يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.
سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.
المقدمة
و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال الحياة1. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.
وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم استعراض جميع الإجراءات المدرجة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية التي تنظم الطب التجريبي في جامعة كوبنهاغن وتتفق مع التشريعات الدنماركية والأوروبية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فئران BALB / cJ الأنثوية من عمر 8-12 أسبوعا وفأرة أنثى MMTV-PyMT تبلغ من العمر 11 أسبوعا.
ملاحظة: تجنب التلوث البكتيري سقالة ECM decellularized يعطي أفضل نتيجة التصوير ويسمح تخزين عينة على المدى الطويل. ولذلك فمن المهم للحفاظ على جميع الخطوات عقيمة. على هذا النحو، يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية، بما في ذلك خياطة، خياطة صغيرة، والحلول، والأنابيب، موصلات لوير والقسطرة، عقيمة. يجب تطهير الأسطح ، بما في ذلك صينية البوليسترين ، بالإيثانول ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الديسيلولارات القلبية الرئوية
بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين، فضلا عن الأنسجة الملحقة مثل القوس الأبهري، وسوف تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة Decellularization عن طريق تلطيخ hematoxylin-eosin (الشكل 1) من سقالات ECM التي تظهر إزالة النواة مقارنة بالأنسجة الأصلية. تحتفظ هذه السقالات بأبعاد الأعضاء الطازجة وهيكل ECM غير القابل للذوبان سليم2. يظهر الشكل 2 تمثيل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء الجهاز. استخدام المنظفات zwitterionic، أنيوني وغير أيونية لdeellularize الأنسجة هو المبلغ عنها4،5،6، ومع ذلك، الصوديوم دودسيل كبريتا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
نشكر البروفيسور إيفانا نوفاك والدكتورة نين مين كريستنسن (مركز التصوير الحيوي المتقدم (CAB)، جامعة كوبنهاغن) على توفير الوصول إلى المجهر. وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN؛ AEM-G، OW، RR و JTE)؛ منحة دكتوراه من مؤسسة لوندبيك (R286-2018-621؛ MR)؛ مجلس البحوث السويدي (2017-03389؛ آلية التنمية النظيفة)؛ الجمعية السويدية للسرطان، Cancerfonden (CAN 2016/783، 19 0632 Pj، 190007؛ آلية التنمية النظيفة)؛ المعونة الألمانية لمكافحة السرطان (دويتشه كريبشيلفي؛ RR)؛ وجمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454; RR).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خياطة <قوية > جراحة مجهرية < / قوية > | |||
| 6-0 ، إبرة مقطع مثلثة (فيكريل) | إيثيكون | 6301124 | |
| 9-0 خياطة دقيقة (سافيل) | بي براون | G1048611 | |
| ملقط أدسون | أدوات العلوم الدقيقة | 11006-12 | |
| ملقط أدسون بالأسنان | أدوات العلوم الدقيقة | 11027-12 | |
| حامل الإبرة الدقيقة Castroviejo | أدوات العلوم الدقيقة | رقم 12061-01 | |
| CO2 غرفة تهوية للقتل الرحيم للفأر | |||
| الماء منزوع الأيونات (Milli-Q IQ 7000 ، نظام مياه المختبر فائق النقاء) | علبة البوليسترين القابل للتصرف Merck | ZIQ7000T0 | |
| (~ 30 مرات ؛ 50 سم) | |||
| مجهر التشريح (Greenough ، مع ذراعين معقوفين) | Leica | S6 D | |
| ملعقة صغيرة مزدوجة النهايات | أدوات العلوم الدقيقة | 10091-12 | |
| ملقط دومون (اثنان) | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-20 | |
| ملقط دومون الدقيق مع 45 درجة ؛ نصائح (اثنان) | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-35 | |
| ماكينة قص الشعر | Oster | 76998-320-051 | |
| حامل إبرة Halsey (مع فكوك كربيد التنجستن) | أدوات العلوم الدقيقة | 12500-12 | |
| قسطرة قياس 24 في الوريد (Insyte) | BD | 381512 | |
| قسطرة قياس 26 في الوريد (Terumo) | Surflo-W | SR +DM2619WX | |
| مقص مايو (قطع قوي ، مستقيم) | أدوات العلوم الدقيقة | 14110-15 | |
| ملقط دقيق بأطراف حلقية (اثنان) | مقص زنبركي صغير Aesculap | FM571R | |
| (Vannas ، منحني) | أدوات العلوم الدقيقة | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| الإبر (مقياس 27 ؛ Microlance) | د.ب | 21018 | |
| منشفة ورقية (معقمة) أو منديل جراحي | |||
| مقص مسنن (CeramaCut ، مستقيم) | أدوات العلوم الدقيقة | 14958-09 | |
| ملعقة (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| (1 مل ؛ Plastipak) | BD | 3021001 | |
| المحاقن (10 مل ؛ Plastipak) | BD | 3021110 | |
| مقص الوتر (والتون) | أدوات العلوم الدقيقة | 14077-09 | |
| <قوي> IMMUNOSTAINING< / strong> | |||
| Alexa Fluor 488 حمار مضاد لخنزير غينيا IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 حمار مضاد للأرانب IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA (جزء الألبومين البقري V ، الصف القياسي ، المجفف بالتجميد ) ؛ | Serva | 11930.03 | |
| الكولاجين IV الأجسام المضادة متعددة النسيلة (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | المضيف: أرنب |
| PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 10 مرات ؛ Gibco) ؛ | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: الماعز |
| بيريوستين الجسم المضاد متعدد النسيلة (هدية لطيفة من مانويل كوخ. RRID: AB2801621) | المضيف: خنزير غينيا | ||
| مشرط يمكن التخلص منه بشفرة رقم 11 (قطعة. 10) | VWR | 233-5364) مصل | |
| (مصل حمار عادي) ؛ | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| أجهزة الكشف (كاشف هجين (Leica ، نموذج HyD S) وأنابيب المضاعف الضوئي (PMTs) | Leica | ||
| مصدر ضوء الفلورة | لايكا | EL6000 | |
| المجهر (المجهر متعدد الفوتون المقلوب) | Leica | SP5-X MP | |
| الهدف (لامدا الأزرق ، 20 مرة؛ ، 0.70 فتحة عددية (NA) IMM Uف) ؛ | Leica | HCX PL APO | |
| ثنائي الفوتون Ti & ndash ؛ ليزر الياقوت (فيزياء الأطياف ، نموذج ماي تاي ديب سي) | |||
| ليزر الضوء الأبيض (WLL) | Leica | ||
| <قوي>إزالة الخلايا < / قوي > | |||
| 70٪ إيثانول (الكحول المطلق 99.9٪) ؛ يجب تعديل الكحول المطلق إلى 70٪ (حجم / حجم) باستخدام الماء منزوع الأيونات ؛ | البرقوق | 1680766 | |
| منزوع الأيونات (Milli-Q IQ 7000 ، نظام مياه المختبر عالي النقاء) | تجهيزات الذكور | Merck ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing (1/8 بوصة) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (درجة الحموضة 7.4 ، 10 مرات ؛ Gibco) ؛ | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| البنسلين والستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | |
| مضخة التمعج (مع 12 قناة) أنابيب | Ole Dich | 110AC (R) 20G75 | |
| (مع معرف 2 مم و 4 مم OD) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| deoxycholate الصوديوم (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما ألدريتش | L3771-500G | |
| H& E STAINING< / قوي > | |||
| 4٪ PFA | فيشر Scientific | 15434389 | |
| 96٪ إيثانول | برقوق | 201446-5L | |
| الإيثانول المطلق | البرقوق | 201152-1L | |
| أغطية (24 × 50 مم ؛ 1000 قطعة) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds متوسط (15 × 15 × 5 مم ؛ 100 قطعة) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX تصاعد متوسط | Hounisen | 1001.0025 | |
| محلول Eosin Y كحولي 0.5٪ | Sigma | 1024390500 | |
| شفرة ريشة ميكروتوم من الفولاذ المقاوم للصدأ ، C35 (50 قطعة) | Pfm الطبية | 207500003 | |
شرائح Fisherbrand Superfrost Plus (25 × 75 مم ؛ 144 قطعة) | Thermofisher | 6319483 | |
| مايرز هيماتوكسيلين | سيجما | MHS32-1L | |
| OCT مركب | VWR | 361603E | |
| ماسح ضوئي للشرائح (نانوزومر) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
المراجع
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extrace....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
