يصف هذا البروتوكول نظام ثقافة الطباعة المغناطيسية ثلاثي الأبعاد (3D) الذي يسمح بتشريح الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) الناجمة عن وسط مكيف من الخلايا السرطانية. يسمح استخدام نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد للخلايا الشحمية UCP1 + التي تعبر عن بروتين فلوري أخضر (GFP) بدراسة الخلايا الشحمية البيج التي تساهم في إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثقافة الخلايا الشحمية ثلاثية الأبعاد كنموذج لدراسة إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء الناجمة عن الدنف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يقدم دنف السرطان (CC) نفسه على أنه متلازمة ذات مظاهر متعددة ، مما يتسبب في اختلال التوازن الأيضي الملحوظ متعدد الأعضاء. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تحفيز الهزال الشبكي بواسطة العديد من الوسطاء الالتهابيين ، مما قد يعطل علم وظائف الأعضاء التكاملي للأنسجة الدهنية والأنسجة الأخرى مثل الدماغ والعضلات. في هذا السيناريو ، يمكن للورم البقاء على قيد الحياة على حساب المضيف. في الأبحاث السريرية الحديثة ، ارتبطت شدة استنفاد رواسب الدهون المختلفة سلبا بنتيجة بقاء المريض. أظهرت الدراسات أيضا أن اضطرابات التمثيل الغذائي المختلفة يمكن أن تغير إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) ، خاصة في المراحل المبكرة من تطور الدنف. يعد الخلل الوظيفي في WAT الناتج عن إعادة تشكيل الأنسجة مساهما في دنف الكلي ، حيث تتكون التعديلات الرئيسية في WAT من التغيرات الوظيفية المورفولوجية ، وزيادة تحلل الدهون في الخلايا الشحمية ، وتراكم الخلايا المناعية ، وتقليل تكوين الشحم ، والتغيرات في عدد الخلايا السلفية ، وزيادة "المنافذ" التي تحتوي على خلايا البيج / برايت.
لدراسة الجوانب المختلفة لإعادة تشكيل WAT الناجم عن دنف ، لا سيما التغييرات في الخلايا السلفية وإعادة تشكيل البيج ، كانت الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) هي الخيار الأول للدراسات في المختبر. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يلخص بشكل كاف تعقيد واتضاع واتسا. تساعد المقايسات المحسنة لإعادة بناء AT ex vivo الوظيفية على فهم التفاعلات الفسيولوجية بين مجموعات الخلايا المتميزة. يصف هذا البروتوكول نظاما فعالا ثلاثي الأبعاد لزراعة أنسجة الطباعة (3D) يعتمد على الجسيمات النانوية المغناطيسية. تم تحسين البروتوكول للتحقيق في إعادة تشكيل WAT الناجمة عن العوامل الناجمة عن الدنف (CIFs). تظهر النتائج أن الثقافة ثلاثية الأبعاد هي أداة مناسبة لدراسة نمذجة WAT خارج الجسم الحي وقد تكون مفيدة للشاشات الوظيفية لتحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا لتطبيقات مجموعات الخلايا الدهنية الفردية والمساعدة في اكتشاف العلاج المضاد للدفق الخلوي القائم على WAT.
المقدمة
تتكون الكائنات الحية من خلايا في بيئات مكروية ثلاثية الأبعاد مع تفاعل خلية خلية ومصفوفة خلية وديناميكيات نقل متقنة للمغذيات والخلايا1،2. ومع ذلك ، فقد تم إنشاء معظم المعرفة الأساسية المكتسبة في بيولوجيا الخلية باستخدام زراعة الخلايا أحادية الطبقة (2D). على الرغم من أن الثقافة ثنائية الأبعاد يمكن أن تجيب على بعض الأسئلة الميكانيكية ، إلا أن هذا النهج يلخص بشكل غير كاف البيئة الطبيعية التي توجد فيها الخلايا وقد يكون غير متوافق مع التنبؤ باستجابة دوائية معقدة1. علاوة على ذلك ، تشعر الخلايا بمحيطها المادي من خلال النقل الميكانيكي. في الواقع ، تترجم القوى ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. حضانة الخلايا ثنائية الأبعاد مع الجسيمات النانوية المغناطيسية
- تنمو الثقافات ثنائية الأبعاد الملتصقة إلى ~ 70٪ التقاء باستخدام إجراءات زراعة الخلايا القياسية.
- تحضير مجموعة الجسيمات النانوية المغناطيسية. أخرجيها من الثلاجة واتركيها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة1.
- الوسط المختلط: أضف الجسيمات النانوية المغناطيسية مباشرة إلى 12 مل من الوسط في ألواح زراعة الخلايا مقاس 100 مم. قم بتعليق الوسط وإعادة تعليقه عدة مرات للحصول على توزيع متجانس للجسيمات النانوية.
ملاحظة: سيظهر الوسط داكنا بسبب اللون البني لأكسيد الحديد. يوصى بتركيز 2.5 ميكرولتر / سم2<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الأديبوسفيرويد من ثقافة ثلاثية الأبعاد لخلايا الكسر الوعائي اللحمي (SVF)
تم إعداد كل من الثقافات ثلاثية الأبعاد و 2D المتجمعة بنفس الأعداد من خلايا SVF من نفس مستحضر WAT الإربي للفأر (الشكل 1 أ ، الشكل 1 ب) وإخضاعها لنفس البروتوكول التجريبي لمقارنة علامة التعبير الجيني. تم تحفيز الكرات بوسط الحث الذي تم توسيعه بمرور الوقت. يوضح الشكل 2 ب زيادة في كثافة الخلايا متعددة الأبعاد ثنائي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يضع هذا البروتوكول نظاما ثلاثي الأبعاد لزراعة الخلايا الشحمية لدراسة تمايز الخلايا الشحمية في الأديبوسفيرويد المشتقة من خلايا SVF الأولية من WAT. بالمقارنة مع ثقافة التمسك 2D التقليدية ، يسهل هذا النظام ثلاثي الأبعاد إعادة عرض AT ، والذي يشبه إلى حد كبير ظروف الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية ، أظهرت الدراسات أن زراعة الخلايا في 3D ينتج مورفولوجيا خلوية وإشارات مميزة مقارنة بنظام الثقافة ثنائي الأبعاد3. يختلف مورفولوجيا الخلايا الليفية في 3D عن تلك الموجودة ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة DK117161 ، DK117163 إلى SRF ، و P30-DK-046200 لبيولوجيا الدهون والتمثيل الغذائي للمغذيات الأساسية لمركز أبحاث التغذية والسمنة في بوسطن ، ومن قبل منح مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP): 2018/20905-1 و CNPq 311319 / 2018-1 إلى MLBJr.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | I-5879 | لثقافة الخلايا |
| 96-Well ، Greiner الأسود | (مونرو ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 655841 | زراعة الخلايا |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F (ab') 2< / sub> جزء حمار مضاد للأرانب IgG (H + L) Jackson | ImmunoResearch | 711-606-152 | تلطيخ التألق المناعي ، ثانوي ، 1: 400 في TBS مع 0.1٪ Tween-20 |
| CELL CULTURE MICROPLATE ، 96 بئر ، PS ، F-BOTTOM ، & micro ؛ شفاف ، أسود ، سيليستار ، سطح طارد للخلايا ، غطاء ، معقم ، 8 قطع / كيس | غرينر (مونرو ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 655976 | زراعة الخلايا |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | D-1756 | ثقافة الخلايا |
| DMEM | Corning (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 10-017-CV | ثقافة الخلايا |
| مصل الأبقار الجنينية (توفا) | الجوزاء الحيوي (غرب ساكرامنتو ، كاليفورنيا) | 100-500 | ثقافة الخلايا |
| إندوميتاسين | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | I-7378 | زراعة الخلايا |
| الأنسولين | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | I0516 | زراعة الخلايا |
| LL / 2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) مجموعة | الثقافة من النوع الأمريكي (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | CRL-1642 | خط خلايا سرطان الرئة لويس |
| NanoShuttle-PL | Greiner (مونرو ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 657843 | زراعة الخلايا |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | ThermoFisher (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) | R37606 | تلطيخ التألق المناعي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة |
| Strep | Corning (Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 30-002-CI | ثقافة الخلايا |
| Perilipin-1 (D1D8) XP & nbsp ؛ | تقنية إشارات خلايا الأرانب mAb (دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 9349 | تلطيخ التألق المناعي ، أساسي ، 1: 1000 في TBS مع 0.1٪ Tween-20 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | R-2408 | زراعة الخلايا |
| Trypsin-EDTA ، 0.05٪ | Corning (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 25-052-CI | ثقافة الخلايا |
| <قوي > نسخ عكسي PCR الاشعال < / قوي > | |||
| < قوي > التمهيدي < / قوي > | < قوي > إلى الأمام < / قوي > | < قوي > عكسي < / قوي >< | |
| م > Adipoq < / em > | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| em > Col4a1 < / em > | TCCAAGGGCGAAGTGGTT | ACCCTTGCTCGCCTTTGACT | |
| em>Cyclophilin a< / em> | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4< / em> | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGATG | TCCAGGCCTCTTCCTGGCTCA | |
| em>Fn1< / em> | GCTTCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGGGT | |
| Pgc1a< / em> | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGAAGAGATAAAG | |
| em>Ucp1< / em> | TCCTAGGGACCATCACCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC | |
| strong>Mouse Genoping | |||
| Primer name | Description | Sequence | |
| Cre F | Generic Cre إلى الأمام | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | Generic Cre عكس | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT / mG إلى الأمام | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT / mG النوع البري العكسي | CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT / mG عكس | TCA ATG GGC GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 متحولة إلى الأمام | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC | |
| UCP1 عكس متحولة | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | ||
| WH338 | UCP1 نوع البري إلى الأمام | GGT CAG CCT AAT TAG CTC | |
| WH339 | UCP1 النوع البري عكس | GAT CTC CAC CTC CTC TGT C |
المراجع
- Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Na....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
