هنا نحن نصف اكتساب البصرية وتوصيف إمكانات العمل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستمدة من خلايا القلب باستخدام نظام قياس ضوئي وحدات عالية السرعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقنيات الميكروليكترودي التقليدية داخل الخلايا لقياس الفيزيولوجيا الكهربية القلبية هي معقدة للغاية ، وكثيفة العمالة ، وعادة ما تنفذ في الإنتاجية المنخفضة. التوسع السريع والمستمر لتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) يقدم معيارا جديدا في أبحاث القلب والأوعية الدموية والطرق البديلة ضرورية الآن لزيادة إنتاجية البيانات الكهربية على مستوى خلية واحدة. VF2.1Cl هو صبغة حساسة الجهد المستمدة مؤخرا الذي يوفر قناة واحدة سريعة، استجابة عالية الحجم للتقلبات في إمكانات الغشاء. وهي تمتلك حركية متفوقة على تلك الموجودة في مؤشرات الجهد الأخرى، ويجعل البيانات الوظيفية المتاحة تعادل تلك التقنيات microelectrode التقليدية. هنا، ونحن نظهر مبسطة، وتوصيف العمل غير الغازية المحتملة في iPSC الإنسان يسير بخطى خارجية المستمدة cardiomyocytes باستخدام نظام قياس ضوئي وحدات وبأسعار معقولة للغاية.
المقدمة
النمذجة الكهربية لخلايا القلب وبناء منصات فعالة لفحص أدوية القلب أمر ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية لمجموعة متنوعة من اضطرابات عدم انتظام ضربات القلب. وقد أدى التوسع السريع في تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى نجاحات واعدة في نمذجة الأمراض البشرية والتحقيق الدوائي باستخدام خلايا القلب المشتقة من المريض المعزول (iPSC-CM). "معيار الذهب" تقنيات توصيف الكهربية لهذه الخلايا من خلال التصحيح المشبك (المشبك الحالي) يمكن تحديد إمكانات العمل (AP) مورفولوجيا ومدة، ومع ذلك، هذه الطريقة معقدة بشكل لا يصدق وبطيئة، وليس مناسبا تماما لاكتساب البيانات الإنتاجية العالية1. يتم الإبلاغ بانتظام iPSC-CMs أن لديها زيادة الغشاء الانبساطي ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الاستعدادات الخلوية
ملاحظة: تم اشتقاق iPSCs البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول من المتبرعين الأصحاء وتم تمييزها في الطبقات الأحادية باستخدام تعديل جزيء صغير محدد بالكامل للإشارات WNT وتقنيات تنقية اللاكتات كما هو موضح سابقا12و13و14. تم الحفاظ على iPSC-CMs كل يومين إلى ثلاثة أيام مع وسيط ثقافي موضح أدناه.
- إعداد وسيط ثقافة من المتوسط القاعدي (RPMI 1640) و 2٪ ملحق (B27). يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إعداد وسيط الطلاء من المتوسط القاعدي (RPMI 1640), 2٪ تكملة (B27) و 1:2000 مثبط روك. يخزن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 3: ملامح إمكانات العمل البصري (AP) لخلايا القلب الأصلية المعزولة والخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية المستمدة من خلايا القلب (iPSC-CM). (أ) ممثل AP البصرية من عضلة القلب مورين واحد (وسط) مع متوسط ± SEM من APD50 وAPD90 (ن = 7، والحق). (ب) ممثل البصرية AP من iPSC الإنسان واحد المستمدة cardiomyocyte (وسط) مع متوسط ±.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نصف بروتوكول أساسي للحصول بسهولة على ملامح AP مفصلة من iPSC-CMs معزولة مناسبة للنمذجة الكهربية وفحص الأدوية القلبية. نحن نكشف عن برامج العمل المنتظمة والقوية من iPSC-CMs ذات البذور القليلة مما يشير إلى وظائف المؤشر والإخلاص المنهجي.
نظرا للطيف الواسع من المنهجيات التجارية لإعادة برمجة iPSC وعدم توحيد بروتوكولات التمايز القلبي ، يمكن أن تظهر النماذج المستندة إلى iPSC تباينا هائلا في وظيفتها ومورفولوجيا16. وهذا يمكن أن يعوق أيضا فعالية دراسات السمية القلبية. نحن تقرير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Cairn البحوث المحدودة دعمت هذا المنشور من خلال تغطية تكاليف إنتاج ملف الفيديو.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يعترفا بسهم كيرن للأبحاث المحدودة لمساهمتهما المالية الرقيقة التي غطت تكاليف إنتاج هذا المنشور. وبالإضافة إلى ذلك، نشكر السيدة إينس مولر والسيدة ستيفاني كيستل على دعمهما التقني الممتاز.
ويدعم أبحاث المؤلفين من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK)، ودويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية، VO 1568/3-1، IRTG1816 RP12، SFB1002 TPA13 وبموجب استراتيجية التميز الألمانية - EXC 2067/1 - 390729940) و Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| ملحق B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-الجلوكوز اللامائي BioChemica< / em> | ITW Recodes | A1422 | |
| مصل الأبقار الجنينية ؛ | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt غشاء إمكانات كيت | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | دينار | بحريني 354230 | |
| NaCl | سيجما ألدريتش | 9265.2 | |
| نيفيديبين | سيجما ألدريتش | 21829-25-4 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | Invitrogen ؛ | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| <قوي>المعدات< / قوي> | |||
| 495LP ثنائي اللون شعاع الشعاع | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B مكبر للصوت | الجزيئية | ||
| أغطية دائرية ، سمك 0 | CB00100RA020MNT0 | علمي حراري | |
| Digidata 1550B | الجزيئية | ||
| مزود طاقة OptoLED مزدوج | كيرن للأبحاث | ||
| ET470 / 40x مرشح الإثارة | Chroma Technology | ||
| ET535 / 50m | Chroma Technology | ||
| محفور Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes ؛ | كيرن للأبحاث | ||
| IX73 المجهر المقلوب | أوليمبوس | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| محولات متعددة المنافذ | كيرن للأبحاث | ||
| محفز خلية قصر القدم | IonOptix | ||
| Optomask | كيرن للأبحاث | ||
| مراقب نظام Optoscan | Cairn Research | ||
| PH-1 منصة التحكم في درجة الحرارة | شركة Warner Instruments | ||
| كاشف المضاعف الضوئي | كيرن للأبحاث | ||
| PMT مكبر للصوت إدراج | Cairn Research | ||
| PMT توريد إدراج | Cairn Research | ||
| RC-26G غرفة حمام مفتوحة | شركة Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL محول المرحلة | أوليمبوس | ||
| T565lpxr ثنائي اللون Beamsplitter | Chroma | ||
| T660lpxr ثنائي اللون Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 وحدة تحكم في درجة الحرارة ثنائية القناة ؛ | npi الإلكترونية | ||
| UPLFLN 40X الهدف | أوليمبوس | ||
| كاميرا USB 3.0 ملونة | مصدر | ||
| التصوير<قوي>البرمجيات | |||
| Clampex 11.1 | الأجهزة الجزيئية | ||
| Clampfit 11.1 | الأجهزة الجزيئية | ||
| التقاط IC 2.4 ؛ | مصدر التصوير | ||
| المنشور 8 | لوحة الرسم |
المراجع
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
