يمكن أن تساعد الموجات فوق الصوتية عالية الدقة في تبسيط التجارب التي تتطلب الفئران الحامل في الوقت المناسب من خلال تحديد حالة الحمل وعمر الحمل وفقدان الحمل. يقدم هنا بروتوكول لتوضيح طرق لتقييم حمل الفئران وكذلك المزالق المحتملة (صور القطع الأثرية) التي قد تحاكي الحمل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هل فأري حامل؟ تقييم الموجات فوق الصوتية عالية التردد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفأر هو نموذج الثدييات المفضل للعديد من الأمراض البشرية والعمليات البيولوجية. غالبا ما يتطلب علم الأحياء التنموي الفئران الحامل على مراحل لتحديد العمليات المتطورة في نقاط زمنية مختلفة. وعلاوة على ذلك، يتطلب التكاثر الأمثل والفعال للفئران النموذجية تقييما للحمل في الوقت المناسب. الأكثر شيوعا، يتم تزاوج الفئران بين عشية وضحاها، ويتم تحديد وجود المكونات المهبلية. ومع ذلك، فإن القيمة التنبؤية الإيجابية لهذه التقنية دون المستوى الأمثل، ويحتاج المرء إلى الانتظار لمعرفة ما إذا كان الماوس حاملا حقا. الفحص الحيوي عالي الدقة بالموجات فوق الصوتية هو أداة فعالة وفعالة للتصوير: 1) ما إذا كانت الفأرة حاملا؛ 1) ما إذا كانت الفأرة حاملا أم لا؛ 1) ما إذا كانت الفأرة حاملا أم لا؛ 1) ما إذا كانت الفأرة حاملا أم لا؛ 1) ما إذا كانت الفأرة حاملا أم لا. 2) ما المرحلة الحملية التي وصل إليها الفأر؛ و 3) ما إذا كانت هناك خسائر داخل الرحم. بالإضافة إلى الأجنة والأجنة ، يجب على المحقق أيضا التعرف على القطع الأثرية الشائعة في تجويف البطن حتى لا يخطئ في هذه الرحم المرق. توفر هذه المقالة بروتوكولا للتصوير مع أمثلة توضيحية.
المقدمة
الفأر هو النموذج المفضل للثدييات للعديد من الأمراض البشرية والعمليات البيولوجية1،2،3،4. غالبا ما تتطلب الأبحاث في علم الأحياء التنموي الفئران الحامل مرحليا لتحديد العمليات المتطورة في نقاط زمنية مختلفة5و6و7و8. وعلاوة على ذلك، يتطلب التكاثر الأمثل والفعال للفئران النموذجية تقييما للحمل في الوقت المناسب، لا سيما عندما يدرس المحققون آثار طفرة جينية على النمو. عادة، المحققين رفيقة الفئران heterozygous بين عشية وضحاها، والبحث عن المكونات المهبلية في وقت مبكر من صباح اليوم التالي، ونأمل أن الحمل يترتبعلى ذلك 9. تحديد فقدان داخل الرحم يبدأ عادة مع التحقق من القمامة حديثي الولادة لنسب المندلية من الأنماط الجينية، ثم العمل إلى الوراء عن طريق التضحية الفئران الحوامل في مراحل الحمل المختلفة، واستعادة الأجنة. قد يحدد المحققون زيادة الوزن كمقياس للحمل الإيجابي10،11؛ ومع ذلك ، خاصة مع الفئران المهندسة وراثيا ، قد تكون القمامة صغيرة جدا ثم يعاد ترتيبها بعد ذلك عندما يكون هناك فقدان داخل الرحم بسبب زيادة الوزن التي قد لا تكون واضحة (خاصة في وقت مبكر من الحمل ، ~ E6.5-8.5). قد يظهر الفأر حاملا زورا بسبب ورم حميد في البطن على سبيل المثال. في جوهرها ، واحد يعمل "أعمى".
يسمح الفحص الحيوي عالي الدقة بالموجات فوق الصوتية بالتصور المباشر للرحم الجرافيد وتطوير أجنة الفئران12و13و14و15و16. على الرغم من أننا قد وضعت في البداية أساليب لتقييم الجنينية الماوس القلب والأوعية الدموية علم وظائف الأعضاء16،17، أدركنا فائدة هذه الطريقة التصوير لتبسيط تربية الفئران لدينا. على وجه التحديد، لم يعد علينا الانتظار "لنرى" إذا كان الماوس حاملا، على أساس إما زيادة الوزن الواضحة أو تسليم القمامة. يمكننا تحديد حالة الجاذبية وإعادة تزاوج الفئران بسرعة إذا كان السد غير حامل. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تصور الخسائر داخل الرحم بسهولة، ويمكن تحديد جدول زمني للخسارة دون التضحية بالفأر (انظر الشكل 1 للحصول على تخطيطي). وبالتالي يمكن توفير الوقت والفئران النموذجية القيمة والأموال.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تتبع جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول دليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية غروسمان للطب بجامعة نيويورك.
1. التزاوج من الفئران للحمل في الوقت المناسب
- إقران الماوس الإناث المناسبة (عادة heterozygote) في قفص مع الماوس الذكور المناسبة (عادة heterozygote) للتزاوج بين عشية وضحاها.
- فصل الفئران في صباح اليوم التالي. بدلا من ذلك، تتزاوج باستمرار الفئران الإناث والذكور، وبالتالي زيادة فرص الحمل.
ملاحظة: ومع ذلك، لا يمكن ضمان الحمل في الوقت المناسب بدقة مع البديل، وتنظيم أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية ليست واضحة، وخصوصا عندما تؤدي عملية المرض في تأخر النمو داخل الرحم. إذا افترض أن الأجنة التي تحمل المتغير الجيني صغيرة، فابحث عن زبالات النوع البري الأكبر لقياس عمر الحمل.- اختياري: ابحثي عن المكونات المهبلية. إذا لم يكن هناك قابس المهبل، لم يتم تزاوج الماوس الإناث. إذا كان هناك قابس المهبل، فإنه لا يزال من المرجح أن الماوس الإناث لا تصبح حاملا.
- الوقت في اليوم التالي للتزاوج بين عشية وضحاها كما E0.5.
- إجراء التصوير في E6.5-E.8.5 لتحديد الحمل، وإعادة تزاوج الفئران إذا لم يكن الماوس حاملا (انظر الخطوة 1.1).
ملاحظة: في هذه المرحلة، السد الإناث ليست حاملا بوضوح للعين. وبالتالي ، فإن التصوير بالموجات فوق الصوتية يسمح بالتصميم المبكر وإعادة التزاوج.
2. التخدير وإعداد الماوس
- ضع الماوس الحامل في غرفة تحريض مخدر.
- مزيج isoflurane مع الهواء الغرفة أو الأكسجين الطبي، بتركيز 2٪-3٪ في 1 لتر / دقيقة معدل التدفق للحث على التخدير من الماوس الحوامل في غرفة التعريفي.
ملاحظة: عادة ما يحدث التخدير في غضون 1-2 دقيقة. الفأرة ستكون مستلقية وتنفسها سيكون قد تباطأ - نقل الماوس بسرعة إلى منصة التصوير. تحتوي منصة التصوير عادة على عناصر تسخين أيضا ، والتي يمكن أن تساعد في الحفاظ على دفء الماوس.
- ضع أنف الفأرة في الأنف المخدر.
- بسرعة إعادة توجيه خليط isoflurane / الأكسجين إلى nosecone منصة التصوير. الحفاظ على ايزوفلوران في 2٪-3٪ في تدفق 1 لتر / دقيقة.
- تحديد مستوى التخدير عن طريق قرصة مخلب، منعكس القرنية، ومستوى التنفس، وأي حركة.
ملاحظة: يمكن تحديد رد الفعل القرنية في البداية عن طريق تطبيق مرهم الترطيب على العينين لمنعهما من الجفاف أثناء تخدير الماوس (لا يغمض الماوس عينيها). - مع الماوس الكذب سوبين (على ظهره)، الشريط الكفوف إلى منصات تخطيط القلب منصة التصوير (تخطيط القلب).
ملاحظة: ومع ذلك، تخطيط القلب غير ضروري لهذا النوع من التصوير. - إزالة الفراء من بطن السد الحوامل على النحو التالي:
- الرطب الفراء البطن جيدا مع الإيثانول 70٪، بما في ذلك ما يصل إلى حواف الجانبية. لا تنطبق كثيرا أن هناك الجريان على المنصة.
ملاحظة: الإيثانول يعمل بشكل أفضل كما ومواد التشحيم الحلاقة من الماء. - استخدام شفرة الحلاقة لحلاقة بعناية البطن. يجب الحرص على عدم قطع الحلمات.
- مسح الفراء حلق قبالة البطن بالشاش أو بعض مناديل.
- بدلا من ذلك، استخدم كريم إزالة الشعر بعد استخدام مقصات الفراء لإزالة معظم الفراء.
- الرطب الفراء البطن جيدا مع الإيثانول 70٪، بما في ذلك ما يصل إلى حواف الجانبية. لا تنطبق كثيرا أن هناك الجريان على المنصة.
3. التصوير عبر العبدminal من الماوس الحامل (المفترض)
- بعد حلق البطن، خفض isoflurane إلى 1٪-1.5٪، لا يزال الحفاظ على معدل تدفق 1 لتر / دقيقة. رصد مستوى التخدير من مستوى التنفس وأي حركات وكذلك قرصة مخلب و / أو منعكس القرنية.
ملاحظة: معدل ضربات قلب الماوس المخدر عادة ما يكون 400-500/دقيقة، اعتمادا على درجة الحرارة الأساسية (المستقيم). لغرض فحص الحمل السريع ، لا تدفئ الماوس إلى درجة حرارة أساسية فسيولوجية ؛ سيكون معدل ضربات القلب أقرب إلى 400-450/min ، ولكن قد ينخفض أكثر مع عدم انتظام الإيقاع إذا أصبح الماوس باردا مع التصوير المطول.- الأهم من ذلك ، تأكد من أن التنفس معتدل في العمق والانتظام ، وليس غير منتظم أو ليلي (اللهاث: عميق وبطيئ وغير منتظم ، مع تراجع عميق بين الوربية والفرعية).
ملاحظة: معدل التنفس للفأرة غير التهوية والمخدرة عادة ما يكون 60-100/دقيقة https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html.
- الأهم من ذلك ، تأكد من أن التنفس معتدل في العمق والانتظام ، وليس غير منتظم أو ليلي (اللهاث: عميق وبطيئ وغير منتظم ، مع تراجع عميق بين الوربية والفرعية).
- تطبيق الموجات فوق الصوتية (اقتران الصوتية) هلام على البطن بسخاء.
- ضع محول التصوير على البطن لتوجيهه في مستوى أفقي: توجيه المسبار للحصول على اتجاه من اليسار إلى اليمين على نظام التصوير؛ وينبغي أن "نقطة" أو ريدج المشار إليها على جانب التحقيق التصوير تواجه الحق.
ملاحظة: يجب أن يؤدي انزلاق مسبار التصوير إلى يمين الماوس إلى نقل الصورة المقابلة على نظام الموجات فوق الصوتية إلى يمين الماوس (تخيل البحث "لأعلى" من ذيل الماوس - سيتم ترك يمين الماوس على الشاشة).- عادة، استخدم تركيب محول نظام التصوير ونظام التلاعب بالسكك الحديدية. هنا ، تم استخدام التصوير "باليد الحرة" حيث يتم حمل محول التصوير باليد (يدان أكثر ثباتا من واحدة) والذي يسمح بحركات أسرع حول البطن. وتشمل هذه الحركات، كما سيخطوط أدناه، حركات التناوب والحركات التحويلية. ومع ذلك، يتطلب هذا المزيد من الممارسة.
- تحديد المثانة على الشاشة (فيديو 1).
- المسح الضوئي من المثانة، وتحديد المهبل. ثم، المسح الضوئي ببطء وسلاسة في اتجاه الجمجمة، وتحديد تشعب المهبل في قرون الرحم الأيسر والأييم (الشكل 2؛ فيديو 1).
- بدء المسح من الرحم (قرون الرحم اليسار واليمين)13 (الشكل 3; فيديو 2).
ملاحظة: حتى منتصف الحمل (E10.5 أو E11.5)، سيتم وضع أجنة الفئران على طول المحيطين الأيمن والأيسار. مع نموها ، فإن الأجزاء البعيدة من الرحم وأجنة المقابلة لها ستتحول إلى الخارج والخلفية. مع نمو الأجنة بشكل أكبر (E15.5 وما بعدها ، بشكل عام) ، سيتم وضع أجنة الماوس بشكل عشوائي تقريبا في اتجاهات مختلفة ، ويصبح من الصعب "تتبع" الرحم من قريب إلى بعيد.- مسح بسرعة للتحقق ببساطة إذا كان الماوس حاملا أم لا. تتطلب هذه الطريقة السريعة فقط التعرف على جنين الرحم والفأر.
- بدلا من ذلك، خذ وقتا إضافيا لتعداد الأجنة (حية، ميتة، مسورة) في كل قرن الرحم.
ملاحظة: بشكل عام، سيعرض الجنين الحي أعضاء متميزة مثل القلب والأطراف والرأس مع البطينين والعينين. الجنين الميت يأخذ مظهرا متجانسا و"طري" ما لم يمت للتو. الأجنة المسورة لها بقعة صدى محددة في وسط رحم ذو مظهر رقي (الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6، الشكل 7، الشكل 8). - لتحديد ما إذا كان الجنين على قيد الحياة حقا، ابحث عن ضربات القلب و / أو تدفق الدم.
ملاحظة: يمكن أن يساعد رسم خرائط تدفق Color Doppler في تحديد وجود تدفق الدم ، سواء في الجنين أو في الحبل السري. بشكل عام، يمكن تطبيق هذا على الأجنة الأكبر من E8.5. - التعرف على القطع الأثرية المحتملة التي قد تحاكي الرحم gravid (الشكل 9، الشكل 10). بالإضافة إلى ذلك ، كما غاز الأمعاء وغيرها من القطع الأثرية "الظل" بالموجات فوق الصوتية قد تحجب أجزاء من قرن الرحم ، وإجراء التصوير من وجهات نظر متعددة لضمان التصور الكافي للرحم.
- بعد اكتمال المسح، امسح الجل من البطن بالشاش أو المناديل. في محاولة لإزالة قدر الإمكان كما هلام يميل إلى تبريد الماوس إلى أسفل.
- فك الكفوف، وإزالة الماوس من nosecone مخدر.
- تحرك بلطف الماوس مرة أخرى إلى قفص لها. يجب أن تستيقظ وتبدأ بالتحرك في غضون دقيقة أو نحو ذلك.
ملاحظة: الفئران المعدلة وراثيا قد يستغرق وقتا أطول قليلا للتعافي من التخدير وتحتاج إلى أن تراقب عن كثب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سيسمح هذا البروتوكول للمحقق بتحديد ما إذا كان الفأر حاملا بثقة، بما في ذلك خلال المراحل المبكرة وتحديد ما إذا كانت هناك خسائر جنينية أو جنينية واضحة قبل الولادة دون الحاجة إلى التضحية بالسد الحامل. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عند تربية الفئران المعدلة وراثيا. عادة، heterozygous x heterozygous الصلبان لتسفر عن ذرية homozygous يؤدي إلى فشل التنمية السليمة، والذي يسبب فتك ما قبل الولادة. يصور الشكل 1 حالة تمثيلية تموت فيها الأجنة تدريجيا ثم يعاد ترتيبها حتى منتصف الحمل. يو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أهم خطوة أولى في التصوير هي تحديد المهبل ومن ثم تحديد تشعب قرن الرحم إلى اليسار واليمين. من خلال اتباع كل قرن الرحم، والصور هو أقل عرضة لسوء تحديد حلقات الأمعاء والرحم. وعلاوة على ذلك، فهم الاختلافات في مظهر الأمعاء (مع / بدون البراز) من المهم التمييز بين هذه من الرحم. أحيانا، البراز "كرات" في حلقات الأمعاء قد تحاكي الرحم gravid (الحوامل). على الرغم من أن مؤلفين آخرين قد وصفوا تشخيص الحمل وتنظيم النمو الجنيني الماوس17،18،19 بما ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مزيل الشعر | |||
| إيثانول ، 70٪ | |||
| مقص | |||
| شاش أو KimWipes | |||
| Isoflurane | |||
| أكسجين طبي (اختياري) | |||
| شريط | |||
| طبينظام تصوير الفأر (بما في ذلك إعداد التخدير ومنصة التصوير) | Fujifilm Visual Sonics | مختلف | أي نظام مزود بمحول طاقة بالموجات فوق الصوتية بتردد مركزي 40 ميجاهرتز |
| شفرة حلاقة (ليست ماكينة حلاقة آمنة) | |||
| مقياس (لوزن الماوس) | |||
| جل |
المراجع
- Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
- Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
- Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
- Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
- Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
- Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
- Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34(2008).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Cardiovascular imaging in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 15-38 (2016).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
- Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207(2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205(2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).
- Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
- Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
- Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
