Method Article

البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية

DOI:

10.3791/61885

⸱

October 20th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Applied Biosciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وdybrat ثيرامبيا المحلية هي الأنواع غير المنيع ، الجناح الذي هو مناسبة لدراسة آليات النمو للحشرات التي أدت إلى إشعاعها التطوري الناجح على الأرض. إن تطبيق الأدوات الوراثية مثل تحرير الجينوم هو المفتاح لفهم التغيرات الوراثية المسؤولة عن التحولات التطورية في نهج إيفو ديفو. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكول الحالي لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة من T. المحلية. نحن نبلغ عن طريقة الحقن الجاف ، كبديل لطريقة الحقن الرطب المبلغ عنها ، التي تسمح لنا بالحصول على معدلات بقاء عالية بشكل ثابت في الأجنة المحقونة. كما أننا نبلغ عن بيئة مثالية لتزاوج البالغين والحصول على الأجيال اللاحقة بكفاءة عالية. وتؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة لكل نوع في الاعتبار للتطبيق الناجح لطرق تحرير الجينوم على الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية. ونتنبأ بأن بروتوكولات تحرير الجينوم هذه ستساعد في تنفيذ T. domestica كنموذج مختبري وعلى زيادة تسريع تطوير وتطبيق أدوات جينية مفيدة في هذا النوع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينتمي ثيرامبيا المحلية إلى واحدة من أكثر أوامر الحشرات القاعدية ، Zygentoma ، التي تحتفظ بدورة حياة غير اثيرية وغير جناحية. هذه الحالة الفينوغرافية القاعدية وخصائص الأجداد هذه الأنواع هي نموذج جذاب لدراسة الآليات الكامنة في نجاح الحشرات على الأرض، والتي تغطي أكثر من 70٪ من الأنواع الحيوانية الموصوفة1. T. المحلية منذ فترة طويلة تستخدم أساسا لدراسة خصائص الأجداد من علم وظائف الأعضاء الحشرية بسبب ميزات مناسبة كنموذج مختبري، مثل دورة حياة قصيرة نسبيا (2.5-3.0 أشهر من الجنين إلى البالغين الإنجابية؛ الشكل 1أ) وتربية سهلة. في العقود الثلاثة الماضية، تم توسيع استخدامه للتحقيق في خصائص الأجداد من مختلف الصفات مثل خطة الجسم، والتمايز العصبي، والإيقاعات circadian2،3،4.

ويمكن أن يؤدي تطبيق الأدوات الجينية المتقدمة في مجال ت. محلي() إلى زيادة التعجيل بهذه المساهمات في مجال بحثي واسع. تم الإبلاغ عن التدخل الناجح للرنا (RNAi) -بوساطة الجينات في الأجنة والحوريات والبالغين في T. المحلية4,5,6. لا تزال كفاءة RNAi النظامية تعتمد على الأنواع بشكل كبير - على سبيل المثال ، فهي عالية بشكل عام في coleoptera في حين أنها منخفضة في أمر lepidoptera7. ولم يتم بعد تقييم كفاءة ومدة الضربة القاضية لـ RNAi في T. domestica. بالإضافة إلى RNAi، وقد أبلغنا سابقا ناجحة CRISPR / Cas9-بوساطة الجينات بالضربة القاضية في T. المحلية8. وقد تم تطبيق نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحرير الجينوم في الحشرات خاصة بالنسبة للجين المستهدف بالضربة القاضية. ويمكن توسيع استخدامه لتطبيقات أخرى مثل مقايسة مراسل الجينات ، وتتبع نسب الخلية ، والتلاعب في النشاط النسخي عن طريق طرق في المنشآت الخارجية بعد إنشاء بروتوكول لتسليم مكونات نظام CRISPR / Cas في النوى9. جنبا إلى جنب مع الجمعية الجينومالمنشورة 10، والاستخدام على نطاق واسع وزيادة تطوير تحرير الجينوم CRISPR / Cas القائم على CAS في T. المحلية من شأنه أن يسهل الدراسات التي تركز على الآليات التطورية وراء النجاح التكيفي المعلقة للحشرات. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل للجنين microinjection والتزاوج الكبار T. المحلية لتوليد سلالة متحولة باستخدام CRISPR / Cas9. وبالنظر إلى هذه الطريقة الجديدة، فإننا نناقش أهمية النظر في البيولوجيا الفريدة للأنواع النموذجية غير التقليدية للتطبيقات الناجحة لهذه التقنيات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- صيانة مستعمرات المختبرات

  1. لصيانة الأنواع البرية وفئات السكان المتحولة ، استخدم حاوية بلاستيكية كبيرة (460 مم × 360 مم × 170 مم) مع طعام أسماك اصطناعي منتظم ، والمياه في أكواب بلاستيكية مع ثقب تهوية على الجزء العلوي ، وورق مطوي لإخفاء الحشرات ، والقطن ذو الطبقات لوضع البيض (الشكل 2A). الحفاظ على جميع الثقافات المحلية T. داخل حاضنات 37 درجة مئوية وتعيين الرطوبة النسبية (RH) داخل كل حاوية إلى 60٪ -80٪.
    ملاحظة: لأن T. المحلية تمتص بخار الماء من الغلاف الجوي11،لا حاجة إمدادات المياه المباشرة. يتم الحفاظ على RH المناسبة بسبب وجود بخار الماء من أكواب بلاستيكية تحتوي على ثقب التهوية على الجزء العلوي أو من أكواب بدون غطاء داخل كل حاوية. ليست هناك حاجة لترطيب داخل حاضنة بأكملها التي تحتوي على الثقافات. ويرد في الشكل 1المدة التقريبية لكل مرحلة من مراحل النمو في ظل الحالة الموصوفة في هذا البروتوكول. ويمكن تعديل سرعة النمو عن طريق تغيير درجة الحرارة و / أو RH12.
  2. إضافة الطعام بشكل دوري. إضافة الماء قبل أن يجف.
  3. نقل السكان إلى حاوية نظيفة جديدة على الأقل كل 3 أشهر نظرا لأن الكبار التوقف عن وضع البيض في بيئة قذرة و / أو سكان كثيفة (انظر المناقشة).

2. جمع البيض وصغر الاضاءة

  1. تصميم دليل RNA (GRNA)
    1. تصميم تسلسل الجيش الملكي النيبالي لكل هدف المطلوبة و BLAST تسلسل GRNA ضد تجميع الجينوم للتحقق من مواقع التعرف على خارج الهدف ممكن.
    2. توليف وتنقية gRNAs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة8.
      ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استهداف ATP-ملزمة كاسيت الناقل الجين الأبيض، تم تصميم تسلسل الهدف 20 BP واثنين من تخليق الحمض النووي oligonucleotides 5'-TAATACGACTTATAGTAAGTGGTGTGGAC-3' و 5'-TTCCTCTAAAAAACGCCACCAACACTTA-3' تم طلب. تم إعداد قالب الحمض النووي عن طريق تجميع هذين القلة تليها تضخيم البوليستر PCR ثم يتم في المختبر في نسخ من القالب مع بوليميراز T7 RNA.
  2. إعداد مستعمرات جمع البيض
    1. نقل حوالي 20 من الذكور و 20 أنثى من البالغين إلى حاوية متوسطة الحجم (200 مم × 150 مم × 90 ملم) مع الطعام وإمدادات المياه وورق مطوي وقطعة صغيرة من القطن الطبقات لوضع البيض(الشكل 2B).
    2. اقامة عدة مستعمرات للحصول على عدد كبير من الاجنة المرحلية في فترة زمنية قصيرة لاستخدامها في تحرير الجينوم.
      ملاحظة: من المتوقع أن يتم جمع حوالي 20-40 بيضة من مستعمرة بعد 8 ساعات عند 37 درجة مئوية. وعادة ما يستغرق الأمر بضعة أيام للبالغين المنقولين لبدء وضع البيض ، وربما بسبب التكيف مع بيئة جديدة.
  3. في يوم الحقن، استبدل القطن داخل الحاويات بأخرى جديدة.
  4. ضع شريطًا مزدوج الوجه مقاس 76 مم × 5 مم على شريحة زجاجية عادية مقاس 76 مم × 26 مم.
  5. بعد ثماني ساعات، وجمع البيض من القطن الطبقات عن طريق فصل الطبقات باستخدام ملقط.
  6. محاذاة البيض على الشريط على الوجهين باستخدام فرشاة الطلاء الرطب والحفاظ على مسافة 2 مم بين البيض. يجب أن تكون جميع البويضات موجهة بحيث يواجه المحور الطولي للبيضة جانب الحقن (الشكل 3A). اضغط بلطف أسفل البيض مع فرشاة الطلاء لعقد شركة أثناء الحقن.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تنمو الفطريات بسرعة في البيض المحقون التالف في حالة رطبة ودافئة. من المهم الحفاظ على المسافة بين البيض لمنع التلوث عبر والتوسع في الفطريات.
  7. اخلطي بروتينات GRNA و Cas9 إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام/ميكرولتر و500 نانوغرام/ميكرولتر على التوالي. استخدام الماء المقطر لتخفيف. احتضان المزيج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتعزيز تكوين مجمع ribonucleoprotein ومن ثم الحفاظ على مزيج على الجليد.
    ملاحظة: يمكن إضافة أحمر محايد بتركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى محلول الحقن لمراقبة الكمية المحقونة.
  8. قم بتحميل 2 ميكرولتر من محلول GRNA/Cas9 في الشعرية الدموية في حقن الزجاج باستخدام أداة تحميل صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في المحلل قبل الحقن. إذا لزم الأمر، اضغط على الإبرة لإزالة الفقاعات.
    ملاحظة: في هذه التجربة، يتم استخدام إبرة جاهزة للحصول على طرف إبرة دقيقة(الشكل 3B). ويمكن استخدام إبرة محلية الصنع ذات شكل مماثل بدلاً من ذلك.
  9. إصلاح الشعرية حقن الزجاج، محملة سابقا مع الحل GRNA / Cas9، إلى حامل مجهزة المتلاعب وربط حامل إلى الحقن المجهري الإلكترونية.
  10. تحسين شكل طرف إبرة عن طريق كسر قليلا مع ملقط لمنع انسداد والحصول على أفضل المتانة في جميع أنحاء سلسلة من الحقن (مثال على إبرة مناسبة يظهر في الشكل 3C).
    ملاحظة: من المستحسن تغيير إبرة عندما يكون مسدودا. من الممكن الاستمرار في الحقن بنفس الإبرة إذا تم كسرها مرة أخرى مع ملقط ، ولكن تلميحًا أوسع يؤدي إلى مزيد من تلف البيض ويخفض معدل بقائهم على قيد الحياة. كما T. المحلية البيض لينة وهشة، والحفاظ على طرف إبرة غرامة هو المفتاح للحصول على معدل البقاء على قيد الحياة عالية بعد الحقن.
  11. أدخل الإبرة عند نقطة الوسط للمحور الطولي للبويضة ويحقن كمية طفيفة من المحلل (انظر الشكل 3D-H للرجوع إليه في كمية الحقن). ضبط تكوين الحقن المجهري الإلكترونية أثناء الحقن، اعتمادا على شكل طرف إبرة.
    ملاحظة: من المستحسن أن تمارس ضغط مستمر أثناء الحقن، وإلا فإن محتويات البيضة اللاصقة يمكن أن تتدفق بسهولة إلى الإبرة الزجاجية وقد تسدها. قد يكون الحل إما لحقن مع نبض ضغط قصير أو مع ضغط مستمر، اعتمادا على كمية السائل حقن. نضع في اعتبارنا أنه عندما تلميح إبرة لديه فتحة واسعة، يتم حقن الكثير من الحل في البيضة، مما يسبب الفتك (الشكل 3F-H). في هذه الحالة ، والحفاظ على تدفق السائل المستمر عن طريق الضغط المستمر ، ثم أدخل الإبرة في البيضة واسحبها على الفور. إذا كان يسبب الكثير من الفيض أو رشقات نارية البيض، وتغيير الإبرة.
  12. احتفظ بالبويضات المحقونة في حاوية بالحجم المناسب لعدد البيض المحقون (<20 بيضة: طبق صغير؛ >20 بيضة: حاوية متوسطة الحجم) مع 60٪ -80٪ RH و37 درجة مئوية.

3. التزاوج

  1. تحقق من البيض المحقون بشكل دوري والتخلص من البيض التالف بالملباب لتجنب النمو الفطري(الشكل 3I, J). في حالة الكثير من الفطريات ينمو على البيض، وتنظيف سطح البيض مع ETOH 70٪.
  2. قبل الفقس (حوالي 10 أيام في 37 درجة مئوية بعد وضع البيض) ، تراجع الشريحة الزجاجية مع البيض المحقون في مسحوق التلك لمعطف سطح الشريط على الوجهين. وهذا سوف تجنب التراص من الحوريات فقست. نقل الشرائح الزجاجية المغلفة بالمسحوق إلى حاوية متوسطة الحجم مع الطعام والماء وورق مطوي لإخفاء الحشرات.
  3. إزالة الشرائح الزجاجية بعد أن فقست الحوريات. دورياً يتم توفير الطعام حتى يبلغوا سن الرشد.
    ملاحظة: يستغرق حوالي 2.0-2.5 أشهر للأفراد للوصول إلى مرحلة البلوغ بعد أن يفقس(الشكل 1A). يتم الحكم على مرحلة الكبار على أساس ovipositor متطورة في الإناث(الشكل 1B).
  4. لمصاحبة الأفراد، ونقل أكبر عدد ممكن من البالغين الإناث من النمط البرية اللازمة من مستعمرة مختبر إلى حاوية متوسطة الحجم واحتضان لهم لمدة 14 يوما على الأقل في 37 درجة مئوية للتأكد من أنهم عذراء.
    ملاحظة: ليس من الضروري جمع الإناث العذراء من مستعمرة مختبر لأن الكبار T. المحلية لديها دورة متكررة من الزخرد والتزاوج تسمى "دورة الإنجاب والذوبان"، خلالها الإناث رمي الحيوانات المنوية بعيدا مع كل molt والتزاوج مرة أخرى في دورة الإخصاب المقبل13.
  5. نقل إما ذكر أو أنثى G0 الكبار التي تطورت من البيض حقن و wildtype الكبار (ق) إلى طبق بلاستيكي صغير (Ø 100 مم × 40 مم) مع الغذاء، ورقة مطوية، وقطعة صغيرة من القطن لوضع G1 البيض(الشكل 2C'؛ طبق التزاوج). الحفاظ على أطباق التزاوج في وعاء أكبر مع 60٪ -80٪ RH(الشكل 2C).
    ملاحظة: يمكن تضمين العديد من البالغين من الأنواع البرية في طبق لزيادة فرصة التزاوج الناجح ، على الرغم من تحقيق معدلات نجاح عالية مع الاقتران واحد إلى واحد.

4 - جينوتيبينغ

  1. تصميم أزواج التمهيدي PCR لكل رنا لتضخيم منتج 100-200 BP التي تشمل الموقع المستهدف من قبل GRNA. انفجار كل تسلسل التمهيدي ضد تجميع الجينوم للتحقق من خصوصيته (مثال يظهر لاستهداف الجين الأبيض في الشكل 4A).
  2. تحقق من التحول الجرثومي للبالغين G0.
    1. بعد خمسة أيام من وضع البيض ، وجمع البيض G1 الفردية من كل زوج G0 الكبار في أنابيب 0.2 مل (بيضة واحدة لكل أنبوب ؛ تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل). فصل طبقات القطن لجمع البيض.
      ملاحظة: يوصى بالنمط الجيني على الأقل 12 حوريات G1 من كل زوج تزاوج لتقييم نجاح انتقال الخط الجرثومي (انظر نتائج التمثيل).
    2. أضف 15 ميكرولتر من محلول 0.25 ملغ/مل بروتينيات K (مذاب في مخزن Tris-EDTA) لكل أنبوب، وعينات متجانسة لفترة وجيزة مع المسواك، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 إلى 16 ساعة.
    3. تعطيل البروتينات K عن طريق وضع العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    4. إضافة 90 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل أنبوب ويخلط جيدا. استخدم 2 ميكرولتر من الماكر في مزيج تفاعل PCR 10 ميكرولتر يحتوي على ال التمهيديات المصممة في الخطوة 4.1.
      ملاحظة: يوصى باستخدام بوليميراز الحمض النووي الأمثل للقوالب الخام للوصول إلى ما يكفي من تضخيم البوليميراز البوليميراز.
    5. لتحليل منتجات PCR ، قم بإجراء مقايسة تنقل heteroduplex (HMA) بنظام كهربائي صغير(الشكل 3B؛ انظر Ohde et al., 2018)8.
      ملاحظة: يمكن تقييم الطفرات مع طريقتين بديلتين: (1) HMA مع البوليمرات هلام القياسية, مثل 8٪ بولياكريلاميد14; (2) هضم منتجات PCR مع T7 endonuclease تليها agarose هلام الكهربائي15.
    6. احتفظ فقط بحوريات G1 الناتجة عن البالغين G0 التي تحتوي على طفرات في الخط الجرثومي والتخلص من التشوهات الأخرى.
  3. genotyping الفردية من الحوريات G1 / البالغين
    1. عزل الحوريات G1 في لوحات 24-جيدا مع التعرق أو فرشاة الطلاء. ضع 24 بئرا في وعاء أكبر (على سبيل المثال، حاوية متوسطة الحجم المستخدمة في هذا البروتوكول) مع إمدادات المياه كما هو موضح أعلاه للحفاظ على RH من 60٪ -80٪(الشكل 1D). الحفاظ على إمدادات الأغذية الأسماك العادية الاصطناعية(الشكل 1D').
      ملاحظة: على الرغم من أن هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في أي نقطة من مراحل حورية والبالغ, فمن المستحسن لتنفيذ ذلك بعد بلوغ سن البلوغ وقبل الاقتران (> 2.5 أشهر بعد الحقن; الشكل 1B) لأنه من الأسهل للحفاظ على firebrats في وعاء كبير. مطلوب تربية الفردية لتتبع نوع وراثي لكل حورية G1 على الخطوات التالية. G1 الحوريات من نفس G0 الكبار يمكن أن يكون لها طفرات مختلفة.
    2. قرصة وسحب cerci وceلدال من حورية / الكبار باستخدام ملقط وجمعها في أنبوب 0.2 مل تحتوي على 50 ميكرولتر EtOH (تخزين العينات التي تم جمعها في -20 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل).
      ملاحظة: يتم جمع عينات الأنسجة في EtOH لأنه يمنع فقدان هذه العينات الصغيرة بسبب الكهرباء الساكنة. إذا كان المرء يحتاج إلى وقف حركة الحشرات ، يُعين الحورية / البالغين على الجليد عند أخذ عينات الأنسجة. لأن T. المحلية لا يمكن البقاء على قيد الحياة بعد التبريد على المدى الطويل على الجليد، لا تخدير لهم لأكثر من دقيقة ونقلها على الفور مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة. الاجتثاث من cerci وخيوط السد يسبب أي زيادة في الوفيات.
    3. ضع أنابيب العينة مع الأغطية مفتوحة على كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية لتتبخر EtOH.
    4. كرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 لgenotyping.
    5. إرسال منتجات PCR التي يتم فيها ملاحظة نمط نطاق متحولة إلى خدمة تسلسل سانجر القياسية.
    6. احتفظ بالحوريات G1/البالغين مع الطفرات المطلوبة وتجاهل الآخرين (انظر الشكل 4C للحصول على نتيجة التسلسل التمثيلي).
  4. عبر البالغين التي تحتوي على الطفرات المطلوبة في طبق التزاوج والحصول على الأجيال القادمة لإنشاء سلالة متحولة homozygous.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في أيدينا، يمكن حقن حوالي 100 بيضة بشكل جيد مع الشعيرية حقن واحد عندما يكون لديه تلميح كافية (الشكل 3C). حقن مجمع gRNA/Cas9 ribonucleoprotein في الأجنة داخل أول 8 ساعة بعد وضع البيض النتائج في indels في موقع يستهدف GRNA. وهذا يسبب طفرات البجلية في بعض خلايا الجيل المحقون (G0) وبالتالي يتم الحصول على الأنماط الظاهرية الفسيفساء متحولة عادة في G0. على سبيل المثال، عندما تم استخدام هذا البروتوكول لحقن GRNA التي تم تصميمها لاستهداف الجين الأبيض، 32.6٪ من الحوريات G0 عرض خسارة جزئية لتصبغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة للجيل الناجح من المتحولة T. domestica المرغوب فيها مع CRISPR/Cas9 ، من المهم أولاً جمع عدد كاف من الأجنة المرحلية للحقن. للحصول على مجموعة ثابتة من عدد كاف من البيض المحلي T. ، فإن المفتاح هو تحديد حجم مناسب للحاوية ليكون لها كثافة سكانية أقل لأنها ستساعد على الانتهاء بنجاح من سلسلة من سلوكيات التزاوج المعقدة ، والتي تتكرر بعد كل 13 من البالغين. ذكر T. المحلية الكبار ينقل الحيوانات المنوية بشكل غير مباشر إلى أنثى عن طريق الحيوانات المنوية. Sweetman (1938) وذكرت أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم TO و TD من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI 19H02970 و 20H02999 على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
لوحة 24 بئرCorning83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 ، 100 & micro ؛ زتقنيات الحمض النووي المتكاملة1081060
منظف مضاد للكهرباء الساكنةHozanZ-292لإزالة الكهرباء الساكنة من لوحة 24 بئرا
صندوق حاجز 20.7 لترAS ONE4-5606-01حاوية كبيرة
FemtoJet 4iEppendorf5252000013حاقن دقيق إلكتروني
Femtotip II ، حقن شعريEppendorf5242957000حقن الزجاج الشعيرات الدموية
عبوة عالية 2440 ملكواحد5-068-25حاوية متوسطة الحجم
باناسونيكMIR-554-PJلمدة 37 درجة ؛ حضانة C. لا حاجة للترطيب داخل الحاضنة.
KOD Fx NeoToyoboKFX-101PCR للتنميط الجيني. محسن للتضخيم من القوالب الأولية.
حامل مغناطيسيNarishigeGJ-8لعقد المشغل الدقيق
Microloader Eppendorf5242956003
MicromanipulatorNarishigeMM-3
المجهرأوليمبوسSZX12للحقن المجهري. أكثر من 35X التكبير كاف للحقن
MultiNAShimadzuMCE-202نظام الرحلان الكهربائي للرقاقة
الدقيقة NiceTacNichibanNW-5شريط على الوجهين لوضع البيض على شريحة زجاجية
فرشاة الطلاء (شعر الحصان)طبق زراعة النبات PentelZBS1-0
SPL Life Sciences310100طبق التزاوج وإمدادات المياه لحاويات كبيرة ومتوسطة الحجم
Proteinase K ، مؤتلف ، PCR الصف Lyophilizate من Pichia pastorisRoche3115836001
SZX 12 مجهرأوليمبوسSZX 12من 35X يكفي للحقن المجهري
مسحوق التلكMaruishi877113
Tetra Goldfish GoldGrowth Spectrum Brandsطعام السمك العادي الاصطناعي
حاضنة إنزيم الدقيق أكثر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
  2. Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
  3. Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
  4. Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
  5. Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
  6. Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
  7. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  8. Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
  9. Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  10. Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
  11. Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
  12. Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
  13. Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  14. Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
  15. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
  16. Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Egg MicroinjectionGenome EditingThermobia domesticagRNA CAS9Embryo InjectionMutant StrainsDry Injection MethodMating OptimizationGermline TransformationGenomic PCR

Related Articles