوعائي.

محدد مهم آخر لنجاح أو فشل يزرع TE هو استجابة المضيف المناعية للكسب غير المشروع المزروعة26. وهذا مهم بشكل خاص لاستراتيجيات TE التي تحركها المواد في الموقع ، والتي تعتمد في الواقع على الاستجابة الالتهابية الحادة للسقالة لبدء العمليات اللاحقة لتدفق الخلايا وتشكيل الأنسجة الذاتية وإعادة عرض27. الماكروفاج هو البادئ الحاسم لتجديد الأنسجة الوظيفية، والتي أظهرتها دراسات متعددة28،29،30. مماثلة لتضميد الجروح، ويحكم تجديد الأنسجة من قبل إشارات الباراكورين بين الضامة والخلايا المنتجة للأنسجة مثل الخلايا الليفية والخلايا العضليةالليفية 31،32،33. بالإضافة إلى تنسيق ترسب الأنسجة الجديدة ، وتشارك الضامة في ارتشاف نشط من المواد سقالة الأجنبية34،35. على هذا النحو ، تم تحديد استجابة الضامة في المختبر للمواد الحيوية كمعلمة تنبؤية لنجاح الجسم الحي للغرسات36و37و38.

تعتمد استجابة الضامة على السقالة المزروعة على ميزات تصميم السقالات مثل تكوين المواد والبنية المجهرية35و39و40. بالإضافة إلى خصائص السقالة ، تتأثر استجابة الضامة إلى سقالة ومكائدها المتقاطعة مع الخلايا الميوفيبروبلاست أيضا بالأحمال الديناميكية الدموية. على سبيل المثال، تبين أن امتداد دوري هو المغير المهم للنمط الظاهري الضام41،42،43،44 وإفراز السيتوكينات43،44،45،46 في سقالات كهربائية ثلاثية الأبعاد. باستخدام نظام الثقافة المشتركة من الضامة وخلايا العضلات الملساء الوعائية، أظهر باتيستون وآخرون أن وجود الضامة أدى إلى زيادة مستويات الإيلاستين وGAGs وأن المستويات المعتدلة من الامتداد الدوري (1.07-1.10) حفزت ترسب الكولاجين I والإيلاستين47. في الأعمال السابقة، لقد أثبتنا أن الإجهاد القص هو محدد مهم للتجنيد monocyte في سقالات electrospun 3D48،49،وأن كلا من الإجهاد القص وتمتد دوري تؤثر على الإشارات الباراترين بين الخلايا الأحادية البشرية والخلايا النجمية mesenchymal50. أظهر فاهي وآخرون أن تدفق القص زاد من إفراز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة الخلايا الأحادية البشرية51.

إذا أخذنا معا، فإن الأدلة المذكورة أعلاه تظهر أن الفهم الكافي للأحمال الديناميكية الدموية والتحكم فيها أمر بالغ الأهمية ل TE القلب والأوعية الدموية، وأنه من المهم النظر في الاستجابة الالتهابية لتحقيق ذلك. وقد وصفت العديد من المفاعلات الحيوية سابقا للمزود في المختبر52،53،54،55،56،57،58 أو ex vivo59،60،61 ثقافة أنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، تم تصميم جميع هذه الأنظمة لمحاكاة ظروف التحميل الهيمودية الفسيولوجية قدر الإمكان. في حين أن هذا هو قيمة للغاية لغرض خلق أنسجة القلب والأوعية الدموية في المختبر أو الحفاظ على الثقافات الجسم الحي السابق، مثل هذه النظم لا تسمح لدراسات منهجية في الآثار الفردية للإشارات الفردية. وذلك لأن تطبيق كل من التمدد الدوري والإجهاد القص في هذه المفاعلات الحيوية مدفوعة بنفس التدفق المضغوط ، الذي يربط بينهما في جوهره. في حين تم وصف النظم الدقيقة التي تسمح للتلاعب الميكانيكية متعددة جديلة دقيقة لركائز 2D62 أو 3D هيدروجيل الاجهزة63،64، مثل هذه الاجهزة لا تسمح لدمج السقالات 3D elastomeric المواد الحيوية.

هنا، نقدم تطبيق نظام المفاعل الحيوي أنبوبي التي تمكن بشكل فريد من فصل الإجهاد القص وتمتد دوري ويساعد على التحقيق ميكانيكيا آثارها الفردية والمجمعة. يسمح هذا النظام باختبار مجموعة واسعة من ترقيع الأوعية الدموية المهندسة للأنسجة (على سبيل المثال ، المنشأ الاصطناعي أو الطبيعي ، والهندسة المعمارية الدقيقة المختلفة ، والمساميات المختلفة). لفصل فعال تطبيق الإجهاد القص وتمتد، والمفاهيم الرئيسية التي يستخدمها المفاعل الحيوي هي (1) فصل السيطرة على الإجهاد القص وتمتد باستخدام أنظمة مضخة متميزة و (2) تحفيز السقالات بطريقة "من الداخل إلى الخارج" مع أبعاد مدفوعة حسابيا. يتم تطبيق التدفق على السطح الخارجي للسقالة الأنبوبية من خلال استخدام مضخة تدفق ، في حين يتم حث الامتداد المحيطي للسقالة عن طريق توسيع أنبوب السيليكون الذي يتم تركيب السقالة عليه من خلال استخدام مضخة إجهاد منفصلة. يتم اختيار أبعاد أنبوب السيليكون وأنبوب الزجاج الذي يحتوي على البناء بعناية والتحقق من صحتها باستخدام محاكاة ديناميات السوائل الحسابية ، لضمان أن إجهاد القص على السقالة (بسبب التدفق) والتمدد المحيطي (بسبب توسع الأنبوب) لا يؤثران بشكل كبير على بعضهما البعض. هذا التصميم من الداخل إلى الخارج له عدة مبررات عملية. إذا تم تطبيق التمدد بواسطة ضغط السائل الإنارة (على غرار التحميل الفسيولوجي) ، فإنه يتطلب بطبيعته تصميم العينة لتكون خالية من التسرب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضغط المطلوب لتمديد العينة سيتم تحديده بالكامل من خلال صلابة العينة ، والتي قد تختلف بين العينات وداخل عينة مع مرور الوقت ، مما يجعل من الصعب التحكم في الامتداد. هذا المفاعل الحيوي يتصاعد الكسب غير المشروع الأنسجة المهندسة حول أنبوب السيليكون ويسمح لتطبيق الإجهاد القص الجدار (WSS) على الجدار الخارجي للكسب غير المشروع ويضغط على الكسب غير المشروع من الداخل. وبهذه الطريقة ، يمكن ضمان ظروف تحميل متساوية بين العينات وداخل العينات مع مرور الوقت ، وعلاوة على ذلك ، يسمح للعينات بأن تكون متسربة ، كما هو شائع للسقالات الوعائية المسامية19. يهدف هذا المفاعل الحيوي من الداخل إلى الخارج على وجه التحديد لإجراء دراسات منهجية حول آثار القص و / أو التمدد ، بدلا من هندسة وعاء دموي يشبه الأم في المختبر ، والذي تكون أجهزة المفاعل الحيوي الوعائية التقليدية أكثر ملاءمة له. انظر الشكل 1ألف - باء للاطلاع على رسومات تصميم المفاعل الحيوي، والجدول 1 المقابل له للحصول على وصف وظيفي ومنطقي وراء المكونات الرئيسية للمضبر الحيوي.

ويتجلى استخدام المفاعل الحيوي على أساس سلسلة من الدراسات الحديثة من قبل مجموعتنا التي قمنا بالتحقيق في التأثيرات الفردية والمجمعة من إجهاد القص وتمتد دوري على الالتهاب وتشكيل الأنسجة في سقالات electrospun قابلة لإعادة التكهرب في الموقع أنسجة القلب والأوعية الدموية19،43،44. وتحقيقا لتلك الإنسان الضامة والخلايا الميوفيبرومية إما في أحادية أو في ثقافة مشتركة لمحاكاة مختلف مراحل سلسلة التجدد في الموقع. لقد أثبتنا أن إفراز السيتوكين بواسطة الضامة البشرية يتأثر بشكل واضح بكل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ، مما يؤثر على ترسب المصفوفة وتنظيمها من قبل الخلايا العضلية البشرية في هذه السقالات ، سواء عن طريق إشارات الباراكورين والاتصال المباشر19،43،44. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسات كشفت أنه في حالة التطبيق المشترك للإجهاد القص وتمتد، والآثار على تشكيل الأنسجة والتهاب إما تهيمن عليها واحدة من اثنين من الأحمال، أو هناك آثار التآزر من كلا الأحمال. توضح هذه النتائج أهمية فصل كلا الحمولتين للحصول على فهم أفضل لمساهمة البيئة الميكانيكية في عمليات TE. ويمكن تطبيق هذا الفهم لتحسين منهجي المعلمات تصميم سقالة في أنظمة التحميل الحيوية ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات الآلية المستمدة من هذه البيئات التي تسيطر عليها سيطرة جيدة قد تكون بمثابة مدخلات للنماذج العددية التي يجري تطويرها للتنبؤ بمسار إعادة عرض الأنسجة في الموقع، كما ورد مؤخرا بالنسبة ل TEVGs65 أو TEHVs66،لزيادة تحسين القدرة التنبؤية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الدراسات الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام الضامة البشرية الأولية المعزولة عن معاطف برتقالي الدم المحيطي والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية المعزولة عن الوريد الشافيني بعد جراحة المرور الشرياني التاجي44. تم الحصول على المعاطف بافي من صحية، والمتطوعين مجهولي الهوية الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة، والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية الطبية المؤسسية للبحوث Sanquin. وكان استخدام خلايا الفينا النسينا البشرية (HVSCs) وفقا ل "قانون الاستخدام الثانوي السليم للأنسجة البشرية" الذي وضعه اتحاد الجمعيات الطبية في هولندا.

1. الاستعدادات العامة والإجراءات المطلوبة قبل إنشاء المفاعل الحيوي

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول بروتوكولات العزل والاستزراع الخاصة بها، يرجى الرجوع إلى العمل السابق19،43،44. وترد جميع الحسابات في البروتوكول كأمثلة لتجربة الثقافة المشتركة مع monocytes و myofibroblasts، المصنف في 8 سقالات محملة بشكل ديناميكي و2 ضوابط ثابتة (ن = 10).

  1. بدء عزل الخلايا وثقافة الخلايا. كثافة البذر للعينات المستزرعة المشتركة من monocytes و myofibroblasts (مع نسبة البذر من 2:1) هي 30 × 106 monocytes / سم3 و 15 × 106 myofibroblasts / سم3، على التوالي.
    ملاحظة: المواد electrospun له المسامية عالية (>90٪). لتقدير العدد المطلوب من الخلايا لكل الكسب غير المشروع، يتم حساب حجم السقالة مع صيغة لحجم اسطوانة جوفاء: π *(سمك)2* طول ≈ 0.04 سم3. المبلغ الإجمالي للخلايا في الكسب غير المشروع هو 1.2 × 106 monocytes و 0.6 × 106 الخلايا العضلية. وبالنسبة إلى 10 عينات، يلزم ما لا يقل عن 12 ×10 6 بويضات و6 ×10 6 من الخلايا العضلية الليفية؛ تبدأ مع ما يصل إلى ~ 10-15٪ خلايا أكثر لحساب الأخطاء المحتملة pipetting.
  2. ديغا وسيلة ثقافة الخلية التي سيتم استخدامها للتجارب التي تنطوي على المفاعل الحيوي.
    1. إعداد المتوسطة للثقافات المشتركة، والتي تتكون من RPMI-1640:aDMEM (1:1)، تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين-streptomycin و 0.5٪ L-الجلوتامين.
    2. ضع الوسط بين عشية وضحاها (O/N) في حاضنة في قارورة ثقافة الخلية مع غطاء فلتر إلى ديغا.
    3. استبدل غطاء الفلتر بغطاء محكم الهواء وخزنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 0.25 ملغم/مل من حمض الأسكوربيك 2-فوسفات (فيتامين ج) إلى الوسط.
      ملاحظة: بالنسبة للحسابات، يبلغ مقدار الوسيط المطلوب لكل غرفة ثقافة تدفق 50 مل. تحديث المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع; يتم استبدال 25 مل المتوسطة القديمة من قبل 25 مل المتوسطة الطازجة. ل 10 عينات; بعد البذر، مطلوب ما مجموعه 500 مل المتوسطة الطازجة، ولكل تغيير متوسط لاحق، يتم استخدام ما مجموعه 250 مل المتوسطة الطازجة. دائما إعداد متوسطة الطازجة، وخاصة، ينبغي إضافة فيتامين (ج) فقط قبل تغيير المتوسطة.
  3. إعداد سقالات electrospun متساوية الخواص (قطرها 3 مم مضيئة، 200 ميكرومتر سماكة الجدار) كما وصفها فان هافتن وآخرون.19 (الشكل 1G-I). باختصار، يتم إنتاج سقالات البوليكابرولاكتون الأنبوبي (PCL-BU) عن طريق التكروسبينينج من حلول الكلوروفورم البوليمرية بنسبة 15٪ (ث/ث). حلول البوليمر هي electrospun في درجة حرارة الغرفة والرطوبة النسبية 30٪، بمعدل تدفق 40 ميكرولتر / دقيقة، 16 سم المسافة من الهدف الأسطواني الدورية (Ø 3 ملم، 500 دورة في الدقيقة)، والجهد التطبيقي من 16 كيلو فولت على فوهة كهربائية و-1 كيلو فولت على الهدف.
    ملاحظة: على الرغم من استخدام ترقيع PCL-BU لهذه التجارب، يمكن تركيب مجموعة واسعة من الطعوم المهندسة للأنسجة الإيلاستومية في هذا المفاعل الحيوي (على سبيل المثال، من أصل اصطناعي أو طبيعي مختلف، وهندسة مصغرة مختلفة، و مساميات مختلفة)
    1. إزالة السقالات الكهربائي من mandrel.
      1. جعل ثقب صغير في غطاء أنبوب 15 مل ل 'عقد' mandrel في المركز ومنعه من لمس جدار الأنبوب.
      2. ضع المندول مع سقالة الكهربائي في أنبوب الصقر وملئه بالماء deionized.
      3. تجميد أنابيب O / N في -20 درجة مئوية.
      4. ضع الأنابيب في درجة حرارة الغرفة (RT) وسحب الماندريل بعد بضع دقائق ، وترك الطعوم الكهربائي في الجليد.
      5. دع الجليد يذوب تماما ، وأزل أنبوب الكهربائي من الماء المذاب ، و لتجف عموديا لعدة ساعات. تأكد من أن السقالات لا "تنهار" تحت وزنها.
    2. السقالات الجافة تحت فراغ O / N.
    3. صورة عينة صغيرة من الطعوم electrospun باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) لتقييم هيكلها المجهري (على سبيل المثال، مورفولوجيا الألياف، قطر الألياف). الطعوم في دراسات المثال لديها اتجاه الألياف متساوي الخواص وقطر الألياف من 5 ميكرومتر(الشكل 1H-I).
  4. قبل يوم واحد من بدء التجربة، ضع الخزان الهيدروليكي المليء بالمياه المتأينة في الحاضنة. أغلق جميع الاتصالات الثمانية لغرف ثقافة التدفق بقبعات Luer البيضاء. الاتصال بنظام الهواء المضغوط وإدراج مستشعر الضغط. تشغيل مضخة سلالة (انظر الخطوة 5.6) O / N للسماح للتوسع صغيرة من خوار تفلون.
    ملاحظة: تأكد من تنظيف جميع المواد والمعدات الضرورية و/أو تعقيمها تلقائيا (راجع جدول المواد، عمود التعليقات / الوصف الذي يسمح بتعقيم المواد تلقائيا) ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة أو كما هو موضح في الخطوات 7.3-7.6.
  5. ضمان ظروف عمل معقمة لبقية البروتوكول.
    1. قم بتنفيذ الخطوات 2-5.3 (إعداد النظام)، والخطوة 6.3 (التغيير المتوسط)، والخطوات 7.1-7.2 (حصاد بنيات الأوعية الدموية) في خزانة تدفق صفح معقمة.
    2. ضع المواد التي لا تحتاج إليها مباشرة للخطوات اللاحقة في أطباق بيتري المغلقة للحفاظ على كل شيء نظيف قدر الإمكان.
    3. أسطح المواد النظيفة أو الجافة بانتظام عن طريق نقع نسيج ورقي مع الإيثانول 70٪، ومسح أسطح مكونات المفاعل الحيوي وخزانة تدفق صفح.

2. إعداد المفاعل الحيوي

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 2 في خزانة تدفق صفح.

  1. قطع السقالات electrospun في أنابيب من حوالي 25 ملم في الطول، وتوثيقها قبل الاستخدام (على سبيل المثال، صورة للطول، تزن مع التوازن للكتلة الأولية).
  2. إزالة التلوث من السقالات الكهربائية.
    1. ضع السقالات الكهربائي إمالة في لوحة بئر أو طبق بيتري ، مع فتحة واحدة تواجه مصدر الضوء فوق البنفسجي (UV) ، لتمكين الأشعة فوق البنفسجية (253.7 نانومتر) لإلقاء الضوء على داخل السقالات.
    2. تعريض السقالات electrospun للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
    3. بدوره جميع السقالات وتكرار الإضاءة للأشعة فوق البنفسجية لفتحة أخرى.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، المس سقالة الكهرسبون فقط عند الحاجة. استخدم دائما ملاقط نظيفة أو قفازات نظيفة.
    4. خذ الأنابيب الزجاجية لغرف ثقافة التدفق التي يتم تخزينها في 70٪، واغسل الأنابيب الزجاجية في المياه فائقة النبع، وجافة، ووضعها في طبق بيتري كبير مغلق.
      ملاحظة: الخطوات التالية، وخاصة الخطوات 2.3-2.5، يتم تنفيذها بشكل مثالي من قبل اثنين من المجربين.
  3. قم بتركيب سقالات الكهرسبون على أنابيب السيليكون.
    1. إرفاق خياطة البرولين 5-0 إلى نهاية واحدة من أنابيب السيليكون عن طريق اتخاذ خياطة من خلال جانب واحد من الأنبوب والخروج من الآخر، وترك اثنين من الغرز مشدود المعاكس تمتد المقطع العرضي من الأنابيب. جعل عقدة صغيرة على كلا الجانبين من الأنبوب في حين ضغط أنبوب في مكان عقدة وترك ما يقرب من 10 سم من الأسلاك على كل عقدة. جعل عقدة ثالثة في نهاية اثنين من 10 سم من الأسلاك المتبقية.
      1. قطع إبرة خياطة وجميع المواضيع الحرة التي قد التمسك بها وتلف داخل سقالة electrospun. قطع حواف أنابيب السيليكون في شكل مثلث للمساعدة في سحب أنابيب السيليكون من خلال سقالة electrospun.
    2. تراجع سقالة electrospun في الإيثانول 30 ٪ (وهذا بمثابة خطوة إزالة التلوث اضافية ويساعد في انزلاق سقالة electrospun على أنابيب السيليكون) ووضع سقالة electrospun على سلك 10 سم مجانا. المجرب A تمتد أنابيب السيليكون عن طريق سحب بلطف على كل من أنابيب السيليكون وعقدة من سلك خياطة 10 سم، في حين أن المجرب B الشرائح بلطف سقالة electrospun على أنابيب السيليكون باستخدام ملاقط مع طرف داخلي سلس لمنع إتلاف السقالات.
    3. حرر ببطء امتداد على أنابيب السيليكون، في حين تنعيم في وقت واحد سقالة electrospun مع ملاقط. تراجع سقالة electrospun على أنابيب السيليكون في المياه فائقة البور مرتين.
      ملاحظة: من الممكن أن يحدث بعض التجاعيد من سقالة electrospun. هذا تجعد سوف تختفي خلال تطبيق ما قبل تمتد الحق قبل تحديد السقالات إلى قنوات الضغط في الخطوة 2.5.3.
    4. كرر الخطوتين 2.3.2 و 2.3.3 للسقالات الكهربائي الأخرى. اعتمادا على طول أنابيب السيليكون، يمكن تركيب سقالات كهربائية متعددة على نفس أنابيب السيليكون.
    5. عندما يتم تركيب جميع السقالات electrospun على أنابيب السيليكون، وقطع أنابيب السيليكون حول السقالات، وكلها لنفس الطول (5.5 سم)؛ في جانب واحد، على مقربة من نهاية سقالة electrospun، في الجانب الآخر، وترك ~ 2-3 سم من أنابيب السيليكون مجانا.
  4. بناء المقصورة السفلية من غرفة ثقافة التدفق(الشكل 1A-B).
    1. خذ الجزء العلوي من المقصورة السفلية التي تحتوي على منفذ التدفق، وقم بإغلاق منفذ التدفق بقابس Luer ذكر.
    2. دفع قناة الضغط مع ثقوب من خلال المقصورة السفلية، ووضع سيليكون O-حلقة حول الطرف السفلي من قناة الضغط لمنع التسرب. المسمار الجزء السفلي من المقصورة السفلية إلى الجزء العلوي من المقصورة السفلي لتأمين قناة الضغط. تأكد من أن الأخدود المحفور السفلي من قناة الضغط هو تقريبا 3-5 مم فوق حافة محول بوشينج من المقصورة السفلية; هذا سوف في وقت لاحق 'عقد' عقدة ضيقة من سلك خياطة، وتحديد سقالة electrospun على أنابيب السيليكون.
      ملاحظة: إذا كان يمكن بسهولة المناورة قناة الضغط صعودا وهبوطا، فإنه يشير إلى أن المقصورة السفلية ليست مؤمنة بشكل جيد. كرر الخطوة 2.4.2 لمنع التسرب في مراحل لاحقة(الشكل 2D).
  5. تأمين أنابيب السيليكون مع سقالة electrospun إلى قناة الضغط.
    1. سحب أنبوب السيليكون مع سقالة electrospun على قناة الضغط.
    2. جعل عقدة مع سلك خياطة في الطرف السفلي من سقالة electrospun في موقع الأخدود محفورة على قناة الضغط. جعل عقدة ثانية في الجانب الآخر لتأمين بإحكام أنابيب السيليكون مع الكسب غير المشروع electrospun.
      تنبيه: هذه خطوة حاسمة. تأكد من أن العقدة بالضبط "تقع" في الأخدود المحفور من قناة الضغط لمنع تسرب المياه من الخزان الهيدروليكي إلى غرف ثقافة التدفق. إذا لم يكن متأكدا، في محاولة لتشديد سلك خياطة في عدة مواقع، فوق أو تحت الموقع المتوقع من الأخدود، لضمان أن العقدة النهائية هي بالضبط في الأخدود محفورة (الشكل 2A).
    3. ضع المشبك المقص في الطرف العلوي من أنبوب السيليكون ، ومد أنابيب السيليكون إلى الأعلى (وهذا سيختبر مباشرة العقدة الأولى ، إذا كان من الممكن تحريك أنابيب السيليكون مع سقالة electrospun فوق قناة الضغط ، لم يتم تشديدها بشكل جيد بما فيه الكفاية). مع قوة السحب، أنابيب السيليكون هي ما قبل امتدت. لضمان أن أنابيب السيليكون متسقة بين العينات المختلفة، قم بإرفاق مسطرة بمشبك المقص. سحب المشبك مقص صعودا حتى الطرف السفلي من المسطرة تصل إلى ارتفاع الطرف السفلي من السقالة.
      ملاحظة: من المهم الحفاظ على ما قبل التمدد في كل عينة تقريبا نفس (~ 5٪) لسببين: (1) إذا كانت أنابيب السيليكون ممتدة مسبقا، فإنها ستؤدي إلى توسع أكثر تجانسا على طول العينة عند الضغط عليها. (2) فإن ما قبل تمتد تؤثر على الخصائص الميكانيكية للسيليكون، وبالتالي ينبغي أن يكون هو نفسه عبر جميع العينات لضمان ظروف تمتد على قدم المساواة بين العينات.
    4. إزالة التجاعيد في سقالة electrospun عن طريق سحب بلطف على سقالة electrospun. مرة أخرى، وجعل عقدة اثنين في كلا الجانبين مع سلك خياطة على الطرف العلوي من السقالة في موقع الأخدود محفورة العلوي على قناة الضغط.
    5. الإفراج عن المشبك مقص، وقطع بعيدا الزائدة من أنابيب السيليكون بسكين، وترك 20-30٪ من الخيط المسمار مغطاة أنابيب السيليكون، لمنع التسرب عندما يتم تركيب مخروط الأنف على الخيط المسمار.
      ملاحظة: كرر الخطوتين 2.4 و 2.5 لكافة العينات الحيوية.
    6. لعينات التحكم الثابتة، قم بتأمين سقالة الكهرسبون المثبتة على أنابيب السيليكون على قنوات الضغط دون ثقوب. يمكن الاحتفاظ بهذه القنوات بشكل منفصل في أنبوب 15 مل حتى البذر (الخطوة 4) ولا تحتاج إلى تركيبها في مقصورات غرفة ثقافة التدفق.
  6. إزالة التلوث من غرف ثقافة التدفق التي شيدت جزئيا مع سقالة electrospun عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. بدوره غرف ثقافة تدفق مع السقالات electrospun إلى الجانب الآخر، وتكرار التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
  7. المسمار المخاريط الأنف على الخيط المسمار من قنوات الضغط مع ثقوب للعينات الحيوية.
    1. تأكد من أن الطرف العلوي من أنابيب السيليكون يناسب مخروط الأنف لمنع التسرب في مراحل لاحقة. إذا كان هناك الكثير من أنابيب السيليكون، وقطع الزائدة من أنابيب بعيدا بسكين.
    2. ضع غرف ثقافة التدفق التي تم بناؤها جزئيا في طبق بيتري كبير ، ونقطة مخروط الأنف نحو مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تطبيق الإضاءة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
  8. البناء الكامل لغرفة ثقافة التدفق مع الأنبوب الزجاجي والمقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق(الشكل 1A-B).
    1. قبل الرطب السقالات electrospun عن طريق غمس قناة الضغط مع أنابيب السيليكون وسقالة electrospun في الإيثانول 30٪، تليها تراجع في المياه فائقة الشراء مرتين.
    2. ضع الأنبوب الزجاجي فوق قناة الضغط، وادفع برفق في المقصورة السفلية وآمنه برفق.
    3. خذ المقصورة العلوية التي تحتوي على مدخل التدفق ، ضع حلقة O السيليكون ، ومستقيم التدفق ، ومحول الأدغال بالترتيب الصحيح(الشكل 1A-B)، ووضعها على الطرف المفتوح للأنبوب الزجاجي وتأمينها بلطف.
    4. المسمار قبعة لوير بيضاء على مدخل تدفق المقصورة العلوية.
    5. قم بإزالة قابس Luer الذكر من منفذ التدفق في المقصورة السفلية ، وتنظيف السطح حوله بأنسجة ورقية غارقة في الإيثانول.
    6. ضع حقنة مع 10 مل من المياه فائقة البرودة في منفذ التدفق ، وافتح غطاء Luer الأبيض على المقصورة العلوية ، واملأ الغرفة بالماء فائق النبور. أغلق غطاء Luer الأبيض مرة أخرى ، وأزل الحقنة ، وانظف مرة أخرى بالإيثانول ، واغلق منفذ التدفق بقابس Luer الذكر.
      ملاحظة: كرر الخطوات 2.6-2.8 لكافة غرف ثقافة التدفق.
    7. بالنسبة للعناصر الثابتة، أضف 10 مل من المياه فائقة السعة إلى أنابيب 15 مل التي تحمل العينات المثبتة على قنوات الضغط دون ثقوب.
  9. ضع جميع غرف ثقافة التدفق في الحاضنة. استبدل الماء فائق النبع بمتوسط ثقافي قبل يوم واحد من بذر الخلايا بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوتين 2.8.5 و 2.8.6 (تأكد من جمع الماء فائق الشراء "القديم" مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول يوضع مباشرة على منفذ التدفق).

[يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا]

3. الاستعدادات لإعداد مضخة تدفق

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 3 في خزانة تدفق صفح.

  1. جمع جميع المواد إعداد مضخة والاستعداد للاستخدام.
    ملاحظة: تتم إحالة المجربين إلى بروتوكول الشركة المصنعة للحصول على وصف مفصل لإعداد المضخة والوحدات السائلة والأنابيب المتوسطة من خلال صمامات الوحدة السائلة.
    1. تعيين المضخة إلى سعة 200 mbar.
    2. المسمار أصحاب الخزانات لخزانات 60 مل إلى وحدات السوائل.
    3. تنظيف مرشحات الهواء المطاطي القابلة لإعادة استخدامها مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول، تأكد من أن فلتر الهواء يبقى جافا.
  2. ضع خزانات 60 مل في حاملات الخزانات، وضع أنابيب متوسطة القياسية من خلال صمامات وحدة السوائل. ربط الأنابيب المتوسطة مع قطر داخلي أكبر مع الإناث لوير قفل التوصيلات في حلقة مغلقة.
  3. المشبك أنابيب المتوسطة مع مقطع خرطوم، مباشرة تحت الخزانات.
  4. ملء الخزانات مع 25 مل من المتوسطة الثقافة لكل خزان 60 مل. الإفراج عن مقطع خرطوم، والسماح للوسط دخول الأنابيب.
  5. أغلق الخزانات المتوسطة باستخدام مرشحات الهواء المطاطي، وضع إعداد مضخة التدفق في الحاضنة حتى الخطوة 4.

4. زرع الخلايا باستخدام فيبرين باعتباره الناقل الخلية

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 4 في خزانة تدفق صفح.

  1. إعداد هلام الفيبرين لخطوة البذر الخلية. للحصول على التفاصيل، راجع مول وآخرون67 لهلام الفيبرين، يجب أن يكون لمحلول الفيبرينوجين تركيز نهائي قدره 10 ملغم/مل (صحيح لنقاء مخزون البروتين)، وينبغي أن يكون لمحلول الثرومبين تركيز نهائي قدره 10 U/mL.
    1. ذوبان الفيبرينوجين إلى RT، قبل أن تزن ~ 50 ملغ (ما يكفي ل10 عينات) في وعاء من البلاستيك مع غطاء أحمر.
    2. إضافة خلية الثقافة المتوسطة لإعداد محلول الفيبرينوجين (بتركيز 10 ملغم / مل, الصحيح لنقاء المخزون البروتين). تخلط جيدا ومرشح لتعقيم محلول الفيبرينوجين مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب معقم 15 مل. الحفاظ على محلول الفيبرينوجين المصفاة على الجليد.
      ملاحظة: تجنب إعداد محلول الفيبرينوجين لفترة طويلة جدا مقدما، وإلا فإن الفيبرينوجين قد يتخثر تلقائيا.
    3. تذوب الثرومبين وجعل حل الثرومبين (بتركيز 10 U / مل) في خلية الثقافة المتوسطة ومكان على الجليد. إعداد 20 ميكرولتر thrombin + حل الخلايا لكل عينة. وبالنسبة لعينات n=10، يلزم 200 ميكرولتر؛ لذلك، تحضير حل 250 ميكرولتر thrombin لحساب أخطاء pipetting المحتملة.
  2. جمع وإحصاء الخلايا من قوارير الثقافة. خلط الخلايا في النسبة المطلوبة والمبلغ (1.2 × 106 monocytes و 0.6 × 106 الخلايا العضلية لكل سقالة). تأكد من وجود خلايا كافية لعينات n+1 لتصحيح أخطاء ماسورة. جهاز الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. إزالة supernatant.
  3. جعل خليط من الخلايا المعلقة والثرومبين.
    1. لكل عينة، استخدم 20 ميكرولتر من محلول الثرومبين. بالنسبة لعينات n=10، أضف 200 ميكرولتر ثرومبين إلى بيليه الخلية واخلطها. قياس حجم تعليق الخلية (خلايا + thrombin)، وحساب كيفية تقسيم بالتساوي على جميع السقالات 10 (على سبيل المثال، إذا thrombin + تعليق الخلية لديها حجم 260 ميكرولتر، وسوف تتلقى كل عينة electrospun 260 ميكرولتر/10 عينات = 26 ميكرولتر thrombin + تعليق الخلية).
    2. كما يتم تنفيذ البذر من السقالات في خطوتين، وإعداد اثنين من أنابيب الميكروفوجي 1.5 مل التي سوف تعقد نصف تعليق الخلية لكل سقالة (في حساب المثال من الخطوة السابقة: إعداد أنبوبين مع 13 ميكروغرام من thrombin + تعليق الخلية). ضعه على الثلج
      ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية، وخاصة الخطوة 4.4، بشكل مثالي من قبل اثنين من المجربين.
  4. جفف السقالات الكهربائية المبللة مسبقا بالفراغ للتحضير زراعة الخلايا.
    1. توصيل ماصة باستور الزجاج لنظام فراغ من خزانة تدفق صفح، ومكان في أنبوب فارغ 50 مل لتخزين مؤقت معقمة.
    2. خذ غرف ثقافة التدفق من الحاضنة ، وأزل قابس Luer الذكر من منفذ التدفق ، وأزل الوسط بعد فتح غطاء Luer الأبيض ووضع نسيج ورقي غارق في الإيثانول أمام منفذ التدفق.
    3. خلع المقصورة العلوية وأنبوب زجاجي، ووضعها في طبق بيتري العقيمة للتخزين المؤقت.
    4. وضع الأنابيب باستور فراغ على سقالة electrospun، وإزالة أكبر قدر ممكن من المتوسطة.
      تنبيه: فراغ الجافة سقالة electrospun بلطف جدا. بدلا من حركة خطية ذهابا وإيابا على السقالة، ضع ماصة الفراغ في مواقع متعددة. المشبك أنابيب فراغ على رأس ماصة باستور في بين الأصابع لتحسين السيطرة.
    5. اخلط محلول الفيبرينوجين بنسبة 1:1 مع تعليق الجلطات + الخلية (على سبيل المثال، اخلط 13 ميكرولتر من الفيبرينوجين مع 13 ميكرولتر من الثرومبين + تعليق الخلية). للتأكد من أن الفيبرين يبلمرة في السقالة وليس في أنبوب microfuge، pipet الفيبرينوجين، بدوره عجلة الأنابيب ل 'حجم إضافي' من thrombin + تعليق الخلية، وماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة في أنبوب microfuge مع تعليق الخلية لخلط.
    6. بالتنقيط بشكل متجانس مباشرة الحل على طول كامل من سقالة electrospun. وينصح بأن المجرب A يقطر خليط الفيبرين، في حين أن المجرب B يحمل المقصورة السفلية مع سقالة electrospun التي شنت على قناة الضغط.
    7. بعد أن يتم قطر الفيبرين مع الخلايا على سقالة electrospun ، يقوم Experimenter B بتحريك السقالة ببطء ، من اليسار إلى اليمين وأعلى لأسفل ، لزيادة تقسيم الخلايا بالتساوي على السقالة.
    8. كرر الخطوة 4.4.5 - 4.4.7 على الجانب الآخر من سقالة الكهرسبون.
    9. قم بتركيب غرفة ثقافة التدفق مرة أخرى عن طريق وضع الأنبوب الزجاجي بعناية (منع الالتصاق الفيبرين والتخثر إلى الجانب الداخلي من الأنبوب الزجاجي) ، ودفع المقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق. ضع مباشرة البناء المصنف دون أي ملحي متوسط أو عازل للفوسفات (PBS) في غرفة ثقافة التدفق في الحاضنة.
    10. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.9 لجميع العينات الديناميكية. بالنسبة للعينات الثابتة المثبتة على قنوات الضغط بدون ثقوب ، البذور وفقا للخطوات 4.4.1-4.4.8 ، ووضعها في أنبوب 15 مل بعد ذلك.
    11. دع الفيبرين يبوليمر لمدة 60 دقيقة في الحاضنة.

[يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا لمدة 30-60 دقيقة.]

  1. بعد البلمرة، قم بملء غرف زراعة التدفق (عينات ديناميكية) أو أنابيب 15 مل (عينات ثابتة) مع متوسطة.

5. اقتران أنظمة المفاعل الحيوي وتدفق مضخة قبل بدء التجربة

ملاحظة: تنفيذ الخطوات 5.1-5.3 في خزانة تدفق صفح.

  1. خذ الدرج الذي يحمل غرف زراعة التدفق والوحدات السائلة مع الخزانات المتوسطة المملوءة والأنابيب المتوسطة المتصلة داخل خزانات تدفق صفح.
  2. ضع غرف ثقافة التدفق على قاعدة المفاعل الحيوي للمجموعات التجريبية المحملة بالتمدد الدوري ومع الأحمال الديناميكية الدموية المجمعة(الشكل 1E).
    1. إمالة غرفة ثقافة التدفق رأسا على عقب، وملء قناة الضغط من أسفل مع المياه فائقة النبع باستخدام حقنة مع أنابيب رقيقة (وهذا يمكن أن يكون من أي نوع، طالما أنها مرنة ورقيقة، في هذه التجربة، تم إرفاق 10 سم طويلة، 0.15 ملم سلك القطر الداخلي إلى الإبرة).
    2. ضع الأنابيب الرقيقة داخل قناة الضغط ، وبينما تمتلئ قناة الضغط بالماء فائق النبور عن طريق دفع الماء تدريجيا من الحقنة ، اسحب السلك من قناة الضغط في وقت واحد ، للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل قناة الضغط.
    3. ضع غرفة ثقافة التدفق على أحد الخيوط المسمارية الثمانية على قاعدة المفاعل الحيوي. ضع حلقة O السيليكون بين قاعدة المفاعل الحيوي وموصل Luer الأبيض لمنع التسرب المحتمل ، وتشديد موصل Luer الأبيض من المقصورة السفلية.
    4. كرر الخطوتين 5.2.2 و5.2.3 لجميع العينات الممتدة دوريا.
  3. قم بتوصيل غرف ثقافة التدفق لجميع المجموعات التجريبية، باستثناء عنصر التحكم الثابت، بنظام مضخة التدفق.
    1. ضع مشبك خرطوم على الأنابيب المتوسطة. قم بإزالة غطاء Luer الأبيض الذي يغطي مدخل التدفق في المقصورة العلوية لغرفة ثقافة التدفق. إزالة الزوجين Luer الإناث من الأنابيب المتوسطة، وربط الأنابيب المتوسطة على جانب واحد مع مدخل تدفق على المقصورة العليا، والجانب الآخر من الأنابيب المتوسطة مع منفذ تدفق في المقصورة السفلية.
    2. كرر الخطوة 5.3.1 لجميع غرف ثقافة التدفق. عند هذه النقطة، يتم تعبئة المفاعل الحيوي وغرف ثقافة التدفق مع المتوسطة ومتصلة بأنظمة التدفق.
    3. لعينات التحكم الثابتة، ضع العينات عموديا في قارورة ثقافة الخلية مع غطاء التصفية باستخدام المشبك المقص. ملء قارورة ثقافة الخلية مع المتوسطة، ومكان في الحاضنة.
  4. نقل الإعداد الكامل من خزانة تدفق صفح إلى الحاضنة، وربط وحدات السوائل إلى أنابيب ضغط الهواء والكابل الكهربائي.
  5. بدء تشغيل البرنامج، وتهيئة مضخات التدفق. بدء تدفق متوسطة للعينات واحدا تلو الآخر.
    1. تحقق مما إذا كانت صمامات الوحدة السائلة تنقر.
    2. إزالة المشبك خرطوم من الأنابيب المتوسطة.
    3. بدء تشغيل مضخة التدفق مع 100 mbar و 10 ق وقت التبديل.
    4. تحقق بعناية من اتجاه التدفق لاحتمال تسرب أو فقاعات الهواء. يمكن إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين عن طريق تحويل غرفة ثقافة التدفق رأسا على عقب.
      ملاحظة: تأكد من أن المستويات المتوسطة في الخزانات المتوسطة متوازنة، لمنع شفط الهواء في النظام وفقاعات الهواء في غرف ثقافة التدفق، وعدم السماح للخزانات بالجفاف(الشكل 2C).
    5. كرر الخطوة 5.5 لجميع الوحدات السائلة واحدا تلو الآخر.
  6. تهيئة مضخة سلالة.
    1. قم بتوصيل المضخة الهوائية المشغلة عبر مدخل الهواء على الأسطوانة الهوائية بالهواء المضغوط. توصيل منفذ الهواء السفلي مع أنابيب زرقاء للهواء خارج (الشكل 1F).
    2. فتح برنامج LabVIEW، تشغيل البرنامج النصي LabVIEW وضغط الهواء المضغوط نظام التطبيق، كما هو موضح من قبل فان كيليوآخرون. 68،أدخل التشريد والتردد (تبدأ مع التردد المنخفض من 0.2 هرتز). إيقاف المضخة مؤقتا عندما يكون خوار تفلون في أدنى مستوى له.
    3. ضع مستشعر الضغط في مدخل مستشعر الضغط على الخزان الهيدروليكي.
  7. تغيير إعدادات المضخة إلى الإعدادات المطلوبة (ل1.5 السلطة الفلسطينية، واستخدام 150 mbar، 10 ق وقت التبديل).
  8. بدء تشغيل مضخة سلالة، وتطبيق الإعداد المفضل (على سبيل المثال، 0.5 هرتز، 1.05 تمتد).

6. تشغيل التجربة لعدة أيام؛ رصد القص وتمتد خلال الثقافة واستبدال المتوسطة

  1. حساب WSS في جدار السقالة.
    1. سجل حجم التدفق كل يومين (انظر دليل الشركة المصنعة لمضخة التدفق للحصول على التفاصيل). باختصار، لاحظ التغير في مستويات السائل (بال مل) في الخزانات المتوسطة بين تبديل خزان الوحدة السائلة لمدة 10 s. إجراء خمسة قياسات على الأقل، وحساب متوسط القيمة، وضرب في 6 للحصول على معدل التدفق Q في مل / دقيقة.
    2. يتم وصف التدفق من خلال تدفق Poiseuille من خلال قناة حلقية. على افتراض الثقافة المتوسطة كسائل النيوتونية، وحساب WSS في جدار سقالة، ص1،من المعادلة 1.
      figure-protocol-1 (1)
      حيث WSS ثفي جدار سقالة (ص1; هنا ص1 = 1.7 مم), الناتجة عن تدفق حالة ثابت, يتم تحديدها من قبل P الضغط المطبق ونصف القطر الداخلي للأنبوب الزجاجي ص2 (هنا ص2 = 2.3 مم). ويفترض أن تدرج الضغط في الاتجاه المحوري موحد بين مدخل التدفق ومنفذ التدفق وتعطى المعادلة 2(الشكل 1J).
      figure-protocol-2 (2)
      مع μ اللزوجة الديناميكية (هنا يفترض اللزوجة المتوسطة ثابتة، μ = 0.7 × 10-3 Pa∙s في 37 درجة مئوية) و Q معدل التدفق التطبيقي.
  2. رصد تمتد تطبيقها على السقالات كل يومين.
    1. ضع خلفية داكنة خلف غرفة ثقافة التدفق لزيادة التباين بين السقالة والخلفية. ضع مصابيح LED الضوئية ، مشيرا نحو السقالة ، للمساعدة في تصور السقالة.
    2. التقط صورا فوتوغرافية للسقالة بتردد 30 هرتز لمدة 6 s (أي 3 دورات تمدد) مع كاميرا عالية السرعة.
      ملاحظة: قد يكفي انخفاض تردد التسجيل إذا سمحت الكاميرا بذلك. غير أن التردد المطلوب إلى أدنى حد لم يتحدد.
    3. تحديد قطر الحد الأدنى والحد الأقصى من سقالة يدويا من الصور.
    4. حساب القطر الخارجي الحد الأدنى والحد الأقصى من سقالة electrospun لحساب أقصى تمتد وفقا للمعادلة 3.
      figure-protocol-3 (3)
      حيث يتم إعطاء امتداد محيطي(λο)بنسبة بين القطر الخارجي للسقالة، د1،وقطرها الأولي، د0.
  3. تصحيح للتبخر المتوسط، وتحديث المتوسطة ثلاث مرات في الأسبوع.
    1. إيقاف وفصل الكابلات لأنظمة التدفق ومضخة سلالة.
    2. ضع مقاطع خرطوم على الأنابيب المتوسطة.
    3. تحديد مقدار المتوسطة المتبخرة استنادا إلى علامات مؤشر الحجم على الخزانات المتوسطة.
    4. نقل صينية مع المفاعل الحيوي ووحدات السوائل إلى خزانة تدفق صفح.
    5. إزالة مرشحات الهواء المطاطي من الخزانات المتوسطة؛ إضافة المياه فائقة البوري autoclaved للتعويض عن حجم تبخرت من المتوسطة. أغلق الخزانات المتوسطة مرة أخرى، وربط إلى المضخة مرة أخرى لخلط المتوسط مع المياه فائقة البور.
    6. كرر الخطوات 6.3.1-6.3.5. إزالة مرشحات الهواء المطاط مرة أخرى، وإخراج 25 مل من الثقافة المتوسطة، وتدور أسفل في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
      1. جمع 1.5 مل فائقة، وتخزينها في -30 درجة مئوية لتحليل ملامح إفرازية (للتحليل مع اختبار المناعي المرتبطة الانزيم (ELISA)).
      2. جمع الحجم المطلوب من supernatant لدراسات الإشارات الباراكورين، وذلك باستخدام supernatant كما المتوسطةمشروطة 43.
    7. أضف 25 مل من الوسائل الطازجة إلى الخزانات المتوسطة.
    8. ضع مرشحات الهواء المطاطي مرة أخرى على الخزانات المتوسطة.
    9. ضع الإعداد الكامل مرة أخرى في الحاضنة؛ توصيل جميع الكابلات وأنابيب الهواء إلى مضخة ومضخة سلالة. حرر مقاطع الخرطوم وكرر الخطوات 5.4-5.8.
  4. تحقق مما إذا كانت حبات تجفيف السيليكا في زجاجات التجفيف المتصلة بالمضخة رطبة (مظهر أبيض) ، واستبدالها بالخرز الجاف للسيليكا إذا لزم الأمر (المظهر البرتقالي).

7. إنهاء التجربة، جمع العينات، وتنظيف المعدات وتخزينها

  1. في اليوم الأخير من التجربة، صحيح للتبخر المتوسط كما هو موضح في الخطوات 6.3.1-6.3.5، وحصاد العينات واحدا تلو الآخر.
    1. لحصاد العينات واحدا تلو الآخر، مضخة تدفق ومضخة سلالة تحتاج إلى التوقف عدة مرات. ضع مشبك خرطوم على أنابيب متوسطة. مؤقتا وقف تدفق مضخة ومضخة سلالة. فصل غرفة واحدة ثقافة التدفق من قاعدة المفاعل الحيوي؛ استبدال بواسطة غطاء لوير أبيض على قاعدة المفاعل الحيوي. خذ غرفة ثقافة التدفق ووحدة السوائل إلى خزانة تدفق صفح. بدء ضخ تدفق ومضخة سلالة مرة أخرى لتطبيق الحمل الهمودي إلى عينات أخرى حتى الحصاد.
    2. جمع المتوسطة من الخزانات المتوسطة لتحليل إنتاج السيتوكينات الباراكين عن طريق ELISA.
  2. فصل وحدات التدفق والحصاد بناء أنبوبي. قسم وفقا لخطة القطع المطلوبة. يمكن تخزين أجزاء من البناء عند 4 درجات مئوية (بعد تثبيت 15 دقيقة في 3.7٪ الفورمالديهايد و 3 × 5 دقائق غسل في PBS) أو -30 درجة مئوية (بعد التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل) حتى مزيد من التحليل.
  3. تنظيف مكونات المفاعل الحيوي والمضخات. بالإضافة إلى ذلك، يتم ذكر طريقة التنظيف الموصى بها لكل عنصر في جدول المواد.
    1. تنظيف مرشحات الهواء المطاطي مع الإيثانول 70٪. كن حذرا جدا لعدم ترطيب مرشح الداخلية!
    2. جمع جميع المكونات المنفصلة: أنابيب متوسطة، والخزانات المتوسطة، والأنابيب الزجاجية، والمقابس لوير الذكور وأقفال لوير الإناث، قبعات لوير الأبيض، قنوات الضغط، المخاريط الأنف، سيليكون O-الحلقات، محول بوشينج، مستقيم تدفق (باستثناء مضخات، وحدات السوائل، مرشحات الهواء المطاطي، قاعدة المفاعل الحيوي)، وشطف في مياه الصنبور الجارية.
    3. ضع O/N في 0.1٪ دودسيلسلفات الصوديوم في الماء deionized.
      ملاحظة: لا تستخدم المياه فائقة النبور حيث قد تصدأ الأجزاء.
    4. شطف مع ماء الصنبور والصابون غسل الصحون.
    5. تزج في الماء deionized، تليها 70٪ الإيثانول مرتين، تليها المياه deionized.
    6. ضع جميع المواد بشكل منفصل على الأنسجة الورقية والسماح لها الجافة. استخدام الهواء الضغط إلى الأنابيب الجافة.
    7. تنظيف جميع المواد غير القابلة للاعتراف الذاتي مع نسيج ورقي غارق في الإيثانول 70٪. وهذا يشمل مرشح الهواء المطاطي (ضع في اعتبارك أن فلتر الهواء يجب أن يبقى جافا) وقاعدة المفاعل الحيوي (تفلون بيلو واسطوانة هوائية).
    8. أوتوكلاف مكونات الغرفة السائلة (بما في ذلك حلقة O السيليكون) ، والأنابيب المتوسطة ، والخزانات المتوسطة (بدون فلتر الهواء المطاطي) ، ومقابس Luer الذكور وأزواج Luer الأنثوية ، وقبعات Luer البيضاء ، ومقاطع الخرطوم ، والمعدات القياسية (على سبيل المثال ، الملاقط ، مقص اللقط)
    9. للاستخدام المريح أثناء التجارب التالية، اجمع المكونات المنفصلة لغرفة سائلة كاملة واحدة في صندوق قابل للاستراف التلقائي.
  4. إزالة المياه من الخزان الهيدروليكي. نظيفة مع الإيثانول 70٪، تليها المياه deionized. دعه يجف. إعادة تعبئة مع المياه deionized وبضع قطرات من المياه حمام الحفاظ على مطهر.
  5. تخزين أنابيب الزجاج لغرفة ثقافة التدفق في الإيثانول 70٪.
  6. ضع حبات تجفيف السيليكا الرطبة (المظهر الأبيض) في الفرن O/N عند 120 درجة مئوية للسماح لها بالجفاف (المظهر البرتقالي)، وتخزينها في قارورة محكمة الهواء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير هذا المفاعل الحيوي لدراسة الآثار الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على نمو الأنسجة الوعائية وإعادة عرضها في سقالات المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد. تصميم المفاعل الحيوي يسمح لزراعة ما يصل إلى ثمانية بنيات الأوعية الدموية تحت ظروف التحميل المختلفة(الشكل 1A). يتم وضع البنى الوعائية في غرفة ثقافة التدفق(الشكل 1B)حيث يمكن التحكم بشكل مستقل في كل من الامتداد المحيطي وWSS. المقصورة العلوية من غرفة ثقافة التدفق يحمل مستقيم تدفق لتحقيق الاستقرار في تدفق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح المفاعل الحيوي الموصوف هنا بإجراء تقييم منهجي لمساهمات التأثيرات الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على الالتهاب وتجديد الأنسجة في السقالات القابلة للتكثير الأنبوبي. ويتيح هذا النهج أيضا إجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التحليلات على البنى الوعائية، كما يتضح من قسم النتائج التمثيلية. وتبين هذه النتائج الأثر المميز لمختلف نظم التحميل الهيمودية (أي مجموعات مختلفة من القص والتمدد) على كل من نمو وإعادة تصميم بناء TEVG. هذه الأفكار، التي تم جمعها عبر هذه المنصة في المختبر، والمساعدة في تحسين المعلمات تصميم سقالة لت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل ZonMw كجزء من برنامج LSH 2Treat (436001003) ومؤسسة الكلى الهولندية (14a2d507). ن. أ. ك. تعترف بدعم مجلس البحوث الأوروبي (851960). ونعرب عن امتناننا لبرنامج الجاذبية "تجديد المواد المدفوعة"، الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي (024.003.013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco المتقدمة s تعديل EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015وسط زراعة الخلايا للأرومات الليفية
Aqua StabilJulabo8940012يمنع نمو الكائنات الحية الدقيقة في المفاعل الحيوي - الخزان الهيدروليكي
البقريSigmaF8630لتحضير هلام الفيبرينوجين لبذر الخلايا على السقالة
الثرومبين البقريSigmaT4648لتحضير جل الفيبرينوجين لبذر الخلايا الموجودة على السقالة
جهاز الطرد المركزيEppendorf5804لتدوير الخلايا والوسط
المكيف مقص المشبك - "ملقط كيلي"AlmedicP-422مشبك أنبوب السيليكون وتطبيق التمدد المسبق على السقالة بحيث يمكن خياطة السقالة في الأخدود المحفور (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
حاضنات زراعة خلايا CO2سانيوMCO-170AIC-PEلزراعة الخلايا خزان
الهواء المضغوطFestoCRVZS-5تنعيم تقلبات ضغط الهواء وخلق تأخيرات زمنية لتراكم الضغط
Matlab المخصص لحساب الحد الأقصى للامتداداتMatlabR2017. تحسب Mathworks و Natick و MAالحد الأدنى والحد الأقصى للقطر الخارجي لسقالة المغزولة
لمجلس الحصول على البياناتNational InstrumentsBNC-2090معالجة البيانات بين نظام مكبر الصوت والكمبيوتر
EthanolVWRVWRK4096-9005للحفاظ على ظروف العمل
المعقمة مصل عجل الجنين البقري (FBS)Greiner758087مكمل متوسط لثقافة الخلية.
مقصورات غرفة ثقافة التدفق المكملة للمصل ، تتكون من قناة ضغط مع أخاديد محفورة وثقوب صغيرة للضغط على أنابيب السيليكون ، وخيط لولبي ، ومخروط أنف ، ومقصورة علوية مع مدخل تدفق ومخرج تدفق المقصورة السفلية ، وجلبة محولحسب الطلب ، قسم الهندسة الطبية الحيوية ، جامعة أيندهوفن للتكنولوجيا،مقصورات غرفة ثقافة التدفق (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
HE40567002 مساعدماصة باستور الزجاجيةتطبيق الفراغ على سقالة كهربائية (الأوتوكلاف في الخطوة 1)
الأنابيب الزجاجية لغرفة ثقافة التدفقCuston المصنوعة والمعدات و / amp مركز النموذج الأولي ، جامعة أيندهوفن للتكنولوجيا، وهوجزء من غرفة ثقافة التدفق (نظف وخزن في 70٪ من الإيثانول ، في الخطوتين 1 و 7)
GlutaMaxGibco35050061مكمل الأحماض الأمينية المتوسطة لزراعة الخلايا ، يقلل من تراكم الأمونيا
كاميرا عالية السرعةMotionScopeM-5لمراقبة التمدد أثناء الثقافة ؛ يتم التقاط صور فوتوغرافية بفاصل زمني للسقالات بتردد 30 هرتز لمدة 6 ثوان (أي 3 دورات تمديد)
عدسة الكاميرا عالية السرعة - Micro-NIKKOR 55mm f / 2.8 - عدسةنيكون JAA616ABلمراقبة التمدد أثناء الاستزراع ؛ يتم التقاط صور الفوتوغرافية بفاصل زمني للسقالات بتردد 30 هرتز لمدة 6 ثوان (أي 3 دورات تمديد)
مشبك خرطومibidi GmbH10821كتلة التدفق المتوسط (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
خزان هيدروليكي مع 8 خيوط لولبية ل 8 غرف ثقافة تدفقحسب الطلب ، قسم الهندسة الطبية الحيوية ، جامعة أيندهوفن للتكنولوجياNAلتطبيق الضغط على التركيبات المثبتة على السيليكون (نظف من الخارج بمنديل ورقي يحتوي على 70٪ من الإيثانول ، اشطف الخزان بنسبة 70٪ من الإيثانول متبوعا بماء ديمي ، في الخطوتين 1 و 7)
نظام مضخة Ibidi (8x) بما في ذلك مضخة ibidi ، برنامج PumpControl ، وحدة السوائل ، مجموعة التروية (أنابيب متوسطة) ، أنابيب ضغط الهواء ، زجاجات التجفيف مع حبات السيليكا البرتقاليةibidi GmbH10902التي تم إعدادها للتحكم في التدفق في غرف ثقافة التدفق. ملاحظة 1: تم تعديل مضخات ibidi من قبل الشركة المصنعة لتمكين سعة 200 mbar. ملاحظة 2: يمكن استبدالها بنظام مضخة من مصنع آخر ، طالما يمكن تطبيق نفس أنظمة التدفق.
السكاكين (شفرات معقمة رقم 10 ، حزمة رقائق فردية) ومقبض مشرط (فولاذ مقاوم للصدأ ، ملفوف بشكل فردي)Swann Morton0301 ؛ 0933لقطع أنابيب السيليكون بالحجم الصحيح للسقالة وقطع مادة الخياطة
LabVIEW SoftwareNational Instrumentsالإصدار 2018للتحكم في التمدد المطبق على السقالات خزانة
السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجيةLabconco302310001لضمان ظروف عمل معقمة. يستخدم الأشعة فوق البنفسجية لتطهير كل شيء لا يمكن تعقيمه أو لمسه بعد التعقيم
أطباق بتري الكبيرة والصغيرةGreiner664-160لظروف العمل المعقمة
حمض الأسكوربيك L-ascorbic 2-phosphate (فيتامين C)مكمل متوسط لثقافة الخلاياSigmaA8960
مصدر بارد ضوء LED KL2500ZeissSchott AGللمساعدة في تصور الفاصل الزمني للسقالات أثناء مراقبة
أقفال وموصلات Luer (الإناث والذكور) ، أغطية اللور البيضاءibidi GmbHمختلفة ، انظر (https://ibidi.com/26-flow-accessories)لإغلاق أو توصيل أجزاء من المفاعل الحيوي ومضخة ibidi (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7) قياس
مكبر الصوت (PICAS)أدوات PEEKEL BV.n.a.لتضخيمالإشارة من مستشعر الضغط والتغذية المرتدة إلى
خزان LabView المتوسط (محاقن كبيرة 60 مل) وحاملي الخزانibidi GmbH10974الخزان المتوسط (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
أنابيب متوسطة بقطر خارجي 4.25 مم وقطر داخلي 1 مممطاط BV1805للسماح بمعدل تدفق أكبر ، يتم استخدام أنبوب IBII المتوسط بقطر أكبر. ملاحظة: جزء الأنابيب المتوسطة الموجهة من خلال صمامات وحدة السوائل هو نفس الأنبوب الافتراضي ibidi
متوسط برنامج Motion StudioIdtvision2.15.00لجعل صور الفاصل الزمني عالية السرعة لمراقبة التمدد
إبرة (19G)BD Microlance301700جنبا إلى جنب مع أنابيب مرنة رقيقة تستخدم لملء الخزان الهيدروليكي بالماء عالي النقاء دون إضافة فقاعات الهواء
سائق الإبرة2429218 Adsonللتعامل مع إبرة خياطة النايلون من خلال أنبوب السيليكون (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
المناديل الورقيةKleenex38044001لتنظيف المعدات باستخدام 70٪ من الإيثانول
ParafilmSigmaP7793-1EAإصلاح سريع في حالة حدوث تسرب
البنسلين / الستربتومايسين (P / S) LonzaDE17-602Eمكمل متوسط لثقافة الخلايا ؛ منع البكتيريا تلوث
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)SigmaP4417-100TABلخطوات التخزين والغسيل (الأوتوكلاف في الخطوة 1)
حاويات بلاستيكية (60 مل) بأغطية لولبية حمراءGreiner206202لتحضير محلول الفيبرينوجين
اسطوانة هوائيةFestoAEVC-20-10-I-Pلتشغيل خوار التفلون (نظف بمنديل ورقي يحتوي على 70٪ إيثانول في الخطوتين 1 و 7)
سقالات أنبوبية Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) (قطر داخلي 3 مم ، 200 وميكرو ؛ م سمك الجدار ، طول 20 مم)SyMO-Chem ، أيندهوفن ، هولنداn.a.producedباستخدام الغزل الكهربائي من 15٪ (وزن / وزن) محاليل البوليمر الكلوروفورم (سيجما ؛ 372978). انظر Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) لمزيد من التفاصيل
قناة الضغط بدون ثقوب (للتحكم الثابت)حسب الطلب ، قسم الهندسة الطبية الحيوية ، جامعة أيندهوفن للتكنولوجياNAلتركيب أنابيب كهربائية على أنابيب السيليكون (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
مستشعر الضغط ومحول الطاقةBDTC-XX و P 10 EZيتم رفع ضغط الهواء المتجه إلى المضخة التي تعمل بالهواء المضغوط حتى يصل إلى الضغط المحدد
صمام التحكم في ضغط الهواء النسبي ومستشعر الضغطFestoMPPES-3-1 / 8-2-010 ، 159596يوفر الهواء المضغوط للمضخة الهوائية التي يتم تشغيلها معهد
روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI-1640) وسطA1049101 Gibcoللخلية الأحادية / البلاعم
قفل آمن أنابيب Eppendorf (1.5 مل)Eppendorf30120086تطبيقات متعددة (الأوتوكلاف في الخطوة 1)
محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم 20٪Sigma5030يستخدم لتنظيف المواد بتركيز 0.1٪.  
حلقات سيليكون OTechnirub1250Sلمنع التسرب (الأوتوكلاف في الخطوة 1 ، الخطوة 7)
أنابيب سيليكون (قطر خارجي 2.8 مم ، سمك جدار 400 ميكرومتر)مطاط BV1805لتركيب الأنابيب الكهربائية على قنوات الضغط (الأوتوكلاف في الخطوة 1)
أنبوب معقم (15 مل)فالكون352095تطبيقات متعددة
خياطة ، 5-0 برولين مع إبرة نقطة تفتق متصلة مسبقاإثيكون وجونسون وأمبير سلكEH7404HProlene 5-0 (طول 75 سم ، إبرة نقطة تفتق TF ، دائرة 1/2 ، طول إبرة 13 مم)
حقنة (24 مل)B. 2057932 Braun Melsungen AGلإضافة الماء عالي النقاء أو الوسط إلى الخزان الهيدروليكي أو مرشح حقنة غرفة ثقافة
التدفق (0.2 وميكرو ؛ م)Satorius17597-Kلتصفية محلول الفيبرينوجين
قارورة ثقافة الخلايا T150 مع غطاء مرشحNunc178983 لتفريغ وسط ثقافة
T75 قارورة ثقافة الخلية مع غطاء مرشحNunc156499لزراعة عينات التحكم الثابتة
تفلون خوارحسب الطلب ، قسم الهندسة الطبية الحيوية ، جامعة أيندهوفن للتكنولوجياn.a.لتحميل الخزان الهيدروليكي (نظف من الخارج بمنديل ورقي يحتوي على 70٪ إيثانول في الخطوتين 1 و 7)
صينية (من الفولاذ المقاوم للصدأ)PolarWare15-248لسهولة نقل غرف زراعة السوائل والمفاعل الحيوي من الحاضنة إلى خزانة التدفق الصفحي والظهر (نظف بمنديل ورقي يحتوي على 70٪ إيثانول قبل الاستخدام وبعده)
ملاقطWironit4910معالجة معقمة للأجزاء الفردية (الأوتوكلاف في الخطوتين 1 و 7)
18200002 للأشعة فوق البنفسجيةللمياه فائقةالنقاء Stakpureلتصحيح التبخر المتوسط ، ممزوجا بثبات مائي مختلط ويستخدم كسائل هيدروليكي. (ماء الأوتوكلاف فائق النقاء في الخطوة 1)
ضوء الأشعة فوق البنفسجيةPhilipsTUV 30W / G30 T8لإزالة التلوث من الطعوم وأجزاء المفاعل الحيوي قبل البذر
الفيبرينوجين الكهربائية الكهربائية نص الكهربائية ، مهم لإنتاج الكولاجين زراعة الخلايا خياطة جونسون Omniapure

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54(2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951(2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161(2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102(2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18(2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22(2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29(2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87(2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689(2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages - implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249(2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383(2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009(2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646(2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009(2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1

مقالات ذات صلة