نقدم نموذج في المختبر لتقييم القدرة العصبية في حاسة الشم (OEG) ، بعد الإصابة العصبية. وهو يستند إلى ثقافة ثنائية من الخلايا العصبية العقدية الشبكية البالغين (RGN) على الطبقات الأحادية OEG والدراسة اللاحقة لتجديد محور عصبي ، من خلال تحليل علامات RGN المحورية وstomodendritic.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم ترجمة خلايا الغليا (OEG) الشمية على طول الطريق من الغشاء المخاطي الشمي إلى وإلى طبقة العصب الشمي (ONL) من لمبة الشم. طوال حياة الكبار، فهي المفتاح لنمو محور عصبي من الخلايا العصبية الشمية التي تم إنشاؤها حديثا، من بروبريا لامينا إلى ONL. بسبب خصائصها المؤيدة للتجديد، وقد استخدمت هذه الخلايا لتعزيز تجديد محور عصبي في الحبل الشوكي أو نماذج إصابات العصب البصري.
نقدم نموذج في المختبر إلى المقايسة وقياس القدرة العصبية OEG بعد الإصابة العصبية. في هذا النموذج، يتم استزراع OEG الإنسان المتخلّف بشكل عكسي (ihOEG) باعتباره أحادي الطبقات، يتم استخراج شبكية العين من الفئران البالغة والخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN) على الطبقة الأحادية OEG. بعد 96 ح، يتم تحليل علامات محور عصبي وsmatodendritic في RGNs بواسطة immunofluorescence وعدد من RGNs مع محور عصبي ومتوسط طول محور عصبي / الخلايا العصبية يتم تحديد كميا.
هذا البروتوكول لديه ميزة على غيرها من المختبرات في المختبر التي تعتمد على الخلايا العصبية الجنينية أو ما بعد الولادة, أنه يقيم خصائص OEG العصبية في الأنسجة البالغة. أيضا، فإنه ليس فقط مفيدة لتقييم إمكانات العصبية التنكسية من ihOEG ولكن يمكن أن تمتد إلى مصادر مختلفة من OEG أو الخلايا الدبقية الأخرى.
المقدمة
لدى الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي البالغ (CNS) قدرة تجديدية محدودة بعد الإصابة أو المرض. استراتيجية مشتركة لتعزيز تجديد الجهاز العصبي المركزي هي زرع، في موقع الإصابة، من أنواع الخلايا التي تحفز نمو عصبي مثل الخلايا الجذعية، والخلايا Schwann، الفلكيات أو حاسة الشم خلايا glia (OEG)1،2،3،5.
OEG مشتق من قمةالعصبية 6 ويقع في الغشاء المخاطي الشمي وفي لمبة الشم. في البالغين، تموت الخلايا العصبية الحسية الشمية بانتظام نتيجة للتعرض البيئي ويتم استب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الوطنية والمؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا.
1. ihOEG (Ts12 و Ts14) الثقافة
ملاحظة: يتم هذا الإجراء في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية لثقافة الأنسجة.
- إعداد 50 مل ME10 OEG ثقافة المتوسطة كما هو منصوص عليه في الجدول 1.
- إعداد 5 مل من DMEM/F12-FBS، كما هو منصوص عليه في الجدول 1،في أنبوب مخروطي 15 مل.
- دافئة على حد سواء وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية في حمام المياه النظيفة، لمدة 15 دقيقة.
- ذوبان Ts12 و Ts14 قوارير الخلايا في 37 درجة مئوية في حمام المياه النظيفة.
- إعادة بنا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا البروتوكول، نقدم نموذج في المختبر إلى فحص OEG القدرة العصبية بعد إصابة الخلايا العصبية. كما هو مبين في الشكل 1، مصدر OEG هو عكسها خلد الإنسان OEG خط الخلية النيكل -Ts14 و Ts12 - ، والتي تستمد من الثقافات الأولية ، أعدت من المصابيح الشم التي تم الحصول عليها في تشريح الجثث15،17،18. يتم استخراج أنسجة الشبكية من الفئران البالغة، وهضمها، ويتم مطلي الخلايا العصبية العقدية الشبكية (RGN) تعليق على إم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعتبر زرع OEG في مواقع إصابات CNS علاجًا واعدًا لإصابة الجهاز العصبي المركزي بسبب خصائصه المكونة المؤيدة للأعصاب7،8،9. ومع ذلك ، اعتمادا على مصدر الأنسجة - الغشاء المخاطي الشمي (OM-OEG) مقابل لمبة الشم (OB-OEG) - أو عمر المتبرع ، يوجد اختلاف كبير في هذه القدرة26،31،33،36. ولذلك، فمن المهم أن يكون نموذج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل مالياً المشروع SAF2017-82736-C2-1-R من وزيرية سيو دي سيننسيا إي إنفوكسيون إلى MTM-F ومن مؤسسة يونيفرسيداد فرانسيسكو دي فيتوريا إلى JS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجسم المضاد 514 | المرجع 34 | مضاد الأرانب متعدد النسيلة ، والذي يتعرف على MAP2A و B. | |
| الأجسام المضادة SMI-31 | BioLegend | 801601 | الجسم المضاد أحادي النسيلة ضد بروتينات MAP1B و NF-H |
| المضادة للفأر Alexa Fluor 488 الجسم المضاد | ThermoFisher | A-21202 | |
| المضاد للأرانب Alexa Fluor 594 الجسم المضاد | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 ملحق | Gibco | 17504044 | |
| D و L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | مثبط مستقبلات NMDA 283967 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | صبغة الفلورسنت النواة |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | وسط زراعة |
| الخلايا FBS | Gibco | 11573397 | مصل الأبقار الجنيني |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | مصل الأبقار الجنيني |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | تصاعد الوسط |
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة - الولايات المتحدة الأمريكية) | برنامج الصور | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | زراعة الخلايا العصبية متوسط |
| نظام تفكك غراء | شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية | LK003150 | للاستخدام في عزل الخلايا العصبية |
| PBS | صنع | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين ب | لونزا | 17-745E | المضادة للجراثيم والجراثيم |
| جيبكو | 13028014 | مستخلص الغدة النخامية البقري | |
| بولي -L- ليسين (PLL) | سيجما | A-003-M |
المراجع
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
