تقييم إعادة برمجة القلب باستخدام تحليل التصوير عالي المحتوى

Zhentao Zhang; Young-Jae Nam

doi:10.3791/61859

Method Article

تقييم إعادة برمجة القلب باستخدام تحليل التصوير عالي المحتوى

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

Zhentao Zhang¹^,²^,³ , Young-Jae Nam¹^,²^,³

¹Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ²Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, ³Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لتحديد الخلايا الشبيهة بخلايا عضلة القلب المستحثة المعاد برمجتها مباشرة (iCMs) في المختبر باستخدام تحليل تصوير عالي المحتوى. تسمح لنا هذه الطريقة بتحديد كفاءة إعادة برمجة القلب بطريقة آلية وتصور iCMs مباشرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس الخلايا الشبيهة بخلايا عضلة القلب المستحثة (iCMs) ، والتي يتم إعادة برمجتها مباشرة في المختبر بواسطة تقنية إعادة البرمجة. توفر إعادة برمجة القلب استراتيجية لتوليد خلايا عضلة القلب الجديدة. عن طريق إدخال عوامل النسخ القلبية الأساسية في الخلايا الليفية. يمكن تحويل الخلايا الليفية إلى iCMs دون الانتقال عبر حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. ومع ذلك ، لا يزال معدل تحويل الخلايا الليفية إلى iCMs منخفضا. وفقا لذلك ، كانت هناك العديد من الأساليب الإضافية لتعزيز كفاءة إعادة برمجة القلب. قامت معظم هذه الدراسات بتقييم كفاءة إعادة برمجة القلب باستخدام قياس التدفق الخلوي ، بينما أجرت في نفس الوقت كيمياء الخلايا المناعية لتصور iCMs. وبالتالي ، يلزم وجود مجموعتين منفصلتين على الأقل من تجارب إعادة البرمجة لإثبات نجاح إعادة برمجة iCM. في المقابل ، سيوفر تحليل التصوير الآلي عالي المحتوى كلا من القياس الكمي والتأهيل لإعادة برمجة iCM مع عدد صغير نسبيا من الخلايا. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن تقييم كمية ونوعية iCMs بشكل مباشر من خلال تجربة إعادة برمجة واحدة. سيكون هذا النهج قادرا على تسهيل دراسات إعادة برمجة القلب المستقبلية التي تتطلب تجارب إعادة برمجة واسعة النطاق مثل فحص العوامل الوراثية أو الدوائية لتعزيز كفاءة إعادة البرمجة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يقتصر تطبيق بروتوكول تحليل التصوير عالي المحتوى على إعادة برمجة القلب. يمكن تطبيقه على إعادة برمجة سلالات الخلايا الأخرى بالإضافة إلى أي تجارب تلطيخ مناعي تحتاج إلى القياس الكمي والتصور للخلايا الملطخة بالمناعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير إعادة برمجة القلب كنهج بديل للنهج بوساطة الخلايا الجذعية لتوليد خلايا عضلة القلب الجديدة. بالنظر إلى أنه لا ينتقل عبر حالة الخلايا الجذعية ، فإنه يتمتع بقدرة عالية على تجاوز بعض القيود الموروثة في الأساليب بوساطة الخلايا الجذعية. لقد ثبت أن العدوى الفيروسية لما لا يقل عن ثلاثة أو أربعة عوامل نسخ قلبية إلى الخلايا الليفية يمكن أن تحول الخلايا الليفية نحو مصير قلبي عن طريق القضاء على برامج الجينات الليفية وإعادة بناء شبكات النسخ القلبية في الخلايا الليفية¹^،²^،³^،⁴^،⁵

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بالمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. توليد الفيروسات القهقرية وإعادة برمجة القلب في المختبر

زراعة الخلايا البلاتينية E في DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1 ميكروغرام / مل بورومايسين و 10 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين حتى يصل التقاء الخلايا البلاتينية E إلى 70٪ -80٪.
في اليوم الأول ، البذور ~ 0.55 × 10⁶ خلايا (البئر الأول) و ~ 0.18 × 10⁶ خلايا (البئر الثاني) في بئرين منفصلين من صفيحة 12 بئرا مع 1 مل من DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين قبل يوم من التعدي الأول....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تجارب إعادة البرمجة ، قمنا بقياس iCMs باستخدام تحليل تصوير عالي المحتوى كما هو موضح أعلاه. تم عرض الصور المركبة ل 36 موقعا للتصوير التي تم استخدامها لتحليل التصوير عالي المحتوى في الشكل 1. يتم تعريف iCMs على أنها خلايا موجبة مزدوجة (α-actinin ⁺ Titin-eGFP ⁺) في هذه التجارب. يظهر تحليل التصوير عالي المحتوى أن ~ 26٪ من الخلايا أظهرت كلا العلامتين القلبيتين بعد نقل M-G-T-H ، بينما ~ 1٪ من خلايا التحكم المنقولة بالنواقل الفارغة تظهر خلايا إيجابية مزدوجة. تم تصور iCMs ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قيمت دراسات إعادة البرمجة السابقة كفاءة إعادة البرمجة باستخدام قياس التدفق الخلوي وأظهرت الجودة الهيكلية ل iCMs باستخدام الكيمياء المناعية في تجربتين منفصلتين. يتطلب تحليل قياس التدفق الخلوي عددا أكبر بكثير من الخلايا الأولية ، وبالتالي زيادة حجم التجارب. في المقابل ، يمكن لتحليل التصوير عالي المحتوى تقييم جودة وكمية إعادة برمجة iCM من خلال تجربة واحدة مع عدد صغير نسبيا من الخلايا. لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة الجديدة منصة تقنية جديدة فعالة لدراسات إعادة البرمجة المستقبلية. على وجه ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء تحليل تصوير عالي المحتوى في المنشأة الأساسية لفحص فاندربيلت عالي الإنتاجية (HTS) بمساعدة ديفيد ويستوفر وجوشوا باور. يتلقى HTS Core دعما من معهد فاندربيلت للبيولوجيا الكيميائية ومركز فاندربيلت إنجرام للسرطان (P30 CA68485). تم دعم هذا العمل من قبل جائزة AHA للمشروع المبتكر 18IPA34110341 و NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.) ، وجائزة زمالة AHA لما بعد الدكتوراه 20POST35210170 (Z.Z).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
المضاد للدجاج Alexa 488	Thermofisher	A11039
الأجسام المضادة المضادة ل GFP	Invitrogen	A10262
المضادة للفأر Alexa 555	Thermofisher	A21422
الأجسام المضادة لألفا الأكتينين	Sigma	A7811
محلول DAPI	مختبرات ناقلات	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
مكمل الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم G	Invitrogen	41400-045
متوسط 199	محلول فيتامين Invitrogen	11150059
MEM	Invitrogen	11120-052
برنامج MetaXpress	جهاز
Micro XL نظام تخيل الخلية الآلي			الجزيئي
الحد الأدنى من محلول الأحماض الأمينية الأساسية	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
مرشح PES (0.45 & micro; م)	توماس العلمي	1159T84
خلايا Platninum E	خلية Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
عازلة حجب عالمية	BiogeneX	HK083-50K

جزيئي الجهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تقييم إعادة برمجة القلب باستخدام تحليل التصوير عالي المحتوى

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles