مقالة منهجية

تقييم إعادة برمجة القلب باستخدام تحليل التصوير عالي المحتوى

DOI:

10.3791/61859

⸱

أكتوبر 26, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لتحديد الخلايا الشبيهة بخلايا عضلة القلب المستحثة المعاد برمجتها مباشرة (iCMs) في المختبر باستخدام تحليل تصوير عالي المحتوى. تسمح لنا هذه الطريقة بتحديد كفاءة إعادة برمجة القلب بطريقة آلية وتصور iCMs مباشرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس الخلايا الشبيهة بخلايا عضلة القلب المستحثة (iCMs) ، والتي يتم إعادة برمجتها مباشرة في المختبر بواسطة تقنية إعادة البرمجة. توفر إعادة برمجة القلب استراتيجية لتوليد خلايا عضلة القلب الجديدة. عن طريق إدخال عوامل النسخ القلبية الأساسية في الخلايا الليفية. يمكن تحويل الخلايا الليفية إلى iCMs دون الانتقال عبر حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. ومع ذلك ، لا يزال معدل تحويل الخلايا الليفية إلى iCMs منخفضا. وفقا لذلك ، كانت هناك العديد من الأساليب الإضافية لتعزيز كفاءة إعادة برمجة القلب. قامت معظم هذه الدراسات بتقييم كفاءة إعادة برمجة القلب باستخدام قياس التدفق الخلوي ، بينما أجرت في نفس الوقت كيمياء الخلايا المناعية لتصور iCMs. وبالتالي ، يلزم وجود مجموعتين منفصلتين على الأقل من تجارب إعادة البرمجة لإثبات نجاح إعادة برمجة iCM. في المقابل ، سيوفر تحليل التصوير الآلي عالي المحتوى كلا من القياس الكمي والتأهيل لإعادة برمجة iCM مع عدد صغير نسبيا من الخلايا. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن تقييم كمية ونوعية iCMs بشكل مباشر من خلال تجربة إعادة برمجة واحدة. سيكون هذا النهج قادرا على تسهيل دراسات إعادة برمجة القلب المستقبلية التي تتطلب تجارب إعادة برمجة واسعة النطاق مثل فحص العوامل الوراثية أو الدوائية لتعزيز كفاءة إعادة البرمجة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يقتصر تطبيق بروتوكول تحليل التصوير عالي المحتوى على إعادة برمجة القلب. يمكن تطبيقه على إعادة برمجة سلالات الخلايا الأخرى بالإضافة إلى أي تجارب تلطيخ مناعي تحتاج إلى القياس الكمي والتصور للخلايا الملطخة بالمناعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير إعادة برمجة القلب كنهج بديل للنهج بوساطة الخلايا الجذعية لتوليد خلايا عضلة القلب الجديدة. بالنظر إلى أنه لا ينتقل عبر حالة الخلايا الجذعية ، فإنه يتمتع بقدرة عالية على تجاوز بعض القيود الموروثة في الأساليب بوساطة الخلايا الجذعية. لقد ثبت أن العدوى الفيروسية لما لا يقل عن ثلاثة أو أربعة عوامل نسخ قلبية إلى الخلايا الليفية يمكن أن تحول الخلايا الليفية نحو مصير قلبي عن طريق القضاء على برامج الجينات الليفية وإعادة بناء شبكات النسخ القلبية في الخلايا الليفية1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 ، 11،12،13،14،15،16،17.

منذ أول دراسة تاريخية توضح إعادة برمجة القلب في المختبر1 ، تم تحسين بروتوكول إعادة برمجة القلب من خلال العديد من الدراسات3،5،6،7،9،11،12،13،14،15،16،18. كانت الأساليب التقنية الشائعة لتقييم الأنماط الظاهرية للقلب في الخلايا الليفية بعد إعادة برمجة القلب هي تحليل قياس التدفق الخلوي لقياس الخلايا التي تعبر عن علامات عضلة القلب المحددة والكيمياء الخلوية المناعية لتصور تلك الخلايا على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أن كلتا التجربتين (أي قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية) لإثبات التعبير عن علامات خلايا عضلة القلب باستخدام نفس الأجسام المضادة ، إلا أنه يجب إجراؤها بشكل منفصل. بالإضافة إلى ذلك ، يحتاج قياس التدفق الخلوي إلى عدد أكبر نسبيا من الخلايا ، وبالتالي زيادة كمية الكواشف اللازمة للتجربة. بدلا من ذلك ، يمكن قياس الخلايا الإيجابية لعلامات عضلة القلب عن طريق العد اليدوي بعد كيمياء الخلايا المناعية. ومع ذلك ، فهي كثيفة العمالة وتميل إلى أن تكون أقل دقة.

الغرض من هذا البروتوكول هو وصف الطريقة التي يمكنها تحديد وتصور iCMs من خلال تجربة تلطيخ مناعي واحدة باستخدام تحليل التصوير الآلي عالي المحتوى. يتطلب عددا صغيرا نسبيا من خلايا البداية لأن هذا البروتوكول يتم تنفيذه في بئر من 24 بئرا. يمكن استخدام ما يصل إلى ثلاث علامات مختلفة في نفس الوقت. يمكن تحديد الخلايا الموجبة المفردة والمزدوجة والثلاثية تلقائيا. بالإضافة إلى القياس الكمي للخلايا الملطخة بالمناعة ، يوفر تحليل التصوير عالي المحتوى صورا موضوعية عالية الجودة 2-100x. إذا لزم الأمر ، يمكن إعادة استخدام نفس الخلايا الملطخة بالمناعة المستخدمة في تحليل التصوير عالي المحتوى لمزيد من دراسات التصوير ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يوفر فقط القياس الكمي غير المتحيز ل iCMs بعدد أقل بكثير من الخلايا ، ولكن أيضا تصور iCMs. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم إعادة برمجة النسب غير القلبية (على سبيل المثال ، iPSC ، والخلايا العصبية ، وإعادة برمجة خلايا الكبد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بالمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. توليد الفيروسات القهقرية وإعادة برمجة القلب في المختبر

  1. زراعة الخلايا البلاتينية E في DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1 ميكروغرام / مل بورومايسين و 10 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين حتى يصل التقاء الخلايا البلاتينية E إلى 70٪ -80٪.
  2. في اليوم الأول ، البذور ~ 0.55 × 106 خلايا (البئر الأول) و ~ 0.18 × 106 خلايا (البئر الثاني) في بئرين منفصلين من صفيحة 12 بئرا مع 1 مل من DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين قبل يوم من التعدي الأول.
    ملاحظة: يمكن استخدام أحجام مختلفة من أطباق الاستزراع اعتمادا على كمية الوسائط الفيروسية اللازمة للتجارب. راجع الجدول 1 للحصول على مقاييس أخرى للتجارب.
  3. في اليوم 2 ، قم بنقل بنية الفيروسات القهقرية الرباعية السيسترونيك M-G-T-H التي تشفر Mef2c و Gata4 و Tbx5 و Hand2 الموصوفة في الدراسةالسابقة 9 أو المتجه الفارغ في خلايا Platinum E من البئر الأول. أضف 3 ميكرولتر من كاشف التعدي إلى 30 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة. بعد خمس دقائق ، أضف 1 ميكروغرام من بنية الفيروسات القهقرية أو الناقل الفارغ في خليط كاشف التعدي ووسائط المصل المخفضة. بعد 20 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف الخليط إلى خلايا Platinum E.
  4. في اليوم 3، بعد 16-20 ساعة من التعدي، قم بإزالة الوسائط وتجديد DMEM الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
  5. في اليوم 3 ، بعد 24 ساعة من التعداء الأول ، قم بإجراء التعداء الثاني في البئر الثاني الذي تم فيه طلاء خلايا البلاتين E في اليوم 1 كما هو موضح في الخطوة 1.3).
  6. في اليوم 3 ، بذرة ~ 5 × 104 خلايا ليفية جنينية مجمدة (MEFs) معزولة من مراسل Titin-GFP تضرب الفئران19 في بئر من صفيحة 24 بئرا. هناك حاجة إلى ما مجموعه بئرين من صفيحة 24 بئرا (أي السيطرة غير المصابة وعدوى M-G-T-H).
    ملاحظة: قد يلزم تعديل عدد MEFs المطلية ، لأن معدل استرداد MEFs المجمدة يمكن أن يختلف اعتمادا على ظروف تجميد الخلايا. حوالي 10٪ من التقاء يوم بعد بذر الخلايا كاف لإعادة البرمجة. يمكن تحسين كفاءة إعادة البرمجة باستخدام أطر الهندسة الكهربائية المتعددة الأطراف الجديدة غير المجمدة.
  7. في اليوم 4، بعد 16-20 ساعة من التعدي الثاني، قم بإزالة الوسائط وتجديد DMEM الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS و1٪ بنسلين/ستربتومايسين.
  8. في اليوم 4 ، بعد 48 ساعة من التعدي الأول ، اجمع الوسائط الفيروسية في البئر الأول من خلايا Platinum E باستخدام حقنة سعة 5 مل وقم بتصفيتها من خلال مرشح غشاء بولي إيثر سلفون (PES) 0.45 ميكرومتر. قم بإزالة وسائط نمو الخلايا الليفية على MEFs ، واستبدلها بالوسائط الفيروسية المكملة بالبوليبرين عند 6 ميكروغرام / مل (العدوى الأولى).
  9. في اليوم 5 ، بعد 48 ساعة من التعدي الثاني ، قم بإجراء العدوى الثانية باستخدام الوسائط الفيروسية في البئر الثاني كما هو موضح في الخطوة 1.8).
  10. في اليوم 6 ، بعد 24 ساعة من الإصابة الثانية ، يتم استبدال الوسائط الفيروسية بوسائط تحريض القلب المكونة من DMEM / 199 (4: 1) ، 10٪ FBS ، 5٪ مصل الحصان ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، 1٪ أحماض أمينية أساسية ، 1٪ B-27 ، 1٪ أنسولين - سيلينيوم ترانسفيرين ، 1٪ خليط فيتامين ، و 1٪ بيروفات الصوديوم ، 1 ميكرومتر SB431542 ، و 0.5 ميكرومتر A83-01. قم بتغيير وسائط تحريض القلب كل ثلاثة أيام حتى يتم حصاد الخلايا.

2. تلطيخ المناعة

  1. في 14-15 يوما بعد الإصابة ، قم بتثبيت الخلايا على صفيحة مكونة من 24 بئرا مع 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة.
  2. قم باختراق الخلايا الثابتة باستخدام عازلة النفاذية (0.05٪ Triton-X في PBS) عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للنفاذية كل 5 دقائق.
  3. احتضان الخلايا بمخزن مؤقت عالمي لمدة 45 دقيقة.
  4. احتضان الخلايا بالفأر α-أكتينين (تخفيف 1: 400) والأجسام المضادة GFP للدجاج (تخفيف 1: 400) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أن يغطي حوالي 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة كامل مساحة البئر المكونة من 24 بئرا.
  5. اغسل الخلايا بمخزن مؤقت للنفاذية لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
  6. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية Alexa-555 المضادة للفأر وAlexa-488 المضادة للدجاج (تخفيف 1: 400) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة
  7. اغسل الخلايا بمخزن مؤقت للنفاذية لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
  8. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول DAPI إلى 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية.

3. تصوير عالي المحتوى

  1. قم بتشغيل نظام التصوير.
  2. افتح البرنامج المقترن.
  3. قم بتسجيل الدخول إلى النظام.
  4. على شريط المهام، حدد تشغيل لوحة.
  5. انقر فوق Open Door-Eject Plate لفتح الباب على الجهاز ووضع اللوحة فيه. تأكد من أن اللوحة في الاتجاه الصحيح. انقر فوق إغلاق لوحة تحميل الباب لإغلاق الباب.
  6. انقر فوق إعدادات لوحة التحميل. حدد بروتوكول قالب، ثم انقر فوق تحميل من قاعدة البيانات.
  7. انقر فوق إعداد الاستحواذ.
  8. في مربع الحوار Plate Acquisition Setup ، انقر فوق تكوين.
  9. في علامة التبويب الهدف والكاميرا ، حدد هدف 10x.
  10. في علامة التبويب لوحة ، حدد طبقا بسعة 24 بئرا.
  11. في علامة التبويب المواقع المراد زيارتها في خيارات الموقع، اختر "عدد ثابت من المواقع" لتحديد عدد مواقع التصوير عن طريق اختيار الرقم في الأعمدة والصفوف. يتم استخدام ما مجموعه 36 موقعا للتصوير عن طريق تحديد 6 في الأعمدة و 6 في الصفوف. حدد التباعد بين كل موقع تصوير (أي 500 ميكرومتر).
  12. في علامة التبويب اكتساب ، قم بتعيين عدد الطول الموجي على 3.
  13. في علامة التبويب الأطوال الموجية في الإضاءة، حدد DAPI أو FITC أو Texas Red لكل طول موجي على حدة.
  14. انقر فوق علامة التبويب "تشغيل " ثم قم بإعداد "اسم المجلد" و "اسم اللوحة" للوحة.  انقر فوق الآبار الموجودة على الرسم التخطيطي للوحة للتصوير ثم فوق حساب لإعداد إزاحة التركيز لكل طول موجي. قم بإعداد إزاحة النقاط ل DAPI أولا. انقر فوق التعريض الضوئي التلقائي لإعداد وقت التعرض تلقائيا لكل طول موجي. ثم انقر فوق الحصول على لوحة لبدء تصوير المواقع المحددة.

4. تحليل التصوير عالي المحتوى

  1. بمجرد اكتمال التصوير عالي المحتوى، انقر فوق قائمة الفرز ، وحدد مراجعة بيانات اللوحة لتحديد لوحة للتحليل.
  2. انقر فوق تحديد اللوحة. في مربع الحوار تحديد لوحة للمراجعة ، افتح المجلد وحدد اللوحة المحفوظة في قاعدة البيانات ثم انقر فوق تحديد.
    ملاحظة: لعرض الصور، حدد DAPI وFITC وTexas Red في حقل الأطوال الموجية . في حقل المواقع ، حدد كافة المواقع. انقر فوق موقع من بين المواقع ال 36 المحددة لعرضه في كل نافذة صورة ذات طول موجي ، ثم انقر فوق جدول البحث لتحديد لون للطول الموجي. استخدم مفتاح Print Screen على لوحة المفاتيح والصق الصورة في برنامج تحرير الصور (على سبيل المثال ، Paint و Photoshop) لحفظها.
  3. انقر فوق تشغيل التحليل، وحدد إعداد قالب.
  4. انقر فوق تكوين الإعدادات ثم على عدد الأطوال الموجية. حدد ثلاثة أطوال موجية (على سبيل المثال ، DAPI لتلوين النوى ، و Teaxs Red ل α-actinin ، و FITC ل Titin-GFP).
  5. باستخدام أداة Line في شريط الأدوات، قم بقياس العرض عبر المحور القصير للخلية. استنادا إلى عرض الخلايا المقاسة، قم بتعيين "الحد الأدنى للتقريب للعرض" و"الحد الأقصى التقريبي للعرض" لتضمين معظم الخلايا في موقع التصوير المحدد.
  6. انقر فوق معاينة للتحقق مما إذا كانت جميع النوى تقريبا محددة أم لا. تظهر النوى المحددة اللون الأبيض ، بينما تظل النوى غير المحددة زرقاء (ملطخة ب DAPI). إذا لزم الأمر، قم بإجراء تعديلات على "الحد الأدنى التقريبي للعرض" و"الحد الأقصى للتقريبي للعرض".
  7. لتعيين Intensity Above Local Background ، ضع مؤشر الماوس داخل الخلية وخارجها. تظهر قيمة الكثافة في أسفل النافذة. قلل قليلا من شدة الخلية الخافتة لإظهار الشدة بالتساوي في جميع أنحاء منطقة كل خلية بأكملها. حدد قيمة الكثافة هذه على أنها كثافة أعلى من قيمة الخلفية المحلية . يجب تعيين هذه القيمة بشكل منفصل لكل قناة.
  8. انقر فوق قائمة الفرز وحدد أدوات مساعدة بيانات اللوحة. في مربع الحوار Plate Data Utilities ، انقر فوق تشغيل التحليل لتحديد اللوحة.
  9. في حقل الإعدادات ، حدد الإعداد المحفوظ للتحليل. حدد إضافة إلى قائمة التشغيل التلقائي ، ثم انقر فوق موافق لتشغيل التحليل.
  10. بعد اكتمال التحليل ، انقر فوق قائمة الفرز وحدد أدوات بيانات اللوحة. ثم ، في مربع الحوار Plate Data Utilities ، انقر فوق تصدير القياسات لتصدير نتائج التحليل.
  11. انقر فوق قياسات الخلية والصورة ثم فوق موافق.
  12. في صفحة معالج قياسات التصدير - الخطوة 1 ، حدد اللوحة وانقر فوق التالي.
  13. في صفحة معالج قياسات التصدير - الخطوة 2 ، انقر فوق إنهاء.
  14. في صفحة تكوين تصدير البيانات، حدد أنواع البيانات (على سبيل المثال، اسم البئر، وإجمالي عدد الخلية، ورقم الخلية الإجمالي الفرعي ل DAPI+، ورقم الخلية الإجمالي الفرعي ل Texas Red+، ورقم الخلية الإجمالي الفرعي ل FITC+، ورقم الخلية الإجمالي الفرعي ل DAPI+Texas Red+، ورقم الخلية الإجمالي الفرعي ل DAPI+FITC+Texas Red+، والنسبة المئوية لخلايا DAPI+، النسبة المئوية لخلايا DAPI + Texas Red + ، والنسبة المئوية لخلايا DAPI + FITC + ، والنسبة المئوية لخلايا DAPI + Texas Red + FITC +) ثم انقر فوق موافق.
  15. في صفحة التصدير كملف نصي ، حدد الوجهة لحفظ الملف وانقر فوق موافق.
  16. افتح الملف في Microsoft Excel. سيتم عرض النتائج من قبل كل موقع (الجدول 2). هناك 36 موقعا لكل بئر. باستخدام أداة التحليل ، الجدول المحوري ، قم بتلخيص بيانات المواقع ال 36 (أي مجاميع أرقام الخلايا ومتوسطات النسبة المئوية للخلايا المشار إليها في جميع المواقع ال 36) (الجدول 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تجارب إعادة البرمجة ، قمنا بقياس iCMs باستخدام تحليل تصوير عالي المحتوى كما هو موضح أعلاه. تم عرض الصور المركبة ل 36 موقعا للتصوير التي تم استخدامها لتحليل التصوير عالي المحتوى في الشكل 1. يتم تعريف iCMs على أنها خلايا موجبة مزدوجة (α-actinin + Titin-eGFP +) في هذه التجارب. يظهر تحليل التصوير عالي المحتوى أن ~ 26٪ من الخلايا أظهرت كلا العلامتين القلبيتين بعد نقل M-G-T-H ، بينما ~ 1٪ من خلايا التحكم المنقولة بالنواقل الفارغة تظهر خلايا إيجابية مزدوجة. تم تصور iCMs ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قيمت دراسات إعادة البرمجة السابقة كفاءة إعادة البرمجة باستخدام قياس التدفق الخلوي وأظهرت الجودة الهيكلية ل iCMs باستخدام الكيمياء المناعية في تجربتين منفصلتين. يتطلب تحليل قياس التدفق الخلوي عددا أكبر بكثير من الخلايا الأولية ، وبالتالي زيادة حجم التجارب. في المقابل ، يمكن لتحليل التصوير عالي المحتوى تقييم جودة وكمية إعادة برمجة iCM من خلال تجربة واحدة مع عدد صغير نسبيا من الخلايا. لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة الجديدة منصة تقنية جديدة فعالة لدراسات إعادة البرمجة المستقبلية. على وجه ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء تحليل تصوير عالي المحتوى في المنشأة الأساسية لفحص فاندربيلت عالي الإنتاجية (HTS) بمساعدة ديفيد ويستوفر وجوشوا باور. يتلقى HTS Core دعما من معهد فاندربيلت للبيولوجيا الكيميائية ومركز فاندربيلت إنجرام للسرطان (P30 CA68485). تم دعم هذا العمل من قبل جائزة AHA للمشروع المبتكر 18IPA34110341 و NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.) ، وجائزة زمالة AHA لما بعد الدكتوراه 20POST35210170 (Z.Z).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A83-01Tocris2939
المضاد للدجاج Alexa 488ThermofisherA11039
الأجسام المضادة المضادة ل GFPInvitrogenA10262
المضادة للفأر Alexa 555ThermofisherA21422
الأجسام المضادة لألفا الأكتينينSigmaA7811
محلول DAPIمختبرات ناقلاتH1200
Fugene 6PromegaE2691
مكمل الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم GInvitrogen41400-045
متوسط 199محلول فيتامين Invitrogen11150059
MEMInvitrogen11120-052
برنامج MetaXpressجهاز
Micro XL نظام تخيل الخلية الآليالجزيئي
الحد الأدنى من محلول الأحماض الأمينية الأساسيةSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
مرشح PES (0.45 & micro; م)توماس العلمي1159T84
خلايا Platninum Eخلية BiolabsRV-101
PolybreneSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
عازلة حجب عالميةBiogeneXHK083-50K
جزيئي الجهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  3. Ifkovits, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFbeta signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), 89678(2014).
  4. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  5. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. The EMBO Journal. 33 (14), 1565-1581 (2014).
  6. Umei, T. C., et al. Single-construct polycistronic doxycycline-inducible vectors improve direct cardiac reprogramming and can be used to identify the critical timing of transgene expression. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1805(2017).
  7. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 influences the efficiency and quality of induced cardiac myocyte reprogramming. Circulation Research. 116 (2), 237-244 (2015).
  8. Zhang, Z., Zhang, A. D., Kim, L. J., Nam, Y. J. Ensuring expression of four core cardiogenic transcription factors enhances cardiac reprogramming. Science Reports. 9 (1), 6362(2019).
  9. Zhang, Z., Zhang, W., Nam, Y. J. Stoichiometric optimization of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 expression for contractile cardiomyocyte reprogramming. Science Reports. 9 (1), 14970(2019).
  10. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 8243(2015).
  11. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  12. Zhou, H., et al. ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Development. 31 (17), 1770-1783 (2017).
  13. Zhou, Y., et al. Bmi1 is a key epigenetic barrier to direct cardiac reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  14. Muraoka, N., et al. Role of cyclooxygenase-2-mediated prostaglandin E2-prostaglandin E receptor 4 signaling in cardiac reprogramming. Nature Communications. 10 (1), 674(2019).
  15. Yamakawa, H., et al. Fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions. Stem Cell Reports. 5 (6), 1128-1142 (2015).
  16. Abad, M., et al. Notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing MEF2C transcriptional activity. Stem Cell Reports. 8 (3), 548-560 (2017).
  17. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 53 (3), 323-332 (2012).
  18. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 60, 97-106 (2013).
  19. da Silva Lopes, K., Pietas, A., Radke, M. H., Gotthardt, M. Titin visualization in real time reveals an unexpected level of mobility within and between sarcomeres. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 785-798 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Induced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة