مقالة منهجية

التصوير الخالي من التسميات لديناميكيات تخزين الدهون في Elegans Caenorhabditis باستخدام المجهر التشتت رامان المحفزة

4.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61870

⸱

مايو 28, 2021

 ,  ,  , 
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يسمح الفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS) بالتصوير الانتقائي الخالي من التسميات للمويات الكيميائية المحددة وقد تم استخدامه بشكل فعال لتصوير جزيئات الدهون في الجسم الحي. هنا، ونحن نقدم مقدمة موجزة لمبدأ المجهر SRS ووصف أساليب لاستخدامه في تخزين الدهون التصوير في Elegans Caenorhabditis.

الملخص

استقلاب الدهون هو عملية فسيولوجية أساسية ضرورية لصحة الخلايا والكائنات الحية. خلل تنظيم التمثيل الغذائي للدهون غالبا ما يثير السمنة والعديد من الأمراض المرتبطة بها بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية، ومرض السكري من النوع الثاني، والسرطان. لتعزيز الفهم الحالي لتنظيم التمثيل الغذائي الدهون، أصبحت الأساليب الكمية لقياس بدقة في مستويات تخزين الدهون في الجسم الحي في الزمان والمكان على نحو متزايد مهمة ومفيدة. النهج التقليدية لتحليل تخزين الدهون هي شبه كمية للتقييم المجهري أو تفتقر إلى معلومات الزمانية spatio للقياس الكيميائي الحيوي. التصوير المجهري التشتت رامان (SRS) هو تكنولوجيا التصوير الكيميائي خالية من التسمية التي تمكن الكشف السريع والكمي من الدهون في الخلايا الحية مع قرار subcellular. كما يتم استغلال التباين من الاهتزازات الجزيئية الجوهرية، يسمح الفحص المجهري SRS أيضا تتبع رباعي الأبعاد من الدهون في الحيوانات الحية. في العقد الماضي، تم استخدام المجهر SRS على نطاق واسع لتصوير جزيء صغير في البحوث الطبية الحيوية والتغلب على القيود الرئيسية للتلطيخ الفلوري التقليدي وطرق استخراج الدهون. في المختبر، قمنا بالجمع بين المجهر SRS مع الأدوات الوراثية والبيوكيميائية المتاحة للكائن الحي نموذج قوي، Caenorhabditis elegans، للتحقيق في توزيع وتغايرية قطرات الدهون عبر الخلايا والأنسجة المختلفة، وفي نهاية المطاف لاكتشاف مسارات جديدة الإشارات المحفوظة التي تعدل التمثيل الغذائي للدهون. هنا، نقدم مبادئ العمل والإعداد التفصيلي للمجهر SRS وتوفير أساليب لاستخدامه في تحديد كمي لتخزين الدهون في نقاط زمنية تنموية متميزة من النوع البري والأنسولين مما يشير إلى نقص متحولة C. elegans.

المقدمة

أصبحت السمنة مشكلة صحية عالمية تهدد ثلث السكان في جميع أنحاء العالم، وهي تمثل مصدر قلق طبي خطير، نظرا لارتباطها بسوء الصحة العقلية1 والأمراض الفتاكة بما في ذلك مرض السكري2وأمراض القلب والأوعية الدموية3 وبعض أنواع السرطان4. دراسة التمثيل الغذائي للدهون أمر ضروري لفهم أفضل للمشاكل البيولوجية وراء السمنة. كمية سريعة ومحددة لتخزين الدهون ينطوي على الكشف عن الأحماض الدهنية ومشتقاتها، وكذلك المستقلبات التي تحتوي على ستيرول، مع حساسية عالية ويفضل مع المعلومات المكانية. الدهون هي أهداف صعبة للصورة لأنها تفتقر إلى الفلورسنت الجوهرية ولا يمكن تمييزها بسهولة الفلورسنت. غالبا ما تكون علامات الفلورسنت أكبر من جزيئات الدهون ، وبالتالي ، يمكن أن تكون غازية كيميائيا وغير عملية في تطبيقات الجسم الحي. استراتيجية وضع العلامات خالية من التسمية أو الحد الأدنى ضروري للحفاظ على بنية مسعورة من جزيئات الدهون5. خلقت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير فرصا مثيرة للتصوير الخالي من الملصقات للدهون في الخلايا الحية والأنسجة والكائنات الحية.

وتشمل النهج التقليدية لتحليلات تخزين الدهون في العينات البيولوجية المقايسات الكيميائية الحيوية وبروتوكولات تلطيخ مع الأصباغ الدهنية. إن المقايسات البيوكيميائية للقياس الكمي التي تنطوي على قياس الطيف الكتلي (MS) لا مثيل لها في قابليتها للحل الجزيئي ، ولكنها تتطلب كميات كبيرة جدا من العينات وعادة ما يستغرق إعداد العينة عدة ساعات ، مما يحد من تطبيقها للتصوير في الوقت الحقيقي للأنظمة الحية5. وثمة قيد رئيسي آخر لهذه المقايسات هو الافتقار إلى المعلومات المكانية. من ناحية أخرى، الأصباغ الدهنية مثل النفط الأحمر O والسودان الأسود توفير الأنسجة والتوزيع الخلوي من العضيات تخزين الدهون وبالمقارنة مع تقنيات التصلب العصبي المتعدد، وهذه الأساليب تلطيخ هي أيضا منخفضة في التكلفة وسهلة الأداء. ومع ذلك ، تتطلب بروتوكولات التلطيخ هذه التثبيت ، والتي يمكن أن تؤثر على الطبيعة الكارهة للماء لقطرات الدهون ، وتولد تغييرات اصطناعية في بنيتها وتؤدي إلى عدم اتساق بين التجارب6. وقد أدت الصعوبات التقنية المرتبطة بالتقنيات الكيميائية الحيوية والتلطيخ إلى البحث عن طرق خالية من الملصقات لتصوير جزيئات الدهون والزيادة السريعة في استخدام المجهر المتماسك لتشتت رامان (CRS) في تصوير الدهون.

تم التعرف على تأثير رامان لأول مرة من قبل رامان وكريشان ، حيث أفادوا أنه عند التفاعل مع الفوتون ، يمكن للجزيء توليد ضوء متناثر دون أي تغيير في الطول الموجي (يسمى تشتت رايلي) أو نادرا ما يكون مع طول موجي متغير (يسمى تشتت رامان) وهذا التغيير في الطول الموجي هو سمة من سمات المجموعات الكيميائية الوظيفية داخل الجزيء7. عندما تتحمس الروابط الكيميائية داخل جزيء إلى مستوى طاقة اهتزازي أعلى من خلال فوتون حادث ، يسمى فوتون المضخة ، تصبح طاقة الفوتون المتناثر ، المسمى فوتون ستوكس ، أقل. خلاف ذلك ، يمكن أن تصل الروابط الكيميائية إلى مستوى طاقة اهتزازي أقل إذا كانت في الأصل على مستوى أعلى ، واكتساب الفوتون المتناثر للطاقة ليكون الفوتون المضاد لست ستوكس. ويعرف فرق التردد بين الحادث والفوتونات المتناثرة باسم تحول رامان. كل رابطة كيميائية داخل جزيء لديه تحول رامان مميزة وقابلة للقياس الكمي. على سبيل المثال، السندات CH2 لديه تحول رامان من 2845 سم-1،وهو وفير في سلاسل الأحماض الدهنية8. هذه الإشارة رامان عفوية ضعيفة جدا عموما، والتي حدت إلى حد كبير من سرعة التصوير في المجهر رامان عفوية التقليدية. على مر السنين، تم تطوير نهج مختلفة لزيادة سرعة التصوير وحساسية الفحص الدقيق رامان عفوية. متماسكة رامان تشتت المجهر ، بما في ذلك متماسكة المضادة ستوكس رامان التشتت (سيارات) المجهر وتحفيز رامان التشتت (SRS) المجهر ، هو أحدث تقدم. السيارات وSRS لديها مبادئ عمل مختلفة قليلا، ولكن كلاهما تقنيات خالية من التسمية التي لديها القدرة على التصوير الحي، يمكن أن تسفر عن معلومات مكانية وزمنية على ديناميات تخزين الدهون، وتتطلب فقط حجم عينة صغيرة. السيارات المجهر يعاني من خلفية غير رنانة، والتي تأتي من مختلف العمليات غير الخطية، وإشارات سيارات لديها أيضا علاقة غير خطية مع تركيز الجزيء، والتي تعقد معا عملية القياس الكمي9. على عكس المجهر CARS، لا يولد المجهر SRS إشارات خلفية غير رنانة ويوفر الاعتماد الخطي على تركيز جزيء الفائدة. وهكذا، يستخدم حاليا المجهر SRS على نطاق أوسع لتصوير الدهون.

في المجهر SRS، يمكن تضخيم إشارات رامان عفوية ضعيفة عندما متحمس من قبل اثنين من أشعة الليزر متزامنة مع اختلاف التردد مطابقة تردد اهتزاز السندات الكيميائية. سوف يشهد الجزيء انتقالا معززا إلى حالة متحمسة بسبب الإثارة المتماسكة. ونتيجة لذلك ، يتم تعزيز معدل توليد الفوتون ستوكس. وبالتالي، تزداد كثافة شعاع "ستوكس" المنقول (كسب رامان المحفز، SRG) وتنخفض كثافة شعاع "المضخة" المنقول (فقدان رامان المحفز، SRL). الكشف عن إشارات SRG أو SRL يكمن وراء الأساس لتحفيز رامان التشتت (SRS) التصوير المجهري للجزيئات مع روابط كيميائية محددة10. إذا كان اختلاف التردد بين شعاعي الليزر لا يطابق التردد الاهتزازي للرابط الكيميائي داخل جزيء مهم، فلن يتم توليد إشارات SRG أو SRL. سرعة التصوير من المجهر SRS حوالي 2 ميكروثانية لكل بكسل أو 1 ثانية لكل إطار، وهو أسرع بكثير من المجهر رامان عفوية11. الدقة الجانبية النموذجية للفحص المجهري SRS محدودة الحيود وحوالي 300 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح العمليات البصرية ذات الفوتونين من المجهر SRS بالتصوير ثلاثي الأبعاد الحجم لعينات الأنسجة السميكة النسبية ويمكن أن يصل عمق التصوير إلى 300-500 ميكرومتر. وعموما، يقدم المجهر SRS تقنية تصوير فعالة وخالية من الملصقات للكشف عن الجزيئات الحيوية المحددة، وخاصة الدهون.

قطرات الدهون هي العضيات ذات الغشاء الواحد، والتي هي موقع التخزين الخلوي الرئيسي للدهون المحايدة، بما في ذلك ثلاثيات اللجلس (TAGs) وإسترات الكوليسترول (CEs). CH2 السندات في سلاسل الأحماض الدهنية من هذه الجزيئات الدهنية توليد إشارات SRS قوية في 2,845 سم-1 عندما متحمس8,وبالتالي تمكين الكشف عن وتكميم مستويات الدهون التخزين في الخلايا سليمة, أقسام الأنسجة وحتى الكائنات الحية كلها12,13,14,15. على وجه الخصوص ، C. elegans مفيدة لدراسات التصوير الدهني بسبب شفافيتها. مثل الثدييات، C. elegans أيضا تخزين الدهون في قطرات الدهون ومسارات التوليف والتدهور من جزيئات الدهون يتم الحفاظ عليها للغاية16. في هذا البروتوكول، وسوف نقدم مبدأ العمل من المجهر SRS، الإعداد الأساسي ووصف أساليب استخدامه في التصوير الدهون في C. elegans.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الإعداد مفيدة لتحفيز رامان التشتت المجهر

ملاحظة: تم بناء نظام الفحص المجهري SRS على ليزر بيكوثانية مع مذبذب بصري متكامل للمضخة ومجهر مسح بالليزر confocal. يوفر المذبذب قطارين نبضين بيكوثانية، بما في ذلك شعاع ستوكس عند 1064 نانومتر وشعاع مضخة غير قادر على بين 700-990 نانومتر. يتم تحقيق التداخل الزمني والمكاني للشعاعين داخل الليزر. تم تصميم معامل كهربائي بصري مدمج (EOM) خصيصا للتنظير المجهري SRS. وسيركز هذا البروتوكول على اقتران الليزر بالمجهر، والتشغيل اليومي لهذا النظام(الشكل 1). يتطور تكوين نظام مجهر SRS في العقد الماضي. تجدر الإشارة إلى أن الوصف التالي يمثل واحد فقط من عدة تكوينات.

  1. تغذية أشعة الليزر في المجهر
    1. إعداد periscope لرفع شعاع من مخرج مصدر الضوء picosecond إلى منفذ الإدخال ليزر الأشعة تحت الحمراء على الماسح الضوئي للمجهر.
      تنبيه: اقرأ دليل نظام الليزر قبل التشغيل واتخاذ جميع الاحتياطات المطلوبة لأن الأشعة تحت الحمراء القريبة الناتجة عن نظام الليزر من الفئة IV هذا يمكن أن تسبب ضررا شديدا للعيون والجلد. استكمال التدريبات المطلوبة من قبل إدارات السلامة البيئية المؤسسية. ارتداء نظارات واقية ومعطف المختبر مع الأكمام مكبلة.
    2. أولا، تعيين شعاع مضخة في 750 نانومتر وانخفاض طاقة الليزر إلى 50 كيلوواط، والتي يمكن تفتيشها بصريا، affiliating المحاذاة. ثم استخدم موسع شعاع(الشكل 1،L1 وL2) لضبط قطر الحزمة لتناسب الفتحة الخلفية لأهداف المجهر. استخدام مرايا ترحيل اثنين(الشكل 1، M1 و M2) لتوجيه شعاع الليزر إلى periscope (الشكل 1، P1 و P2). سوف المنظار رفع شعاع إلى ارتفاع فتح الماسح الضوئي وبمثابة مرآة التوجيه للمحاذاة كذلك.
    3. تعيين المقابض على periscope في وسط نطاق ضبط واختيار الموقف الأولي وزاوية كل مرآة بحيث شعاع الليزر يضرب وسط المرآة، تقريبا.
    4. قم بإجراء المحاذاة الخشنة باستخدام منفذ فارغ على البرج الهدف وضع مسبار مقياس الطاقة لقياس قوة الضوء المرسل. قم بتعيين الماسح الضوئي للمجهر عند أعلى تكبير (50x)، ثم قم بقياس قوة الضوء المرسل باستخدام بقعة شعاع الليزر المركزة. تحسين المقابض على كل مرآة، M1 و M2، تكراريا لتحقيق أعلى قوة الليزر المرسلة.
    5. قم بإجراء المحاذاة الدقيقة باستخدام أداة المحاذاة. وضع غطاء المحاذاة الهدف مضان على مقعد الهدف فارغة وضبط المقابض من M1 لمركز المكان. ثم أدخل أنبوب التمديد للهدف وضبط المقابض من M2 إلى مركز بقعة.
    6. كرر الخطوتين 1.1.4 و1.1.5 حتى يمنتصف الحزمة الهدف في كلا الموضعين.
  2. ربط الكشف والإلكترونيات
    1. إعداد الوحدة النمطية للكشف عن SRS. ضع مكعب مقسم شعاع بعد المكثف لتوجيه الليزر المرسلة إلى وحدة الصمام الثنائي الضوئي. تتضمن الوحدة تلسكوبا لترحيل وتغيير حجم الحزمة لتناسب المنطقة النشطة من الصمام الثنائي الضوئي ، بالإضافة إلى فلتر بصري لإزالة شعاع ستوكس المعدل والسماح لشعاع المضخة بالمرور من أجل الإزالة.
    2. إعداد اتصال الإلكترونيات (الشكل 1). يتم تعديل كثافة شعاع ستوكس بواسطة EOM مدمج عند 20 ميغاهرتز داخل الليزر غير القادر على البيكوسيكوند. إخراج تردد التشكيل من الليزر هو إدخال في مكبر للصوت قفل في كتردد مرجعي للdemodulation. تغذية إشارة الإخراج من الصمام الثنائي الضوئي في مكبر للصوت قفل في لdemoulating SRL.
      ملاحظة: يمكن ترقية أنظمة الليزر ذات الصندوق الواحد وبالتالي يمكن أن تختلف مواصفاتها بسبب تاريخ الإنتاج المختلف. النسخة السابقة من نظام الليزر غير قادر picosecond, المستخدمة في هذا البروتوكول, لديه شعاع ستوكس من 1,064 نانومتر, ولكن الإصدار الأخير لديه شعاع ستوكس من 1,031 نانومتر. يتم تخصيص تردد التشكيل من EOM المستخدمة في هذا البروتوكول إلى 8 ميغاهرتز، ولكن تردد التشكيل الافتراضي للنظام الأخير يمكن أن يكون 10 أو 20 ميغاهرتز.
    3. وأخيرا، تغذية إخراج مكبر للصوت قفل في المربع التناظرية من المجهر لتحويل إشارة التناظرية الكهربائية إلى إشارة رقمية. يجب أن يكون النظام جاهزا لمعالجة إشارة SRS.
  3. تحسين ظروف التصوير
    1. قم بعمل عينة كيميائية لمحاذاة النظام. على سبيل المثال، استخدم dodecane لتحسين المجهر، لأن dodecane لديه إشارة SRS قوية جدا من السندات C-H. استخدام ختم آمن لجعل غرفة صغيرة. وضع 5 ميكرولتر من دوديكان وتغطيتها مع coverlip.
      ملاحظة: استبدل عينة دوديكان بمجرد أن تبدو غير واضحة أو تعرض الحطام، بعينة جديدة يمكن استخدامها للمحاذاة لمدة 2-3 أشهر.
    2. ضع العينة على مرحلة المجهر. التركيز بشكل صحيح على قطرة السائل. ويمكن القيام به بشكل أسرع من خلال البحث عن حافة لوحة دوديكان. ضبط المكثف لإضاءة كولر.
    3. تعيين معلمات التصوير. تحقق مما إذا كانت مرحلة التأخير على الأرقام الصحيحة. تعيين الطول الموجي شعاع مضخة إلى 795.8 نانومتر. باستخدام بطاقة استشعار الأشعة تحت الحمراء و عارض الأشعة تحت الحمراء، تحقق ما إذا كان مسار شعاع المضخة لا يزال صحيحا.
    4. تعيين قوة شعاع مضخة إلى 200 كيلوواط وشعاع ستوكس إلى 400 كيلوواط على لوحة التحكم النظام picosecond.
      ملاحظة: الإنتاجية الليزر من مخرج الليزر إلى الهدف آخر من الحزم اثنين هي تقريبا 25٪ للمضخة و 14٪ لست ستوكس لإعداد هذا النظام. لذلك، فإن قوة ما بعد الهدف من شعاع المضخة هي حوالي 50 كيلوواط وبالنسبة لشعاع ستوكس هو حوالي 56 كيلوواط. وقد تغير عرض نبض نظام الليزر picosecond الأخيرة من 6 PS إلى 2 PS، وبالتالي، ينبغي أن تكون قوة الليزر تطبيقها أقل من ذلك.
    5. تعيين كسب مكبر للصوت قفل في إلى أقصى حد. فتح مصراع لكل من الحزم، فضلا عن مصراع الرئيسي لليزر.
    6. مسح العينة ضوئيا والتحقق من الصورة على شاشة الكمبيوتر. تغيير وضع العرض إلى مرحبا لو في برنامج التصوير. ضبط النطاق لرؤية التشبع ~ 50٪. تحقق مما إذا كان التشبع يتم توسيطه في الصورة. إذا لم يكن الأمر كذلك، ضبط بعناية مرايا التوجيه، M1 و M2، لتحقيق أقصى قدر من كثافة الصورة ومركز كثافة الذروة.
    7. ضبط مرحلة التأخير والعثور على الحد الأقصى لشدة إشارة SRS من عينة dodecane. النظام جاهز للاستخدام.

2. إعداد عينات C. elegans للتصوير المجهري SRS

ملاحظة: ككائنات نموذجية، وقد ثبت Caenorhabditis elegans لتكون مفيدة جدا لتقنيات التصوير متعددة. فهي شفافة الجسم كله، وبالتالي يمكن تصوير الأنسجة المختلفة في الحيوان سليمة دون الحاجة إلى تشريح. في C. elegans ، يتم تخزين الدهون المحايدة في قطرات الدهون الموجودة في الأمعاء ، والتي تتكون من 20 خلية ظهارية تقع بشكل مكرر حول التجويف المعوي16. خلايا تحت الجلد والبويضات أيضا تخزين الدهون. الشكل الرئيسي من الدهون التخزين في قطرات الدهون C. elegans هي triacylglycerols (TAGs)17، والتي تولد إشارات SRS قوية بسبب وفرة من السندات CH2 موجودة في سلاسل الأحماض الدهنية الخاصة بهم. سيركز هذا القسم على كيفية إعداد عينات C. elegans للتصوير المجهري SRS وتحديد كمي لمستويات تخزين الدهون المعوية.

  1. إعداد الشرائح التصوير
    1. أولا، إعداد محلول الآغاروز 2٪ في المقطر H2O، وتأكد من أن جميع agarose يذوب قبل إعداد منصات الآغاروز.
    2. إضافة قطرة واحدة من agarose 2٪ الحارة على شريحة فارغة (حوالي 100 ميكرولتر) التي يتم وضعها بين الشرائح الدعم مع طبقتين من الشريط المختبري ووضع بسرعة شريحة ثانية على رأس الشريحة الأولى. اضغط برفق لإنشاء رقيقة، حتى لوحة الآغاروز.
    3. ضع هذه الشرائح جانبا في وضع مغلق ولا تفصلها حتى تصبح الديدان جاهزة للانكائها. إعداد الشرائح الطازجة قبل كل جلسة التصوير، كما منصات سوف تجف بعد 1 يوم.
      ملاحظة: استخدام غرف التصوير متعددة الآبار، إذا التصوير عدة الديدان في الشاشات الوراثية عالية الإنتاجية18. استخدام الاجهزة التصوير الحية لصورة spatio الزمنية ديناميات التمثيل الغذائي للدهون من خلال التنمية والشيخوخة19.
  2. تركيب الديدان
    1. إعداد عامل تخدير عن طريق إضافة أزيد الصوديوم أو ليفاميسول في المخزن المؤقت M9 إلى التركيز النهائي من 100 mM أو 1 mM، على التوالي.
      ملاحظة: استخدام levamisole إذا الديدان تحتاج إلى استرداد بعد التصوير ل genotyping بعد الشاشات الوراثية.
      تنبيه: العديد من عوامل التخدير، بما في ذلك أزيد الصوديوم والليفاميسول، ضارة إذا تم استنشاقها. ارتداء قفازات واقية والملابس، فضلا عن استخدام غطاء الدخان الكيميائي عند إعداد تلك الحلول العمل.
    2. ضع قطرة من عامل التخدير على غطاء (حوالي 4-5 ميكرولتر ل 10-20 دودة).
      ملاحظة: ضبط مقدار عامل تخدير وفقا لعدد الفيروس المتنقل للحفاظ على الديدان أقرب إلى بعضها البعض قدر الإمكان. استخدام الكثير من السائل لعدد قليل من الديدان قد يسبب الديدان لنشر على لوحة agarose.
    3. اختيار الديدان ليتم تصويرها تحت المجهر تشريح ونقلها إلى قطرات عامل تخدير. بعد إضافة جميع الديدان إلى القطيرات ، قم بتحريكها باستخدام منتقي الديدان وتأكد من عدم تداخلها مع بعضها البعض.
    4. فصل الشرائح الزجاجية (من الخطوة 2.1) دون اضطراب لوحة agarose.
    5. قم بتغطية قطرة الدودة بالشريحة الزجاجية التي تحتوي على لوحة الآغاروز. تأكد من أن لوحة الآغاروز تواجه نحو الديدان. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا إضافة قطرات الشيخوخة تخدير على لوحة agarose والديدان يمكن تغطيتها مع coverslip.
    6. وأخيرا، ضع علامة على موقع الديدان باستخدام علامة دائمة على الشريحة الزجاجية.

3. الحصول على الصورة وتحليلها

  1. الحصول على الصور باستخدام نظام المجهر SRS.
    1. قبل تصوير أي عينة، حدد معلمات التصوير وتحقق من إشارات SRS (كما هو موضح في البروتوكول 1).
    2. جبل الشريحة مع coverlip التي تواجه عدسة الهدف. بدوره على مصدر الضوء حقل مشرق وتوجيهه إلى العدسة لتحديد موقع الديدان.
      ملاحظة: استخدم عدسة 20x الهدف لتصوير تخزين الدهون في الأمعاء الكاملة. النظر في استخدام عدسة الهدف 60x لتصوير تخزين الدهون تحت الجلد أو لتحديد حجم قطرة الدهون / عدد.
    3. جلب الديدان في التركيز وضبط موقف المكثف وفقا لذلك.
    4. قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء الحقل الساطع والتبديل إلى وحدة المسح بالليزر. ابدأ بمسح الدودة الأولى بمعدل مسح سريع (على سبيل المثال، 512 × 512 بكسل)، وضبط التركيز الدقيق للعثور على منطقة الاهتمام. لكي يتم تصوير العينة الأولى، قم بضبط قوى الليزر إلى المستوى الذي لا تشبع فيه إشارات SRS.
    5. قم بالتبديل إلى معدل مسح أبطأ (على سبيل المثال، 2 ميكروس/بكسل) ودقة أعلى (على سبيل المثال، 1024 × 1024 بكسل) للحصول على صورة SRS.
      ملاحظة: حافظ على ثبات قوى الليزر لكل عينة يتم تصويرها أثناء جلسة التصوير.
    6. حفظ الصورة SRS بالتنسيق المطلوب الذي يتيح دقة عالية (مثل ملف .tiff). اعتمادا على برنامج التصوير والإعداد المستخدم، قم بحفظ موقع الدودة الأولى قبل الانتقال إلى الفيروس التالي.
    7. التصوير الكامل لجميع الديدان التي شنت على الشريحة. إيقاف تشغيل مصراع الكاميرا لمنع أشعة الليزر. لا تقم بإيقاف تشغيل مصدر الليزر حتى يتم تصوير كافة العينات.
    8. قم بإزالة الشريحة قبل وضع الشريحة عينة التالي. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.7.
    9. وبمجرد تصوير جميع العينات، ضع مصدر الليزر على أهبة الاستعداد وأطفئ المعدات المرتبطة بها بما في ذلك مكبر الصوت والكاشف والمجهر والكمبيوتر.
  2. تحليل الصور باستخدام ImageJ
    1. افتح ملفات الصور (عادة .tiff) ليتم تحديدها كميا في ImageJ، عن طريق تحديد الملفات وسحبها وإسقاطها إلى نافذة ImageJ. قم بتنزيل المكونات الإضافية المناسبة ل ImageJ، إذا كنت تستخدم تنسيقات مجهر أوليمبوس محددة (مثل ملفات .oib).
    2. حدد الخصائص التي سيتم تحليلها(تحليل > تعيين القياسات). بالنسبة إلى إجمالي كمية تخزين الدهون، حدد المنطقة، والقيمة الرمادية الحد الأدنى وأقصى، ومتوسط القيمة الرمادية.
    3. استخدام أداة اختيار المضلع وتحديد المنطقة من الأمعاء دودة ليتم قياسها كميا. لقياس المعلمات المحددة في الخطوة 3.2.2، انقر على تحليل > قياس. ستظهر نافذة جديدة مع نتائج القياس. كرر هذه الخطوة لجميع الصور المفتوحة.
    4. حدد القياسات لكافة الديدان في نمط جيني معين ونسخ/ لصق النتائج إلى جدول بيانات جديد. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.4 لجميع الأنماط الجينية في نفس جلسة التصوير.
    5. حدد منطقة في المنطقة المجاورة للدودة التي لا تحتوي على أي إشارة SRS، لتحديد كميا كخلفية. تأكد من أن المنطقة المختارة لقياس الخلفية لا تحتوي على أي بكتيريا أو حطام يمكن أن يعطي أيضا إشارة SRS.
    6. طرح قيمة متوسط الخلفية الرمادية من قياسات كل دودة فردية. حساب متوسط الانحراف المعياري للخلفية مطروحا متوسط القيم الرمادية من كافة worms في مجموعة جينية/اختبار معينة. تطبيع هذه القيمة إلى متوسط مجموعة التحكم.
    7. وأخيرا، قم بإجراء التحليل الإحصائي المناسب باستخدام متوسط القيمة الرمادية كمقياس لمستويات الدهون في كل دودة. بشكل عام، استخدم الطالب t-testلمجموعتين واستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنة متعددة مناسبة لأكثر من مجموعتين.
      ملاحظة: عند تحديد الصور لعرض الشكل، تأكد من أن هذه الصور المحددة لها نفس توزيع كثافة البكسل. تعيين السطوع والتباين إلى نفس القيم لجميع الصور في نفس الشكل (صورة > ضبط > والسطوع والتباين).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إشارات الأنسولين هو مسار الغدد الصماء الهامة التي تؤثر على التنمية, التكاثر, عمر, والتمثيل الغذائي. في الديدان، وإشارة الأنسولين يتكون من حوالي 40 الأنسولين مثل الببتيد ليغاندس، مثل الأنسولين مستقبلات عامل النمو ortholog DAF-2، المصب PI3K/AKT كيناز تتالي، وFoxO عامل النسخ ortholog، DAF-1620. داف-2 المسوخ، التي تفتقر إلى مستقبلات الأنسولين، لديها المزيد من قطرات الدهون في أمعائهم، وأنسجة تخزين الدهون دودة21،22. باستخدام المجهر SRS،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الدفاع ضد السمنة والاضطرابات الأيضية المرتبطة بها، تم تنفيذ جهود بحثية هامة لفهم أفضل للآليات التنظيمية للداء المنزلي الدهني. للكشف الكمي لجزيئات الدهون في العينات البيولوجية، ثبت أن التصوير الخالي من الملصقات بواسطة المجهر SRS هو بديل موثوق به للمقاايسات الكيميائية الحيوية وغيرها من طرق التلطيخ. كشفت مجموعتنا وغيرها آليات بيولوجية جديدة في تنظيم التمثيل الغذائي الدهون من خلال الجمع بين استخدام C. elegans وSRS المجهر12،18،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01AG045183 (M.C.W.) وR01AT009050 (M.C.W.) وR01AG062257 (M.C.W. (1) DP1DK13644 (M.C.W.)، وآذار/مارس لمؤسسة دايمز (M.C.W.)، ومؤسسة ويلش (M.C.W.)، ومحقق HHMI (M.C.W.). نشكر مركز علم الوراثة في كاينورهابديتس (CGC) على سلالات سي إليغانس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محول A / Dوحدة أوليمبوسالتناظرية
AgaroseGeneMate3119لصنع منصات الاغاروز
أداة المحاذاة - محولThorlabsSM1A4لتركيب الأداة على أداة
المحاذاة النطاق - الهدفThorlabsVRC2SM1لعرض أداة محاذاة ليزر الأشعة تحت الحمراء
- يمكن لأنبوبThorlabsSM1L40الطول متغير
Autocorrelator (اختياري)نبضAPEتحقق
من الدوائر الصغيرةلمرشح ممر النطاقBBP-21.4+ إذا تم تعديلها عند 20 ميجا هرتز أو KR Electronics 2724 إذا تم تعديلها عند 8 ميجاهرتزللإشارة مع تصفية تردد التعديل
كابلات
مجهر تشريحنيكونSMZ800للتعامل مع الديدان وانتقائها للتصوير
DodecaneSigma-Aldrich44010تستخدم لمعايرة مرشح إشارة SRS
تقنية ChromaTechnology 890/220 CARSلإزالة شعاع Stokes
وضع العلامات المختبرية للأغراض العامةVWR89097لصنع وسادات agarose
أغطية زجاجيةVWR48393-106لتغطية الديدان للتصوير
شريحة المجهرالزجاجي VWR16004-422لصنع وسادات الاغاروز
مجهر المسح بالليزرOlympusFV3000
LensThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		لموسع الشعاع
مكبر للصوتقفل زيورخHF2LI
دوائر صغيرةلمرشح التمرير المنخفضBLP-1.9 +لمرايا
قمع ضوضاء إمدادات الطاقةThorlabsBB1-E03للترحيل والمنظار
ObjectiveOlympusUPlanSAPO 20x 0.75 ، UPlanSAPO 60XW 1.20
الصمام الثنائي الضوئيThorlabsFDS1010
مصدر ليزر PicosecondAPEpicoEmerald
Powerالطاقة TEKPOWERTP1342Uللصمام الثنائي الضوئي ، عكس الجهد 50 فولت
أزيد الصوديومسيجماS2002لتخدير الديدان
منتقي الدودةWormStuff59-AWP
BNC شريط مزود

المراجع

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31(2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865(2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450(2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930(2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SRS Daf 16 SRS

مقالات ذات صلة