مقالة منهجية

إجراءات زرع نخاع العظم في الفئران لدراسة الهيماتوبويز الكلونية

DOI:

10.3791/61875

⸱

مايو 26, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف ثلاث طرق لزرع نخاع العظم (BMT): BMT مع تشعيع الجسم الكلي ، BMT مع التشعيع المحمية ، وطريقة BMT مع عدم وجود تكييف مسبق (BMT بالتبني) لدراسة التجويف الدموي الكلو في نماذج الماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الورم الدموي المكلور هو حالة سائدة مرتبطة بالعمر تنتج عن تراكم الطفرات الجسدية في الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs). الطفرات في جينات السائق، التي تمنح اللياقة الخلوية، يمكن أن تؤدي إلى تطوير استنساخ HSPC الآخذة في التوسع التي تؤدي بشكل متزايد إلى الكريات البيض ذرية تؤوي الطفرة الجسدية. ولأن الهيماتوبويزات الكلونية ارتبطت بأمراض القلب والسكتة الدماغية والوفيات، فإن تطوير أنظمة تجريبية تقوم بنمذجة هذه العمليات هو المفتاح لفهم الآليات التي تؤدي إلى الحد من عامل الخطر الجديد هذا. عادة ما تستخدم إجراءات زرع نخاع العظم التي تنطوي على تكييف النقوي في الفئران ، مثل تشعيع الجسم الكلي (TBI) ، لدراسة دور الخلايا المناعية في أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا مفر من الضرر المتزامن لمتخصصة نخاع العظم وغيرها من المواقع ذات الاهتمام ، مثل القلب والدماغ ، مع هذه الإجراءات. وهكذا، طور مختبرنا طريقتين بديلتين لتقليل أو تجنب الآثار الجانبية المحتملة الناجمة عن TBI: 1) زرع نخاع العظم مع التدريع التشعيع و 2) BMT بالتبني للفئران غير مشروطة. في الأعضاء المحمية ، يتم الحفاظ على البيئة المحلية مما يسمح بتحليل الهيماتوبويز الكلومي في حين أن وظيفة الخلايا المناعية المقيمة غير مضطربة. في المقابل ، فإن BMT بالتبني للفئران غير المكيفة له ميزة إضافية تتمثل في الحفاظ على كل من البيئات المحلية للأعضاء ومكانة الهيماتوبوتي. هنا، نقارن ثلاثة نهج مختلفة لإعادة تشكيل الخلايا الدموية ونناقش نقاط قوتها وحدودها لدراسات الهيماتوبويزات الكلوية في أمراض القلب والأوعية الدموية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهيماتوبويز الكلوي (CH) هو شرط الذي لوحظ في كثير من الأحيان في الأفراد المسنين ويحدث نتيجة لتوسيع الجذعية الدموية وخلية السلف (HSPC) استنساخ تحمل طفرة جينية1. وقد اقترح أنه بحلول سن 50, معظم الأفراد سوف تكون قد اكتسبت في المتوسط خمس طفرات إكسونية في كل HSPC2, ولكن معظم هذه الطفرات سوف يؤدي إلى عواقب ضئيلة أو معدومة phenotypic للفرد. ومع ذلك ، إذا كانت إحدى هذه الطفرات تمنح عن طريق الصدفة ميزة تنافسية ل HSPC - مثل تعزيز انتشارها أو تجديدها الذاتي أو بقائها أو مزيجا من هذه - فقد يؤدي ذلك إلى التوسع التفضيلي للاستنساخ المتحول بالنسبة إلى مركبات الكربون الهيدروفلورية الأخرى. ونتيجة لذلك، فإن الطفرة ستنتشر بشكل متزايد من خلال نظام الهيماتوبوتيستيك حيث يؤدي HSPC المتحول إلى خلايا دم ناضجة، مما يؤدي إلى مجموعة متميزة من الخلايا المتحولة داخل الدم المحيطي. في حين ارتبطت الطفرات في العشرات من الجينات سائق مرشح مختلفة مع الأحداث التخفي داخل نظام الهيماتوبويات، من بين هذه، والطفرات في ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي 3 ألفا(DNMT3A)وعشرة أحد عشر نقل 2 (TET2) هي الأكثر انتشارا3. وقد وجدت العديد من الدراسات الوبائية أن الأفراد الذين يحملون هذه الطفرات الوراثية لديهم خطر أعلى بكثير من أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD), السكتة الدماغية, والوفيات سببية جميع3,4,5,6,7. في حين أن هذه الدراسات قد حددت أن هناك علاقة بين CH وزيادة الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية والسكتة الدماغية، ونحن لا نعرف ما إذا كانت هذه العلاقة سببية أو ظاهرة مشتركة مع عملية الشيخوخة. للحصول على فهم أفضل لهذا الارتباط ، مطلوب نماذج حيوانية مناسبة تلخص بشكل صحيح الحالة البشرية ل CH.

وقد تم إنشاء العديد من نماذج الحيوانات CH من قبل مجموعتنا وغيرها باستخدام حمار وحشي، والفئران، والرئيسيات غير البشرية8،9،10،11،12،13،14. وغالبا ما تستخدم هذه النماذج أساليب إعادة تشكيل الدم عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، وأحيانا باستخدام إعادة دمج Cre-lox أو نظام CRISPR. يسمح هذا النهج بتحليل طفرة جينية محددة في الخلايا الدموية لتقييم كيفية مساهمتها في تطور المرض. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النماذج غالبا ما تستخدم خلايا con أو مراسل للتمييز بين آثار الخلايا المتحولة من الخلايا العادية أو البرية. في كثير من الحالات، مطلوب نظام ما قبل تكييف لإغراق الخلايا الجذعية الدموية المانحة بنجاح.

حاليا، زرع نخاع العظم إلى الفئران المتلقية يمكن تقسيمها إلى فئتين رئيسيتين: 1) تكييف النقوي و 2) زرع غير مشروطة. يمكن تحقيق تكييف النقوي بإحدى طريقتين، وهما التشعيع الكلي للجسم (TBI) أو العلاج الكيميائي15. يتم تنفيذ TBI عن طريق إخضاع المتلقي لجرعة قاتلة من أشعة غاما أو الأشعة السينية ، وتوليد فواصل الحمض النووي أو الروابط المتقاطعة داخل الخلايا المقسمة بسرعة ، مما يجعلها لا يمكن إصلاحها16. Busulfan وسيكلوفوسفاميد هما أدوية العلاج الكيميائي شائعة الاستخدام التي تعطل مكانة الهيماتوبويات وبالمثل تسبب تلف الحمض النووي للخلايا الانقسام بسرعة. والنتيجة الصافية للشرط المسبق النقوي هي موت الخلايا الدموية، الذي يدمر نظام الهيماتوبويتيك لدى المتلقي. هذه الاستراتيجية لا تسمح فقط لengraftment ناجحة من HSPCs المانحة، ولكن يمكن أيضا منع رفض الكسب غير المشروع عن طريق قمع الجهاز المناعي المتلقي. ومع ذلك ، فإن الشروط المسبقة النقوي لها آثار جانبية شديدة مثل تلف الأنسجة والأعضاء وخلاياها المناعية المقيمة بالإضافة إلى تدمير مكانة نخاع العظمالأصلية 17. ولذلك، اقترحت أساليب بديلة للتغلب على هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، ولا سيما فيما يتعلق بالضرر الذي يلحق بالأجهزة ذات الاهتمام. وتشمل هذه الأساليب التشعيع المحمية من الفئران المتلقية وBMT بالتبني للفئران غيرمشروطة 9،17. حماية الصدر، تجويف البطن، الرأس أو المناطق الأخرى من التشعيع عن طريق وضع حواجز الرصاص يحافظ على الأنسجة ذات الأهمية المحمية من الآثار الضارة للإشعاع ويحافظ على سكان الخلايا المناعية المقيمين. من ناحية أخرى ، فإن BMT بالتبني من HSPCs للفئران غير المكيفة له ميزة إضافية لأنه يحافظ على مكانة الهيماتوبوتية الأصلية. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف بروتوكولات ونتائج زراعة الخلايا الهيدروجرافية بعد عدة نظم زرع في الفئران، وتحديدا تسليم HSPC إلى فئران TBI، إلى الفئران المحمية جزئيا من الإشعاع، وإلى الفئران غير المكيفة. الهدف العام هو مساعدة الباحثين على فهم الآثار الفسيولوجية المختلفة لكل طريقة وكذلك كيفية تأثيرها على النتائج التجريبية في وضع CH وأمراض القلب والأوعية الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فرجينيا على جميع الإجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات.

1. قبل الشروط المسبقة

  1. ضع الفئران المتلقية على الماء المكمل بالمضادات الحيوية (5 mM sulfamethoxazole، 0.86 m m trimethoprim) ~ 24 ساعة قبل التشعيع. وهذا ضروري لمنع العدوى، حيث سيتم قمع الجهاز المناعي بعد التشعيع، والحفاظ عليه لمدة أسبوعين بعد التشعيع. عند هذه النقطة، تكملة الفئران مع هلام التغذية / الترطيب لتشجيع التغذية ومنع فقدان الوزن والجفاف بعد التشعيع.

figure-protocol-1
الشكل 1: صور تظهر مختلف الاجهزة المسبقة. (أ)إعداد تشعيع الجسم الكلي قفص دائري باستخدام أشعة غاما (سيزيوم-137): شعاع الإشعاع يأتي من الجزء الخلفي من المشعع في اتجاه المحور ص (الإشعاع الأفقي). (ب) إعداد تشعيع الجسم الإجمالي قفص الماوس باستخدام الأشعة السينية: يتم وضع قفص الماوس في غرفة عاكسة. يأتي شعاع الإشعاع من أعلى المشعع على شكل مخروط (إشعاع عمودي). المسافة من مصدر الإشعاع إلى القفص هي 530 مم(C)صينية قابلة للتعديل في الأشعة السينية المشععة: يتم استخدام هذا الإعداد للتشعيع محمية جزئيا باستخدام الأشعة السينية. يأتي شعاع الإشعاع من أعلى المشعع على شكل مخروط (إشعاع عمودي). المسافة من مصدر الإشعاع إلى الدرج هي 373 مم، ونصف قطرها 250 مم(D) درع الصدر: يتم وضع الفئران المخدرة على صينية. يتم وضع الفئران مقلوبة على بعضها البعض في مواقف supine مع الذراعين والساقين ممتدة بالكامل. يتم محاذاة الطرف السفلي من الدرع الرصاص مع عظم xiphisternum والطرف العلوي مع الغدة الصعترية. (E) التدريع البطني: يتم وضع الفئران المخدرة كما هو الحال في إعداد درع الصدر مع الطرف السفلي من الدرع الرصاصي المنحاز إلى فتحة شج والطرف العلوي أسفل الحجاب الحاجز. (F)إعداد التشعيع التدريع الرأس باستخدام أشعة غاما (سيزيوم-137): يتم تسجيل نبوات الماوس تخدير أسفل ويتم وضع الماوس في مقيد مخروطي. يغطي الدرع الرصاص الأسود (ملحوظ) رأس الفأر وأذنيه. يأتي شعاع الإشعاع من الجزء الخلفي من المشعع في اتجاه المحور Y (الإشعاع الأفقي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الشروط المسبقة للفئران المتلقية (اختياري)

  1. إشعاع الجسم الكلي
    1. ضع الفئران المتلقية في قفص دائري مقطع بشكل موحد ، أو قفص فأر في الغرفة العاكسة داخل نصف القطر المحسوب لتلقي نفس جرعة الإشعاع ؛ ومع ذلك، ينصح بحد أقصى 8 فئران لكل قفص دائري و5 فئران لكل قفص فأر لضمان التشعيع الموحد(الشكل 1A، B).
    2. لتحقيق النقوي الكامل، تأكد من أن الفئران المتلقية تتلقى جرعة إشعاعية إجمالية قدرها 11 غراي في جزئين 5.5 Gy مفصولين بفاصل زمني من 4 إلى 24 ساعة.
      ملاحظة: بينما يمكن الحصول على engraftment الأمثل عن طريق تنفيذ فاصل زمني 4 ساعة بين الكسور، وهذا يمكن أن تمتد إلى فاصل زمني 24 ساعة، والتي يمكن أن تكون مفيدة عندما العمل و / أو المشعع غير متوفر.
  2. إشعاع محمي جزئيا
    1. تخدير الفئران المتلقية عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (80-100 ملغ / كغ) وزين (5-10 ملغ / كغ). ضبط النفس من حركة الماوس أمر بالغ الأهمية لضمان التشعيع موحدة وحماية فعالة لأجهزة الاستهداف أثناء عملية التدريع.
    2. للصدر والبطن التدريع، وتوجيه شعاع الإشعاع من الأشعة السينية المشعع عموديا إلى الماوس(الشكل 1C).
      1. ضع الفئران المخدرة على لوحة مسطحة ، مركزة مصدر الإشعاع من الأعلى. وضع الفئران مقلوب لبعضها البعض في موقف supine مع الذراعين والساقين تمديد كامل(الشكل 1D، E).
        ملاحظة: يسمح مرفق الأشعة السينية، لهذه التجربة، بوضع فأرين في كل مرة داخل دائرة نصف قطرها الفعالة التي تسمح بالإشعاع الموحد. في حين يتم حساب نصف قطرها الفعال على أساس المسافة بين مصدر الإشعاع والصوانية ، فإن عدد الحيوانات التي يمكن تشعيعها في وقت واحد سيعتمد على المشعع المحدد.
      2. ربط الكفوف من الفئران على لوحة باستخدام الشريط لضمان الفئران هي شل حركتها أثناء إجراء التشعيع. وضع الرصاص التدريع بحيث يغطي المناطق التي تتطلب الحماية.
      3. لحماية الصدر، قم بإعداد الدرع الرصاصي عن طريق قياس الطول من عظمة الماوس xiphisternum إلى الغدة الصعترية وحساب السماكة التي ستوفر حماية كافية من مصدر الإشعاع. ضع الرصاص التدريع بحيث الطرف السفلي محاذاة مع عظم xiphisternum. سوف الطرف العلوي من حاجز الرصاص تناسب بالقرب من الغدة الصعترية (الشكل 1D).
      4. للتدريع البطن، وإعداد الدرع الرصاص عن طريق قياس طول من فتحة العين الماوس إلى الحجاب الحاجز وحساب سمك من شأنها أن توفر حماية كافية من مصدر الإشعاع. ضع الرصاص التدريع بحيث الطرف السفلي محاذاة مع فتحة فتحة العين. الطرف العلوي من الدرع الرصاص سوف يصلح تحت الحجاب الحاجز (الشكل 1E).
        ملاحظة: قد يؤدي توطين درع الرصاص ليكون متسقا بين الأفواج إلى تقليل بعض التباين فيما يتعلق بحجم الفئران.
    3. لدرع الرأس، توجيه شعاع الإشعاع من المشعع السيزيوم أفقيا إلى الماوس.
      1. الشريط بعناية النبوات من الماوس تخدير إلى البطن. وهذا يضمن أن تحصل الأسلحة على جرعة كاملة من الإشعاع ولا يغطيها الدرع.
      2. لدرع الرأس، ضع الماوس في مقيد مخروطي، والذي يناسب داخل درع الرصاص. مرة واحدة في الماوس داخل المقيد مخروطية، الشريحة المقيد في فتحة داخل الدرع الرصاص(الشكل 1F). يجب أن يغطي الدرع الرصاصي رأس الفأر وأذنيه بالكامل (~ 3.2 سم) ، تاركا بقية جسم الماوس مكشوفا للإشعاع. يمكن ضبط وضع المقيد داخل الدرع ليناسب الحيوانات المختلفة الحجم عن طريق انزلاقه داخل أو خارج الدرع.
      3. ضع الفئران داخل المشعع ، عموديا على مصدر التشعيع.
    4. تعريض الفئران لاثنين من 5.5 جي أجزاء من الإشعاع (الجرعة الإجمالية من 11 غراي) مفصولة بفاصل زمني 4-24 ساعة.
    5. بعد كل كسر تشعيع، ضع الأقفاص مع الفئران المخدرة على الحصير الساخن أو تحت مصابيح الحرارة الحمراء لمنع انخفاض حرارة الجسم والمساعدة في التعافي من التخدير.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر لعدم ارتفاع درجة حرارة الماوس المخدر عند استخدام مصباح لأنها لا يمكن الهروب من الحرارة. وكما هو موضح أعلاه، يمكن أن يختلف تحديد مواقع الحيوانات وسماكة الدرع الرصاصي بين الدراسات القائمة على السمات المحددة للمشع (نوع/اتجاه الإشعاع للشعاع، وما إلى ذلك). وسيحتاج الباحثون إلى تعديل تجاربهم وفقا لذلك.

3. عزل العظام

ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن تكون الفئران المانحة والفئران المتلقية متشابهة في العمر، وفي غضون 8-12 أسبوعا. ويفضل استخدام ما لا يقل عن 3 فئران كمتبرعين (بدلا من متبرع واحد) لتقليل التغايرية (حتى عند استخدام الفئران ذات النمط الجيني نفسه). يمكن الحصول على ما يقرب من 40 مليون خلية نخاع عظمي غير مكسورة من ستة عظام (عظما الفخذ وعظما الساق واثنين من العضد) من فأر واحد. زرع 5 ملايين من خلايا نخاع العظم لكل فأر المتلقي عادة ضمان engraftment.

  1. قتل الفئران المانحة عن طريق خلع عنق الرحم دون تخدير (الطريقة المفضلة لتجنب التلوث الكيميائي للخلايا) ووضع كل فأر على لوحة ماصة.
  2. تطهير الجلد باستخدام رذاذ الإيثانول 70٪.
  3. جعل قطع عرضية صغيرة في الجلد تحت القفص الصدري وعقد الجلد بإحكام على جانبي الشق، المسيل للدموع في اتجاهين متعاكسين نحو الرأس والقدمين. قشر الجلد من جميع الأطراف.
  4. قطع على الكتفين ومفاصل الكوع، وإزالة العضلات المرفقة والأنسجة الضامة بمساعدة كيمويب للحصول على humeri.
  5. قم بخلع مفصل الورك بعناية بين عظم الفخذ وعظام الورك. استخدام مقص حاد لقطع على طول رأس عظم الفخذ وفصل الساقين. قطع على مفصل الركبة لفصل عظم الفخذ والساق، وإزالة بعناية العضلات المرفقة والأنسجة الضامة بمساعدة كيمويب لحصاد عظم الفخذ والساق.
    ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على البشرة العظام سليمة خلال هذه الخطوة. تجاهل أي كسور العظام بسبب فقدان العقم. يمكن جمع عظام الورك وعظام العمود الفقري بالإضافة إلى عظم الفخذ والساق وعظم العضد. لجمع عظام العمود الفقري، يمكن استخدام هاون والحشرات لسحق العظام إلى قطع وحصاد خلايا نخاع العظام.
  6. وضع العظام المعزولة من الفئران من نفس النمط الجيني في أنبوب مخروطي 50 مل المقابلة التي تحتوي على 20 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني معقمة، ويبقيه على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. إيلاء اهتمام خاص لوضع العظام بشكل صحيح في أنابيب مع الأنماط الجينية المتطابقة.
  7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل المانحة تغيير قفازات بين كل فأر. أيضا، مقص نظيفة وغيرها من الصكوك مع الإيثانول 70٪ بين كل فأر.

4. عزل خلايا نخاع العظم

ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في خزانة فئة السلامة الحيوية II.

  1. إعداد مجموعات الأنبوب: قم بعمل ثقب صغير في الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 0.5 مل باستخدام إبرة 18 G ووضعه في أنبوب طرد دقيق معقم سعة 1.5 مل ، والذي يحتوي على 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم بارد الجليد في الأسفل.
    ملاحظة: بما أن ستة عظام فقط يمكن أن تندرج في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل، فمن المستحسن إعداد مجموعات أنبوب كافية لمعالجة جميع العظام في نفس الوقت.
  2. يستنشق برنامج تلفزيوني ونقل العظام المعزولة على طبق زراعة الخلايا 100 ملم معقمة. عقد كل العظام باستخدام ملقط ناعم، وقطع بعناية epiphyses قبالة كل نهاية باستخدام مقص الصغيرة التي تم تعقيمها في الأوتوكلاف. ضع العظام المقطوعة في مجموعات الأنبوب المعدة.
  3. طاردة مركزية الأنابيب في 10،000 س ز ل 35 s في 4 °C.
  4. بعد الطرد المركزي، تأكد من أن نخاع العظم قد تمت إزالته بنجاح من العظام. يجب أن تظهر العظام بيضاء وشفافة مع بيليه أحمر كبير نسبيا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. تجاهل أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل.
    ملاحظة: إذا فشل الفحص البصري في الكشف عن نخاع العظم في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل، اقطع العظم مرة أخرى وكرر الخطوة 4.3.
  5. Resuspend نخاع العظم في 1 مل من الجليد البارد برنامج تلفزيوني، ثم نقل تعليق الخلية من نفس النمط الجيني إلى أنبوب مخروطي مطابقة 50 مل.
  6. فصل الخلايا عن طريق تمريرها من خلال إبرة 18 G مع حقنة 10 مل 10 مرات.
  7. تصفية تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. إضافة إضافية الجليد الباردة PBS إلى حجم النهائي من 10 مل، وإعادة إنفاق الخلايا من خلال الاستخدام اللطيف للموازة المعونة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 310 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. أسبيرات supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 10 مل من وسائل الإعلام RPMI خالية من المصل. الغيار 30 ميكرولتر من هذه المواد لعد الخلية.
  10. تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية، وحساب حجم تعليق الخلية المطلوبة لزرع. على سبيل المثال من BMT 100٪، 5 × 106 خلايا نخاع العظام مطلوبة لكل ماوس المتلقي.
    ملاحظة: للحصول على BMT تنافسية، وإعداد ما مجموعه 5 × 106 خلايا نخاع العظام التي تتألف من خليط من الخلايا المانحة (على سبيل المثال، CD45.2+) والخلايا المنافسة (على سبيل المثال، CD45.1+). ينصح بشدة بإعداد خلايا نخاع العظم الإضافية. على سبيل المثال، إذا كان هناك 10 فئران متلقية لكل مجموعة تجريبية، فإننا عادة ما نعد خلايا كافية ل 12 فأرا متلقيا.
  11. نقل الحجم المحسوب لتعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 310 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق الخلايا باستخدام المبلغ المحسوب من المتوسط RPMI خالية من المصل لتحقيق كثافة الخلية المناسبة وحجم. عادة، 200 ميكرولتر هو الحجم الأمثل للحقن المداري الرجعية.

5. زرع خلايا نخاع العظم للفئران المشععة

  1. تخدير الفئران المتلقية مع 5٪ isoflurane.
  2. في حين يتم تخدير الفئران، حقن ببطء 200 ميكروغرام من خلايا نخاع العظام في الوريد المداري الرجعية باستخدام إبرة 28-30 G مع حقنة الأنسولين.
    1. بدلا من ذلك، تنفيذ تسليم الخلايا المانحة عن طريق الحقن الوريد الوريدي الوريد الذيل وحقن الفخذ داخل الدم، مع الحد الأقصى لحجم 0.2 مل و 25 ميكرولتر، على التوالي.
  3. بمجرد حقن الخلايا ، ضع قطرة من قطرات العين المحتوية على البروباراكايين على سطح العين لتخفيف الألم. ويمكن بعد ذلك السماح للحيوان باستعادة وعيه.

6. زرع خلايا نخاع العظم للفئران غير مشروطة

  1. تخدير الفئران المتلقية عن طريق استنشاق 5٪ isoflurane.
  2. حقن 5 × 106 خلايا نخاع العظام غير المفرغة من أي من النمط الجيني الرجعية المداري في الفئران المتلقية غير المشععة مع حقنة الأنسولين 28-30 G.
  3. كرر الخطوتين 6.1 و 6.2 على مدى 3 أيام متتالية، بحيث يتم زرع الفئران المتلقية مع ما مجموعه 1.5 × 107 خلايا نخاع العظم.
    ملاحظة: لأن BMT بالتبني دون إجراء ما قبل تكييف يتطلب زرع نخاع العظم لمدة 3 أيام متتالية، ينبغي للمرء أن يحاول عيون بديلة لكل حقنة.
  4. بعد الحقن، وإدارة قطرة من قطرات العين التي تحتوي على البروباراكايين إلى العين المصابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لمقارنة تأثير ثلاث طرق BMT /ما قبل التكييف على زراعة الخلايا المانحة ، تم تحليل كسور الخلايا المانحة في الدم المحيطي وأنسجة القلب عن طريق قياس التدفق الخلوي في 1 شهر بعد BMT. كانت الخلايا المعزولة ملطخة بعلامات الكريات البيض المحددة لتحديد المجموعات الفرعية المختلفة من الكريات البيض. في هذه التجارب، تم تسليم خلايا نخاع العظم من النوع البري C57BL/6 (CD45.2) إلى WT B6. SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) الفئران المتلقية لتمييز الخلايا المانحة من خلايا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسات الهيماتوبويز الكلوة، وصفنا ثلاث طرق لBMT: BMT مع تشعيع الجسم الكلي، BMT مع التشعيع مع التدريع الجزئي، وطريقة BMT أقل استخداما التي لا تنطوي على تكييف مسبق (BMT بالتبني). وقد استخدمت هذه الأساليب لتقييم تأثير الهيماتوبويزات اللاستنساخية على أمراض القلب والأوعية الدموية. يمكن للباحثين تعديل هذه الطرق وفقا لذلك لتناسب الغرض المحدد من دراستهم.

نماذج كلونال للدم
الهيماتوبويز الكلوي هو الظاهرة التي تتنافس فيها الخلايا الدموية المتحولة مع الخلايا البرية والحصول على هيمنة ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة المنح إلى ك. والش (HL131006، HL138014، وHL132564)، إلى سانو (HL152174)، منحة جمعية القلب الأمريكية إلى م. أ. إيفانز (20POST35210098)، ومنحة مؤسسة القلب اليابانية إلى H. Ogawa.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مل جهاز طرد مركزي دقيقفيشر ساينتفيك05-408-121توريد عام
1.5 مل جهاز طرد مركزي دقيقفيشر ساينتفيك05-408-129توريد عام
1/2 سم مكعب حقنة الأنسولين LO-DOSEEXELINT26028الإمداد العام
الإيثانول المطلق (200 prfof)فيشر كيماويكال200559العرض العام
دينار بحريني 1 مل درن. محاقن 25G 5/8 بوصة إبرةBecton Dickinson309626الإمداد العام
BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)Becton Dickinson395195الإمداد العام
Cesium-137 IrradiatorJ. L. Shepherd & nbsp;معداتMark IV
DietGel 76AClear H2O70-01-5022الإمداد العام
Falcon 100 مم طبق ثقافة الخلايا المعالج TCعلوم الحياة353003الإمداد العام
Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر Scientific352098الإمداد العام
مصافي الخلايا المعقمة Fisherbrand ، 70 & mu ؛ مفيشر 22363548 العلميالعرض العام
Graefe ملقطأدوات العلوم الدقيقة11051-10الإمداد العام
مقص ناعم مقوىأدوات العلوم الدقيقة14090-09التوريد العام
محلول Isothesia (Isoflurane)Henry Schein29404محلول
الكيتامينZoetis043-304حقن
Kimwipes ماسحات المهام الحساسةKimtech ScienceKCC34155الإمداد العام
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023
Solution RadDisk & ndash ؛ قرص القوارض المشععBraintree ScientificIRD-P Mالعرض العام
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Medium Sulfamethoxazole و TrimethoprimTEVA0703-9526-01حقن
XylazineAkorn139-236حقن
الأشعة السينيةRadمعداتRS-2000
IRD-P مصدر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tet2

مقالات ذات صلة