مقالة منهجية

تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

DOI:

10.3791/61826

⸱

نوفمبر 5, 2020

 ,  ,  , 
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تنقية التوبولين من مصادر صغيرة / متوسطة الحجم مثل الخلايا المستزرعة أو أدمغة الماوس الواحدة ، وذلك باستخدام دورات البلمرة وإزالة البوليمر. يتم إثراء التوبولين المنقى في أنواع متساوية محددة أو لديه تعديلات محددة بعد النقل ويمكن استخدامه في فحوصات إعادة تشكيل المختبر لدراسة ديناميكيات microtubule والتفاعلات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد الجوانب الهامة لدراسات الهيكل الخلوي microtubule هو التحقيق في سلوك microtubule في تجارب إعادة تشكيل المختبر. أنها تسمح بتحليل الخصائص الجوهرية لل microtubules، مثل الديناميات، وتفاعلاتها مع البروتينات المرتبطة microtubule (MAPs). "رمز توبولين" هو مفهوم الناشئة التي تشير إلى isotypes توبولين مختلفة ومختلف التعديلات ما بعد النقل (PTMs) والمنظمين للخصائص microtubule والوظائف. لاستكشاف الآليات الجزيئية للشفرة التوبولين, من المهم إجراء تجارب إعادة تشكيل في المختبر باستخدام tubulin تنقية مع isotypes محددة وPTMs.

حتى الآن، كان هذا تحديا من الناحية الفنية كما توبولين الدماغ، والذي يستخدم على نطاق واسع في التجارب المختبرية، ويؤوي العديد من PTMs ولها تكوين isotype محددة. ومن ثم، وضعنا هذا البروتوكول لتنقية التوبولين من مصادر مختلفة ومع التراكيب isotype مختلفة وPTMs التي تسيطر عليها، وذلك باستخدام النهج الكلاسيكي من البلمرة ودورات إزالة البوليمر. بالمقارنة مع الأساليب القائمة القائمة على تنقية تقارب، وهذا النهج ينتج نقية، البلمرة المختصة التوبولين، كما يتم التخلص من أنبوبولين مقاومة للبوليمرة أو إزالة البوليمر خلال خطوات تنقية المتعاقبة.

نحن نصف تنقية التوبولين من خطوط الخلية ، التي تزرع إما في التعليق أو كثقافات معتنقة ، ومن أدمغة فأرة واحدة. تصف الطريقة أولا توليد كتلة الخلية في كل من إعدادات التعليق والتمسك ، وهي خطوة التحلل ، تليها المراحل المتعاقبة لتنقية التوبولين عن طريق دورات البلمرة والتخلص من البوليمر. تنتج طريقتنا التوبولين الذي يمكن استخدامه في التجارب التي تعالج تأثير رمز التوبولين على الخصائص الجوهرية للميكروبات وتفاعلات microtubule مع البروتينات المرتبطة بها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الخلايا الدقيقة أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الخلوية. أنها تعطي الخلايا شكلها، وبناء المغزل ميوتيك وميتوتيك للفصل الكروموسوم، وبمثابة مسارات للنقل داخل الخلايا. لأداء هذه الوظائف المتنوعة، تنظم البيبات الدقيقة نفسها بطرق مختلفة. أحد الأسئلة المثيرة للاهتمام في هذا المجال هو فهم الآليات الجزيئية التي تسمح للخلايا الدقيقة المحفوظة هيكليا وتطوريا بالتكيف مع هذا العدد الكبير من المنظمات والوظائف. آلية واحدة محتملة هي تنويع microtubules ، والتي يتم تعريفها من خلال المفهوم المعروف باسم "رمز توبولين"1،2،3. يتضمن رمز توبولين عنصرين رئيسيين: الدمج التفاضلي للمنتجات الجينية α β-توبولين (أنواع توبولين) في الأنابيب الدقيقة وتعديلات ما بعد النقل الأنبوبي (PTMs).

منذ السبعينيات، مهدت تجارب إعادة تشكيل المختبر، إلى جانب تقنيات المجهر الخفيف المتطورة، الطريق لاكتشافات مهمة حول خصائص الميكروبات: عدم الاستقرار الديناميكي4 والمطحنة5،وآلياتها ووظائفها الأخرى6و7و8و9و10و11و12و13و14و15. تقريبا جميع التجارب في المختبر التي أجريت حتى الآن وقد استندت على tubulin تنقيتها من أنسجة المخ باستخدام دورات متكررة من البلمرة وإزالة البوليمر16،17. على الرغم من أن تنقية من أنسجة الدماغ يمنح ميزة الحصول على توبولين عالية الجودة بكميات كبيرة (عادة كميات غرام), عيب واحد مهم هو التغايرية كما tubulin تنقيتها من أنسجة الدماغ هو مزيج من isotypes توبولين مختلفة ويتم إثراء مع العديد من PTMs توبولين. هذا التغايرية يجعل من المستحيل تحديد دور PTM توبولين معينة أو isotype في السيطرة على خصائص microtubule والوظائف. وبالتالي، إنتاج التوبيولين التجميع المختصة مع PTMs توبولين الخاضعة للرقابة وتكوين isotype متجانسة أمر ضروري لمعالجة الآليات الجزيئية للرمز توبولين.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج لتنقية التوبولين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام TOG microtubule ملزمة (الجينات المفرطة في التعبير عن الورم) مجال الخميرة Stu2p18. في هذه الطريقة ، يتم تمرير التوبولين في اللخص الخام من الخلايا أو الأنسجة من خلال عمود حيث يرتبط بمجال TOG المشلولين بالمصفوفة ، والذي يسمح بتحليل بركة التوبولين بأكملها لعينة معينة ، حتى صغيرة جدا. كما تم وصف نهج طال انتظاره لتنقية التوبولين المؤتلف في السنوات الأخيرة. وهو يقوم على نظام فيروس الباكولو ، حيث يتم التعبير عن ناقل ثنائي ال سيسترونيك يحتوي على جينات α β توبولين في خلايا الحشرات19. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة مرهقة جدا وتستغرق وقتا طويلا، وبالتالي تستخدم في الغالب لدراسة تأثير الطفرات التوبولين20 وأنابيب isotypes21،22،23 في المختبر.

في البروتوكول الحالي، ونحن نصف الطريقة التي تستخدم راسخة وتستخدم على نطاق واسع نهج البلمرة-depolymerization كمخطط لتوليد توبولين مع مستويات مختلفة من التعديل إما من خطوط الخلية أو من أنسجة الدماغ الماوس24. في هذا الإجراء، يتم تدوير التوبولين بين القابل للذوبان (أنبوبي ديمر في 4 درجة مئوية) وشكل بلمرة (microtubule في 30 درجة مئوية في وجود جوانوسين 5'-ثلاثي الفوسفات [GTP]). يتم فصل كل نموذج من خلال خطوات متتالية من الطرد المركزي: ستبقى أجهزة الدرنات في النتواة الفائقة بعد دوران بارد (4 درجة مئوية) ، في حين سيتم إعادة الكريات الدقيقة عند 30 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ خطوة واحدة البلمرة في ارتفاع piperazine- N،N′-bis(2-ethanesulfonic حمض) (PIPES) التركيز، والذي يسمح لإزالة البروتينات المرتبطة microtubule من microtubules وبالتالي، من tubulin تنقية أخيرا. Tubulin تنقيتها من خلايا هيلا S3 نمت كما تعليق أو الثقافات المنضمة خالية تقريبا من أي PTM tubulin وقد استخدمت في التجارب الأخيرة في المختبر إعادة تشكيل25,26,27,28. لقد قمنا كذلك بتكييف الطريقة لتنقية التوبولين من أدمغة فأرة واحدة ، والتي يمكن استخدامها لعدد كبير من نماذج الماوس مع تغييرات في أنواع التوبولين وPTMs.

في البروتوكول، ونحن أول وصف جيل من المواد المصدر (كتلة الخلية أو أنسجة الدماغ)، تحلل لها (الشكل 1A)،تليها الخطوات المتتالية من البلمرة توبولين وإزالة البوليمر لتنقية التوبولين (الشكل 1B). ونحن كذلك وصف عملية لتقييمنقاء (الشكل 2A، B)وكمية (الشكل 3A، B) من tubulin المنقى. ويمكن تكييف هذه الطريقة لإنتاج التوبولين المخصب مع PTM مختارة عن طريق الإفراط في التعبير عن انزيم تعديل في الخلايا قبل تنقية التوبولين (الشكل 4B). بدلا من ذلك، يمكن إضافة الإنزيمات المعدلة للتوبولين إلى التوبولين أثناء عملية التطهير. وأخيرا، يمكننا تنقية tubulin تفتقر إلى isotypes محددة أو PTMs من أدمغة الفئران ناقصة في الإنزيمات تعديل tubulin المقابلة (الشكل 4B)29.

الطريقة التي نصفها هنا لها ميزتان رئيسيتان: (1) أنها تسمح بإنتاج كميات كبيرة بما فيه الكفاية من التوبولين في وقت قصير نسبيا ، و (2) تولد توبولين نقي عالي الجودة ، مع تكوين أي نوع توبولين محدد أو PTMs. في الفيديو المصاحب لهذه المخطوطة، نسلط الضوء على بعض الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها هذا الإجراء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت رعاية الحيوانات واستخدامها لهذه الدراسة وفقا لتوصيات الجماعة الأوروبية (2010/63/UE). وقد وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد كوري CEEA-IC #118 (التفويض رقم 04395.03 الصادر عن السلطة الوطنية) على الإجراءات التجريبية امتثالا للمبادئ التوجيهية الدولية.

1. إعداد الكواشف لتنقية توبولين

ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع المخازن المؤقتة المستخدمة لتنقية التوبولين على أملاح البوتاسيوم وليس أملاح الصوديوم30.

  1. إعداد 1 لتر من المتوسط الكامل: متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM)، مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS، 100 مل)، 200 مل L-glutamine (10 مل من مخزون 2 M)، و1x البنسلين-ستريبتوميسين (10 مل من مخزون 100x). يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. إعداد هيدروكسيد البوتاسيوم 10 M (KOH) عن طريق حل 140 غرام من KOH في الماء، وضبط الحجم النهائي إلى 250 مل، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد 0.5 M إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA), درجة الحموضة 8, عن طريق حل 36.5 غرام من EDTA في الماء, ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام KOH (وإلا EDTA لن تذوب) والحجم النهائي إلى 250 مل, تصفية تعقيم, وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد 5 MM الفوسفات العازلة المالحة (PBS)-EDTA بإضافة 5 مل من 0.5 M EDTA إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني، تصفية تعقيم، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد 0.5 M K-PIPES، درجة الحموضة 6.8، عن طريق حل 75.5 غرام من الأنابيب في الماء، والتكيف مع درجة الحموضة 6.8 مع KOH (وإلا PIPES لن تذوب) والحجم النهائي إلى 500 مل، تصفية تعقيم، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  6. إعداد 1 M K-PIPES، درجة الحموضة 6.8، عن طريق حل 15.1 غرام من الأنابيب في الماء، والتكيف مع درجة الحموضة 6.8 مع KOH وحجم النهائي إلى 50 مل، تصفية التعقيم، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  7. إعداد 0.5 M البوتاسيوم-الإيثيلين غليكول-بيس (β-أمينوثيل الأثير)-N,N,N′,N′-حمض رباعي الأسيتيك (K-EGTA, درجة الحموضة 7.7) عن طريق حل 47.5 غرام من EGTA في الماء, ضبط درجة الحموضة 7.7 مع كوه والحجم النهائي إلى 250 مل, تصفية تعقيم, وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  8. إعداد BRB80 (80 MM K-PIPES، درجة الحموضة 6.8؛ 1 MM K-EGTA؛ 1 mM كلوريد المغنيسيوم [MgCl2]) الحل عن طريق خلط 3.2 مل من 0.5 M PIPES، 40 ميكرولتر من 0.5 M K-EGTA، و 20 ميكرولتر من 1 M MgCl2 وضبط الحجم النهائي إلى 20 مل. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. إعداد 0.1 M فينيل ميثانسولفونيل فلوريد (PMSF) عن طريق حل 435 ملغ من PMSF في ايزوبروبانول للحصول على حجم نهائي من 25 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  10. إعداد مثبطات بروتياز مزيج (200x) عن طريق حل 10 ملغ من aprotinin، 10 ملغ من leupeptin، و 10 ملغ من 4-(2-aminoethyl)-البنزينسولفونيل الفلوريد في الماء للحصول على حجم نهائي من 2.5 مل، وجعل الاقتباسات من 100 ميكرولتر، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  11. إعداد 10٪ تريتون X-100 عن طريق خلط 5 مل من تريتون X-100 في 45 مل من الماء، تصفية التعقيم، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  12. إعداد تحلل العازلة (BRB80 تستكمل مع 1 MM 2-mercaptoethanol, 1 MM PMSF, 1x مثبطات البروتيز مزيج و, اختياريا لخلايا HEK-293, 0.2٪ تريتون X-100) في يوم تنقية التوبولين عن طريق خلط 20 مل من BRB80 مع 1.5 ميكرولتر من 2-ميركابتوثانول، 200 ميكرولتر من 0.1 M PMSF، 100 ميكرولتر من مثبطات البروتيز مزيج و، اختياريا لخلايا HEK-293 ، 400 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100.
    ملاحظة: 2-ميركابتوثانول سامة وينبغي استخدامها في غطاء الدخان.
  13. إعداد 0.2 M GTP عن طريق حل 1 غرام من GTP في 9.5 مل من الماء، وضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام كوه، وجعل aliquots من 20 ميكرولتر، وتخزينها في -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجميد والذوبان.
  14. إعداد 1 M تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (تريس-HCl) عن طريق حل 60.56 غرام من تريس في الماء، والتكيف مع درجة الحموضة 6.8 مع HCl، كاملة إلى حجم نهائي من 500 مل، تصفية التعقيم، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  15. إعداد 5x Laemmli عينة العازلة (450 mM dithiothreitol (DTT)؛ 10٪ دودسيلسلفات الصوديوم (SDS)؛ 400 ميكرومتر تريس-HCl، درجة الحموضة 6.8; 50٪ الجلسرين; ~ 0.006٪ بروموفينول الأزرق) عن طريق إضافة 4 غرام من SDS إلى 16 مل من مسخن 1 M تريس-HCl, درجة الحموضة 6.8, وخلط الحل بلطف. إضافة 2.6 غرام من DTT و 20 مل من 100٪ الجلسرين إلى المزيج ويحرك حتى يصبح الحل متجانسة. أضف الكمية المطلوبة من بروموفينول الأزرق (2.5 ملغ) للوصول إلى كثافة اللون المطلوبة. جعل 5 مل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية. إعداد حل العمل 2X من Laemmli عينة العازلة عن طريق تمييع المخزون 5x في الماء المقطر.

2. تضخيم وحصاد مصادر التوبولين

ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمت ثلاثة مصادر للتبولين: '1' الخلايا (HeLa S3 و HEK-293) التي نمت كثقافات تعليق؛ '2' الخلايا (HeLa S3 و HEK-293) التي نمت كثقافات تعليق؛ '2' الخلايا (HeLa S3 و HEK-293) التي نمت كثقافات تعليق؛ '2' الخلايا (HeLa S3 و HEK-293) التي نمت كث '2' الخلايا التي تنمو كثقافات معتنقة (HEK-293 و HeLa وU2 OS)؛ و (3) أنسجة دماغ الفأر. يعتبر هذا البروتوكول يوم تنقية التوبولين "اليوم 0" وبناء على ذلك ، تم وصف خطوات أخرى بالنسبة لليوم 0.

  1. تضخيم الخلايا
    1. الخلايا المزروعة كثقافات تعليق
      ملاحظة: لتنقية التوبولين بنجاح من ثقافات التعليق، استخدم على الأقل 2 لتر من ثقافة التعليق.
      1. ل 2 L من ثقافة تعليق, إحياء وتنمو نوع الخلية المفضلة للحصول على 6 × 107 خلايا قبل 10 أيام من يوم التحضير. في اليوم -10، لوحة الخلايا على ستة أطباق قطرها 15 سم في 107 خلايا لكل لوحة.
      2. في اليوم -8، سخني الكمية المطلوبة من الوسط الكامل إلى 37 درجة مئوية. إضافة 1 لتر من المتوسطة ساخنة مسبقا إلى كل زجاجة الدوار في ظل ظروف معقمة. ضع المغازل على طاولة التحريك المحددة في 20-25 دورة في الدقيقة داخل حاضنة ثقافة الخلية ، وافتح قليلا قبعات الدوار الجانبية للسماح للوسط بالتوازن مع جو الحاضنة.
        ملاحظة: لتجنب أي تلوث، تنظيف السطح الخارجي تماما من وسائل الإعلام وزجاجات الدوار باستخدام الإيثانول 70٪.
      3. في اليوم -7، جرب وجمع الخلايا نمت إلى التقاء 80-90٪ (حوالي 1.8 × 108 خلايا). جمع الخلايا من 3 أطباق في وقت واحد، تدور أسفل (200 × غرام،5 دقائق، ودرجة حرارة الغرفة)، وإعادة تعليق جميع الخلايا في 10 مل من DMEM.
        ملاحظة: الفصام الشامل للخلايا في هذه المرحلة مهم جدا لتجنب تشكيل مجاميع أكبر في زجاجات الدوار، مما يؤثر على بقاء الخلية ويؤدي إلى انخفاض العائد التوبولين.
      4. إضافة 5 مل من تعليق الخلية إلى كل زجاجة الدوار التي تحتوي على 1 لتر من DMEM، والعودة المغازل إلى طاولة stirrer في حاضنة ثقافة الخلية، والسماح للخلايا تنمو لمدة أسبوع واحد.
    2. الخلايا المزروعة كثقافات معتنقة
      ملاحظة: لتنقية التوبولين بنجاح من الخلايا الملتصقة، استخدم ما لا يقل عن 10 أطباق من التقاء 80-90٪.
      1. إحياء وتضخيم نوع الخلية المطلوبة للحصول على 1 × 108 خلايا قبل ثلاثة أيام من يوم إعداد توبولين.
      2. في اليوم -3، لوحة هذه الخلايا على عشرة أطباق 15 سم في 1 × 107خلايا لكل طبق والسماح لهم بالنمو التقاء 80-90٪.
      3. في اليوم -1، إذا لزم الأمر، خلايا العدوى مع البلازميد للتعبير عن إنزيم تعديل توبولين أو ايزوبيل توبولين معينة.
  2. حصاد الخلايا / أنسجة الدماغ
    1. الخلايا المزروعة كثقافات تعليق
      1. نقل تعليق الخلية من المغازل إلى زجاجات الطرد المركزي 1 لتر (جدول المواد) وخلايا بيليه في 250 × غرام، 15 دقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة. للبدء فورا ثقافة أخرى من خلايا هيلا S3 في زجاجات الدوار، وترك 100 مل من تعليق الخلية في المغازل، وإضافة 1 لتر من كامل، DMEM ساخنة مسبقا إلى زجاجة الدوار.
        ملاحظة: تحقق بعناية من التلوث البكتيري قبل المتابعة لتنقية التوبولين.
      2. Resuspend الكريات الخلايا من كل زجاجة الطرد المركزي في 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، ونقل جميع الخلايا إلى أنابيب المسمار كاب 50 مل. أثناء إعادة تعليق، والحفاظ على الخلايا على الجليد. بيليه الخلايا في 250 × غرام، 15 دقيقة ، 4 درجة مئوية.
        ملاحظة: اتبع توصيات لتنظيف زجاجة الدوار والتخزين (انظر جدول المواد).
      3. تجاهل supernatant وتحديد حجم بيليه الخلية. من 2 لتر من ثقافة التعليق (زجاجتين الدوار)، نتوقع بيليه خلية من 5-6 مل.
        ملاحظة: في البروتوكول الموضح أدناه، يفترض أن يكون حجم بيليه الخلية 10 مل. ضبط التجربة وفقا لأحجام بيليه.
      4. إضافة 1 حجم (10 مل) من العازلة تحلل وإعادة تعليق بيليه الخلية.
        ملاحظة: نسبة حجم بيليه الخلية إلى حجم العازلة تحلل مهم جدا لتنقية التوبولين ناجحة. إضافة المزيد من العازلة تحلل يقلل من تركيز التوبولين، الذي فشل بعد ذلك للوصول إلى التركيز الحرج اللازم للبوليمرة، وبالتالي الحد بشكل كبير من العائد توبولين.
        ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا التي أعيد إنفاقها في حاجز التحلل في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة شهرين.
    2. الخلايا المزروعة كثقافات معتنقة
      ملاحظة: يجب حصاد الخلايا من الثقافات الملتصقة بسرعة كبيرة لتنقية التوبولين الناجحة (حوالي 15 دقيقة لحصاد عشرة أطباق 15 سم). وشارك ثلاثة أشخاص في هذه الخطوة من البروتوكول.
      1. إزالة المتوسطة من أطباق 15 سم عن طريق ميل الأطباق، ومن ثم غسل الخلايا بلطف مع 7 مل من PBS-EDTA في درجة حرارة الغرفة (الشخص 1). العمل فقط مع ثلاثة أطباق 15 سم في وقت واحد لتجنب ترك الخلايا دون المتوسطة أو العازلة.
      2. إضافة 5 مل من PBS-EDTA إلى الخلايا واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      3. استخدام رافع الخلية لفصل بلطف الخلايا عن طريق جرف لهم إلى حافة واحدة من الطبق (الشخص 2)، وجمع جميع الخلايا في أنبوب المسمار كاب 50 مل (الشخص 3). شطف كل لوحة مع 2 مل إضافية من PBS-EDTA لجمع أي خلايا المتبقية من الأطباق. خلال هذه الخطوة، والحفاظ على أنبوب المسمار كاب 50 مل التي تحتوي على تعليق الخلية على الجليد.
      4. بيليه الخلايا في 250 × غرام، 10 دقيقة ، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وتحديد حجم بيليه الخلية. نتوقع حجم ~ 1 مل من عشرة أطباق 15 سم.
        ملاحظة: في البروتوكول الموضح أدناه، يفترض أن يكون حجم بيليه الخلية 10 مل. ضبط التجارب وفقا لأحجام بيليه.
      5. Resuspend الخلايا في 1 حجم (10 مل) من تحلل العازلة.
        ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا التي أعيد إنفاقها في المخزن المؤقت للتحلل عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
    3. أنسجة المخ
      ملاحظة: يمكن استخدام الفئران من أي عمر أو جنس أو خلفية وراثية. وسيتوقف اختيار سلالة الفأر المعدلة وراثيا على المسألة العلمية التي يتعين معالجتها. في هذه المخطوطة، نعرض مثال توبولين تنقيتها من ttll1-/- الماوس، تفتقر إلى إنزيم الجلوتاميلات الدماغ الرئيسية، وتوبولين التيروزين ليغانيس مثل 1 (TTLL1) البروتين31.
      1. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم، وقطع رأس بسرعة، وجمع الدماغ في أنبوب الجولة القاع. إذا كان هناك فائض في الدم على الدماغ، ويغسل بسرعة مع العازلة تحلل. جمع الدماغ بمجرد التضحية الماوس كما تأخير ما بعد الوفاة يمكن أن تؤثر على نجاح تنقية التوبولين. استخدم أنابيب مستديرة القاع لاستيعاب عرض المسبار المستخدم للتجانس.
        ملاحظة: يمكن تجميع أدمغة الفئران المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 سنوات.
      2. أضف 500 ميكرولتر من حاجز التحلل إلى دماغ واحد مستخرج من فأر بالغ. بالنسبة لبقية البروتوكول، يفترض أن يكون حجم المخزن المؤقت تحلل المضافة 10 مل. ضبط لتجربتك وفقا لعدد من العقول لاستخدامها.

3. تحلل الخلايا أو أنسجة الدماغ

  1. الخلايا المزروعة كثقافات تعليق
    1. ل HEK-293، lyse الخلايا على الجليد عن طريق الأنابيب بشكل متكرر صعودا وهبوطا باستخدام نصائح ماصة من عروض مختلفة. أولا، نعلق تلميح p1000 إلى ماصة 10 مل، وماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا كل 5 دقائق، لمدة 10 دقيقة (ثلاث دورات من pipetting). ثانيا، إرفاق تلميح P200 إلى طرف p1000 والمزيد من ماصة كل 5 دقائق، لمدة 20 دقيقة (خمس دورات من pipetting).
    2. للحصول على HeLa S3، ازل الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية (راجع جدول المواد للإعدادات).
    3. خذ 1/100وحدة تخزين من مزيج التحلل (L) (200 ميكرولتر ل 20 مل من L)، وأضف نفس الحجم من المخزن المؤقت 2x Laemmli، يغلي لمدة 5 دقائق، ويخزن عند -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  2. الخلايا المزروعة كثقافات معتنقة
    1. نقل الخلايا إلى أنبوب 14 مل ذهابا وإيابا الذي تم تخفيض ارتفاع لاستيعاب التحقيق sonicator (انظر جدول المواد للإعدادات). Sonicate الخلايا ل~ 45 نبضات، وتأكيد تحلل الخلية عن طريق أخذ عينات قطرة من مزيج تحلل تحت المجهر.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد البقول وفقا لنوع الخلية المستخدمة لتنقية التوبولين. سونيكاتينغ الخلايا أكثر من اللازم يمكن أن يسبب توبولين لتسريع وسوف تؤثر سلبا على غلة تنقية.
    2. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا على الجليد كل 5 دقائق لمدة 20 دقيقة (خمس دورات من pipetting)، وذلك باستخدام تلميح p200.
    3. خذ 1/100th حجم مزيج التحلل (L) (200 ميكرولتر ل20 مل من L) وإضافة نفس الحجم من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  3. أنسجة المخ
    1. Lyse أنسجة الدماغ باستخدام خلاط الأنسجة (انظر جدول المواد للإعدادات). بدلا من ذلك، lyse الأنسجة باستخدام الحشرات microtube أو ما يعادلها من المعدات وماصة صعودا وهبوطا على الجليد مع حقنة 1 مل مع إبرة 18G.
    2. خذ 1/100th حجم مزيج التحلل (L) (200 ميكرولتر ل20 مل من L)، وإضافة نفس الحجم من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

4. تنقية توبولين

  1. توضيح Lysate
    1. مسح التحلل (فصل بيليه وجزء قابل للذوبان من مزيج تحلل) عن طريق الطرد المركزي في 150،000 × غرام، 4 درجة مئوية ، 30 دقيقة. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الدوارات والأنابيب فائقة المركزية. بالنسبة لمستخلصات الخلايا، غالبا ما تتشكل طبقة عائمة بيضاء بعد الطرد المركزي. لا نقل هذه الطبقة العائمة جنبا إلى جنب مع supernatant، كما أنه يتداخل مع بلمرة التوبولين. استخدام حقنة من حجم المناسبة تعلق على إبرة طويلة 20 G أو 21 G لإزالة بلطف supernatant دون إزعاج الطبقة العائمة. إذا كان الفائق لا يزال غائما ، فإن جهاز الطرد المركزي عند 5000 × غرام، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. نقل supernatant (SN1) إلى أنبوب الطرد المركزي للغاية ونلاحظ حجمه. لبيليه الخلية 10 مل، نتوقع حجم ~ 12 مل لSN1.
    3. خذ 1/100وحدة تخزين SN1 (120 ميكرولتر ل 12 مل من SN1)، وأضف نفس الحجم من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
    4. Resuspend بيليه (P1) في BRB80(جدول المواد)باستخدام نفس حجم SN1. خذ 1/100th حجم P1 (200 ميكرولتر ل20 مل من P1)، وإضافة نفس الحجم من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  2. البلمرة الأولى في العازلة منخفضة المولاريتي
    1. إعداد مزيج البلمرة عن طريق الجمع بين 1 حجم SN1 (12 مل), 1/200حجم th من 0.2 M GTP (60 ميكرولتر; التركيز النهائي 1 mM), و 0.5 حجم الجلسرين قبل تسخينها (6 مل) في أنبوب المسمار كاب من حجم المناسبة.
      ملاحظة: يستخدم الجلسرين كعامل الازدحام في خطوات البلمرة في جميع أنحاء البروتوكول، وبالتالي لا يعتبر في حسابات تركيزات المكونات الأخرى.
    2. ماصة المزيج صعودا وهبوطا، وتجنب بلطف تشكيل فقاعات الهواء ونقله إلى أنابيب الطرد الفائق المناسبة.
      ملاحظة: أثناء نقل المزيج إلى الأنابيب، قم بضبط وزن الأنابيب (بالأزواج). وهذا يسمح للمجرب للمضي قدما مباشرة إلى ترسيب microtubules بعد خطوة البلمرة. القيام بذلك لجميع خطوات البلمرة في جميع أنحاء البروتوكول.
    3. تغطية الأنابيب مع parafilm، ونقل إلى حمام مائي تعيين في 30 درجة مئوية، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    4. طرد الأنابيب في 150،000 × غرام، 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة supernatant (SN2) ، والحفاظ على بيليه من microtubules البوليمرات (P2).
      ملاحظة: يمكن أن تكون مصغرة بيليه المفاجئة المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    5. خذ 1/200th حجم SN2 (90 ميكرولتر ل18 مل SN2) وإضافة نفس الحجم من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  3. أول إزالة للبوميرة
    1. Depolymerize microtubules بإضافة BRB80 الجليد الباردة إلى بيليه P2، وترك على الجليد لمدة 5 دقائق: لtupoulin من الخلايا، إضافة 1/60th (200 ميكرولتر)، وللتوبولين من العقول، إضافة 1/20th (600 ميكروغرام) من حجم SN1.
      ملاحظة: حجم BRB80 الجليد الباردة تضاف إلى بيليه خلال خطوات إزالة البلمرة هو دائما بالنسبة لحجم SN1.
    2. Resuspend بيليه microtubule بلطف، وتجنب فقاعات الهواء، حتى الحل هو متجانسة تماما. استخدام تلميح p1000 لبضع دورات من pipetting تليها تلميح P200 كل 5 دقائق، لمدة 20 دقيقة (خمس دورات من pipetting). هذه خطوة حاسمة لنجاح تنقية التوبولين.
    3. نقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي المناسبة، وتدور إلى أسفل في 150،000 × غرام،4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل SN3 إلى أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الفائق. بيليه تشكلت بعد هذه الخطوة الطرد المركزي (P3) يحتوي على البروتينات المعجلة (البروتينات المرتبطة microtubule أو MAPs) والميكروبات غير المعالجة. وsupernatant (SN3) يحتوي على مكونات قابلة للذوبان: ديبوليمرد الدرنات وMAPs, التي انفصلت عن microtubules depolymerized.
    4. خذ 1-4 ميكرولتر من SN3، وأضف 9 مجلدات من 2x Laemmli العازلة، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    5. Resuspend بيليه P3 في BRB80 (في نفس حجم SN3)، واتخاذ 1-4 ميكرولتر، وإضافة 9 وحدات تخزين من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. البلمرة الثانية (في العازلة عالية المولاريتي)
    1. إعداد مزيج البلمرة عن طريق الجمع بين 1 حجم SN3 (200 ميكرولتر)، 1 حجم أنابيب 1 M ساخنة مسبقا (200 ميكرولتر، التركيز النهائي 0.5 M), 1/100th حجم 0.2 M GTP (2 ميكرولتر, التركيز النهائي 1 mM), و 1 حجم من الجلسرين قبل تسخينها (200 ميكرولتر) في أنبوب من الحجم المناسب.
    2. ماصة المزيج صعودا وهبوطا، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء، ونقله إلى أنابيب الطرد المركزي للغاية.
    3. تغطية الأنابيب مع parafilm، ونقلها إلى حمام مائي تعيين في 30 درجة مئوية، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 150،000 × غرام، 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة supernatant (SN4) ، والحفاظ على بيليه من microtubules البوليمر (P4). بيليه P4 يحتوي على microtubules البوليمرات، وSN4 فائقة يحتوي على توبولين البكر، MAPs، وغيرها من البروتينات القابلة للذوبان.
      ملاحظة: يمكن أن تكون بيليه microtubule بعد الخطوة الثانية البلمرة المفاجئة المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    5. خذ 1-4 ميكرولتر وأضف 9 مجلدات من 2x Laemmli العازلة، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
  5. إزالة الطابع الثاني
    1. depolymerize microtubules عن طريق إضافة BRB80 الجليد الباردة إلى بيليه P4، وترك على الجليد لمدة 5 دقائق: لtupoulin من الخلايا، إضافة 1/100th (120 ميكرولتر)، وللتوبولين من العقول، إضافة 1/40th (300 ميكروغرام) من حجم SN1.
    2. ماصة صعودا وهبوطا مع تلميح p200 كل 5 دقائق، لمدة 20 دقيقة (خمس دورات من pipetting).
    3. نقل الحل إلى أنبوب 1.5 مل فائقة المركزية، وتدور أسفل في 150،000 × غرام،4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل SN5 إلى أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الفائق. بيليه تشكلت بعد هذه الخطوة الطرد المركزي (P5) يحتوي على microtubules غير مزيل للبوهر. وsupernatant (SN5) يحتوي على أنبوبي قابل للذوبان.
    4. خذ 1-4 ميكرولتر وأضف 9 مجلدات من 2x Laemmli العازلة، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    5. Resuspend بيليه P5 في BRB80 (نفس حجم SN5)، واتخاذ 1-4 ميكرولتر، وإضافة 9 مجلدات من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
  6. البلمرة الثالثة (في المخزن المؤقت منخفض المولاري)
    1. إعداد مزيج البلمرة: 1 حجم SN5 (120 ميكرولتر)، 1/200حجم 0.2 M GTP (0.6 ميكرولتر، التركيز النهائي هو 1 mM)، و 0.5 حجم الجلسرين قبل تسخينها (60 ميكرولتر) في أنبوب من الحجم المناسب.
    2. ماصة المزيج صعودا وهبوطا، وتجنب بلطف تشكيل فقاعات الهواء، ونقله إلى أنابيب الطرد الفائق المناسبة.
    3. تغطية الأنابيب مع parafilm، ونقلها إلى حمام مائي تعيين في 30 درجة مئوية، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 150،000 × غرام، 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بيليه (P6) يحتوي على microtubules البوليمرات وSN6 فائقة يحتوي على كميات صغيرة من التوبولين غير البوليمرية.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الكريات Microtubule المفاجئة المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    5. خذ 1-4 ميكرولتر وأضف 9 مجلدات من 2x Laemmli العازلة، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
  7. إزالة الطابع الثالث
    1. depolymerize microtubules عن طريق إضافة BRB80 الجليد الباردة إلى بيليه P6، وترك على الجليد لمدة 5 دقائق: لtupoulin من الخلايا، إضافة 1/100th (120 ميكرولتر)، وبالنسبة للتوبولين من العقول، إضافة 1/40th (300 μL) من حجم SN1.
    2. ماصة صعودا وهبوطا مع تلميح p200 كل 5 دقائق، لمدة 20 دقيقة (خمس دورات من pipetting).
    3. نقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي فائقة المناسبة، وتدور أسفل في 150،000 × غرام،4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل SN7 إلى أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الفائق. بيليه (P7) يحتوي على كميات صغيرة من microtubules غير depolymerized. وsupernatant (SN7) يحتوي على microtubules depolymerized حصرا (أنبوبي قابل للذوبان).
    4. خذ 1-4 ميكرولتر وأضف 9 مجلدات من 2x Laemmli العازلة، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    5. Resuspend بيليه P7 في BRB80 (نفس حجم SN7)، واتخاذ 1-4 ميكرولتر، وإضافة 9 مجلدات من العازلة Laemmli 2x، يغلي لمدة 5 دقائق، وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    6. تحديد كمية التوبولين (انظر النتائج التمثيلية)وaliquot SN7 في أحجام صغيرة، المفاجئة تجميد، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو إنتاج عالية الجودة، والتوبيولين الجمعية المختصة بكميات كافية لإجراء التجارب المتكررة في المختبر مع المكونات المنقى. ويمكن استخدام Microtubules تجميعها من هذا tubulin في إعادة تشكيل المقايسات على أساس الانعكاس الداخلي الكلي fluorescence (TIRF) تقنية المجهر مع microtubules إما ديناميكية أو مستقرة، في تجارب اختبار ديناميات microtubule، والتفاعلات مع MAPs أو المحركات الجزيئية، وتوليد القوة من قبل المحركات25. ويمكن أيضا أن تستخدم في microtubule-MAP شارك بيليه المقايسات و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة الموصوفة هنا يوفر منصة لتوليد بسرعة عالية الجودة، والتوبيولين التجميع المختصة بكميات متوسطة كبيرة من خطوط الخلية وأدمغة الماوس واحد. وهو يقوم على بروتوكول الذهب القياسية لتنقية التوبولين من العقول البقرية المستخدمة في هذا المجال لسنوات عديدة16،17. وتتمثل إحدى المزايا الخاصة لهذا النهج في استخدام ثقافات التعليق لخلايا HeLa S3، التي تنتج، بمجرد إنشائها، كميات كبيرة من الخلايا بينما تتطلب القليل من التدريب العملي في الوقت المحدد. وهذا يجعل البروتوكول من السه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل ANR-10-IDEX-0001-02، وLabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 ومعهد التقارب Q-life ANR-17-CONV-0005. ويدعم CJ من قبل معهد كوري، تمنح الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث ANR-12-BSV2-0007 و ANR-17-CE13-0021، ومنحة المعهد الوطني للسرطان (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1، ومنحة مؤسسة من أجل لا ريشرش الطبية (FRM) DEQ20170336756. يتم دعم MMM من قبل منحة الزهايمر Fondation Vaincre FR-16055p ، ومنحة الزهايمر الفرنسية AAP SM 2019 n°2023. وقد تم دعم JAS من قبل الاتحاد الأوروبي أفق 2020 برنامج البحث والابتكار في إطار اتفاق منحة ماري Skłodowska-كوري رقم 675737، ومنحة FRM FDT201904008210. تم دعم SB من قبل منحة FRM FDT201805005465.

نشكر جميع أعضاء مختبر جانكي، ولا سيما ج. شورون، وكذلك ج. لاكيسيتش (معهد MICALIS، AgroParisTech) وأ. غوتريو (المدرسة البوليتكونيكية) على المساعدة أثناء وضع البروتوكول. نود أن نشكر منشأة الحيوانات في معهد كوري للمساعدة في تربية الفئران والرعاية.

تم الحصول على الأجسام المضادة 12G10، التي وضعها ج. فرانكل و M. نيلسون، من بنك الدراسات التنموية الهجينة وضعت تحت رعاية NICHD وصيانتها من قبل جامعة أيوا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1  م MgCl2 سيجما#M1028
أوعية زراعة الخلايا 1-LTechne F7610 & nbsp ؛تستخدم لثقافات الدوار. لا تقلب الزجاجات الدوارة الفارغة أبدا. عندما تكون الزجاجات الدوارة في حاضنة زراعة الخلايا ، احتفظ دائما بالصمامات الجانبية للزجاجات الدوارة مفتوحة قليلا لتسهيل توازن الوسائط مع الحاضنة s الغلاف الجوي. بعد الاستخدام ، املأ الزجاجات الدوارة على الفور بماء الصنبور لتجنب جفاف الخلايا المتبقية على جدران الزجاجة. اغسل الزجاجات بالماء منزوع الأيونات ، وأضف 200 مل من الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. تحت غطاء مزرعة الخلايا المعقم ، قم بإزالة الماء واترك الزجاجات تجف تماما ، ولا تزال تحت الغطاء ، لعدة ساعات. لا تستخدم المنظفات أبدا لتنظيف الزجاجات الدوارة لأن أي كميات ضئيلة من المنظفات يمكن أن تكون ضارة بالخلايا.
أنابيب 1.5 و 2 مل أنابيب
مستديرة القاع 14 مل أطباق
ثقافة معقمة قطرها
15 سم أنابيب غطاء
2-mercaptoethanol   ؛سيجما #M31482-mercaptoethanol سام ويجب استخدامه تحت الغطاء.
4- (2-أمينوإيثيل) -فلوريد البنزين سلفونيل   ؛سيجما #A8456
40٪ أكريلاميد   ؛Bio-Rad # 161-0140
5- ، 10- 20 مل محاقن
5 مل ، 10 مل ، 25 مل ماصات
50 مل أنابيب غطاء لولبي بغطاء
أمونيوم بيرسلفات (APS)سيجما#A3678
جسم مضاد مضاد لألفا توبولين ، 12G10 & nbsp ؛تم تطويره بواسطة J. Frankel و M. Nelson ، تم الحصول عليه من بنك الدراسات التنموية Hybridoma ، الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD ، وتحتفظ به تخفيف جامعة أيوا: 1/500
جسم مضاد للتوبولين مضاد للجلوتاميل ، GT335   ؛AdipoGen #AG-20B-0020التخفيف: 1 / 20،000
أبروتينين   ؛سيجما #A1153
التوازن (0.1 &ndash ؛ 10 جم) زجاجات
بيكمان 1 لتر من البولي بروبيلين   ؛لجمع ثقافات الدوار Beckman
Avanti J-26 XP جهازمركزي لجمع ثقافات الدوار
النمام البيولوجي  Techne MCS-104L مثبتة في حاضنة زراعة الخلايا (للثقافات الدوارة) ، 25 دورة في الدقيقة لخلايا Hela S3 و HEK 293
مكرر N ، N'-Methylene-Bis-Acrylamide   ؛Bio-Rad # 161-0201
خلاط IKA Ultra-Turrax & reg ؛  لتحلل أنسجة المخ ، استخدم مسبارا 5 مم ، مع ضبط الجهاز على قوة 6 أو 7. امزج أنسجة المخ 2-3 مرات لمدة 15 ثانية على الثلج.
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma #A7906
بروموفينول أزرق   ؛سيجما # 1.08122
كربوكسي ببتيداز أ (CPA)سيجما#C9268التركيز: 1.7   ؛ U/µ ل
ثقافة الخلية
مجموعة حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة ؛ ج ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ثنائي
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)  ؛ سيجما يمكن #D8418DMSO أن يعزز نفاذية الخلايا والجلد للمركبات الأخرى. تجنب ملامسة البشرة واستخدام واقي الجلد والعين.
DMEM medium لايف تكنولوجيز #41965062
DTT ، DL-Dithiothreitol  سيجما #D9779
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma #E3889
الإيثانول المطلق  فيشر للكيماويات #E/0650DF/15
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Sigma #F7524
ضغط خلية الضغط الفرنسية  شركة الإلكترون الحراري #FA-078Aمع خلية #FA-032؛ لتحلل كميات كبيرة من الخلايا. يتم ضبطه على نسبة متوسطة ، وضغط المقياس 1,000 رطل لكل بوصة مربعة (يتوافق مع 3,000 رطل لكل بوصة مربعة داخل غرفة التعطيل).
الجلسرين  VWR للكيماويات #24388.295
جلايسينسيجما#G8898
GTP سيجما #G8877
كتلة التدفئة ستيوارت #SBH130D
خلايا هيلا ATCC® CCL-2 والتجارة;
خلايا Hela S3 ATCCATCC & reg; CCL-2.2 & التجارة ؛
حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ) VWR# 20252.290
المجهر المقلوب   ؛مع التألق إذا كان تعداء الخلية يجب التحقق
من Isopropanol VWR #20842.298
jetPEIPolyplus # 101
JLA-8.1000 الدوار  لجمع ثقافات الدوار
KOH & nbsp ؛سيجما #P1767KOH مادة أكالة وتسبب حروقا ؛ استخدم حماية العين والجلد.
L-الجلوتامين لايف تكنولوجيز # 25030123
جهاز طرد مركزي مختبري لأنابيب 50 ملSigma4-16 K & nbsp ؛
Leupeptin سيجما#L2884
النيتروجين السائل  
الماصات الدقيقة p2.5 و p10 و p20 و p100 و p200 و p1000 والنصائح
MicropestlesEppendorf# 0030 120.973
أنسجة دماغ الفئران   ؛تم إجراء رعاية واستخدامها في هذه الدراسة وفقا لتوصيات الجماعة الأوروبية (2010/63 / UE). تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية على وجه التحديد من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد كوري CEEA-IC # 118 (التفويض رقم 04395.03 الممنوح من قبل السلطة الوطنية) امتثالا للمبادئ التوجيهية الدولية.
الإبر 18 جم × 1 ½ ؛ ” (1.2 × 38 ممTerumo#18G
إبر 20G X 1 ½ ؛ ” (0.9 × 38 ممTerumo#20G
الإبر 21G X 4 ¾ ؛ ” (0.8 × 120 ممB.Braun# 466 5643
Parafilm
PBS & nbsp ؛لايف تكنولوجيز #14190169
البنسلين الستربتومايسين لايف تكنولوجيز # 15140130
الأس الهيدروجيني
فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF)سيجما   ؛#P7626مسحوق PMSF خطير. استخدم حماية البشرة والعين عند تحضير محاليل PMSF.
الماصي سيجما #P6757
دوارات ماصة بوي
بيكمان 70.1 Ti ؛ TLA-100.3; و TLA 55
SDS-PAGE معدات الرحلان الكهربائي   ؛Bio-Rad #1658001FC
SDS ، كبريتات دوديسيل الصوديوم   ؛VWR #442444Hلتحضير Laemmeli buffer 
SDS, كبريتات دوديسيل الصوديوم سيجما #L5750لإعداد المواد الهلامية "TUB" SDS-PAGE
Sonicator برانسون# 101-148-070يستخدم لتحلل الخلايا المزروعة كثقافات ملتصقة. استخدم مسبارا قطره 6.5 مم ، اضبط الصوتنة على " التحكم في الإخراج" 1، " دورة العمل" 10٪ والوقت حسب نوع الخلية المستخدمة.
أجهزة الطرد المركزي المنضدية لأنابيب 1.5 ملEppendorf5417R & nbsp ؛
TEMED, N, N, N′, N″-Tetramethylethylenediamine سيجما# 9281
Trichostatin A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100   ؛سيجما #T9284
قاعدة Trizma (Tris)Sigma #T1503
Trypsin Life Technologies#15090046
دوارات الطرد المركزي الفائقة دوارات TLA-55 و TLA-100.3 و 70.1 Tiعند 4 درجة ؛ ج أو 30 درجة ؛ C بناء على حاجة التجربة 
أنابيب الطرد المركزي الفائقة بيكمان# 357448 للاستخدام مع دوار TLA-55
أنابيب الطرد المركزي الفائقة Beckman#349622الفائق الدوار TLA-100.3
 بيكمان#355631 للاستخدام مع دوار 70.1 Ti
أجهزة الطرد المركزي الفائقةBeckmanOptima L80-XP (أو ما يعادلها) و Optima MAX-XP (أو ما يعادلها)عند 4 درجة ؛ ج أو 30 درجة ؛ C بناء على حاجة التجربة 
دوامة
حمام مائي مجهز بعوامات أو حاملاتعند 30 درجة ؛ ج 
لولبي 15 ملمعقمة طرد غطاء المقابلةمقياس مجموعة للاستخدام مع أنابيب الطرد المركزي خلاط أنبوب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18(2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705(2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS

مقالات ذات صلة