يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جمع العينات وتحليل ميكروبيوم الاثني عشر

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61900

⸱

يناير 12, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Parenteral Nutrition, Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 2The Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, 3UCLA Microbiome Center, David Geffen School of Medicine at University of California, 4Department of Surgery, University of California, Los Angeles, 5Department of Medicine and Human Genetics, David Geffen School of Medicine at University of California, 6Cedars-Sinai Cancer and Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المخطوطة ، نناقش طريقة جديدة لأخذ عينات وتحليل ميكروبيوم الاثني عشر. توفر هذه الطريقة تصويرا دقيقا للتنوع الميكروبي وتكوينه في الاثني عشر ويمكن أن تكون مفيدة لمزيد من التحقيق في ميكروبيوم الاثني عشر.

الملخص

ارتبطت التحولات في الميكروبيوم بفسيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية للعديد من أنظمة الأعضاء في كل من البشر ونماذج الفئران. تمت دراسة ميكروبيوم الأمعاء عادة من خلال مجموعات عينات البراز. أدت سهولة الحصول على عينات البراز إلى العديد من الدراسات التي كشفت عن معلومات تتعلق بالجهاز الهضمي اللمعي البعيد. ومع ذلك ، فقد تناولت دراسات قليلة أهمية الميكروبيوم في الأمعاء القريبة. بالنظر إلى أن الاثني عشر هو موقع رئيسي للهضم والامتصاص ، فإن ميكروبيومها وثيق الصلة بالتغذية وأمراض الكبد ويستدعي مزيدا من التحقيق. نوضح هنا بالتفصيل طريقة جديدة لأخذ عينات من ميكروبيوم الأمعاء اللمعية والمخاطية القريبة في البشر الذين يخضعون للتنظير العلوي عن طريق الحصول على شفط الاثني عشر والخزعة. شراء العينات سهل ولا يتأثر بالقطع الأثرية مثل الالتزام التحضيري للمريض ، كما هو الحال في الحصول على عينات القولون أثناء تنظير القولون. تظهر النتائج الأولية أن الميكروبيوم اللمعي والمخاطي يختلفان اختلافا كبيرا ، والذي من المحتمل أن يكون مرتبطا بالظروف البيئية ووظائف الحاجز. لذلك ، يكشف مزيج من نفطة الاثني عشر والخزعات عن صورة أكثر شمولا للميكروبيوم في الاثني عشر. يتم الحصول على الخزعات من الأجزاء الهابطة والأفقية من الاثني عشر ، والتي تكون قريبة تشريحيا من الكبد والشجرة الصفراوية. هذا مهم في دراسة دور بيولوجيا الأحماض الصفراوية ومحور الأمعاء والكبد في أمراض الكبد. يمكن استخدام الخزعات والشفط لتسلسل الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S ، والتمثيل الغذائي ، والتطبيقات المماثلة الأخرى.

المقدمة

أصبح الميكروبيوم المعوي مجالا ذا اهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. من المفهوم الآن أن مجموعة البكتيريا المتنوعة في الأمعاء يمكن أن تختلف بناء على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك علم الوراثة والنظام الغذائي والأدوية والتأثيراتالبيئية 1. حددت الدراسات أيضا ملامح ميكروبية فريدة مرتبطة بأمراض الجهاز الهضمي المختلفة ، مثل السمنة وأمراض التهاب الأمعاء وأمراض الكبد2،3. تركز غالبية الدراسات على تحديد ملامح ميكروبيوم الأمعاء الغليظة من خلال تحليل عينات الغشاء المخاطي البرازيةوالبعيدة 4. على الرغم من أن أعلى تركيز للبكتيريا المعوية موجود في القولون (1012 بكتيريا / جرام) ، إلا أن هناك مجتمعا معقدا من الميكروبات الموجودة في الاثني عشر (103 / جم) ، الصائم (104 / جم) ، والدقاق (107 / جم) التي تلعب دورا رئيسيا في التمثيل الغذائي الهضمي والامتصاص5.

تعمل الأمعاء الدقيقة كموقع أساسي لانهيار المغذيات وامتصاصها في الجهاز الهضمي. تلعب البكتيريا المبطنة للأمعاء الدقيقة دورا أساسيا في المساعدة في الانهيار الكيميائي للركائز الغذائية وفي إطلاق المركبات النشطة بيولوجيا التي تساعد في امتصاص العناصرالغذائية 6. تساهم هذه التفاعلات في بيئة معقدة من الميكروبات والميكروبات المضيفة ونشاط الميكروبات المضيفة في الأمعاءالدقيقة 7. وجدت دراسة راقبت ميكروبات الأمعاء الدقيقة في نماذج الفئران أن الفئران الخالية من الجراثيم التي تتغذى على نظام غذائي غني بالدهون قد أضعفت امتصاص الدهون ، ولكن عندما استعمرت بالميكروبات الصائمية ، كان لديها زيادة مباشرة في امتصاص الدهون6. وجدت دراسة تجريبية بشرية توصيف الجراثيم الاثني عشر للأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة والأصحاء أن الجراثيم الاثني عشر للأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة لديها تغييرات في مسارات انهيار الأحماض الدهنية والسكروز ، والتي من المحتمل أن تكون مستحثة في علاقة تعتمد على النظامالغذائي 8. علاوة على ذلك ، تم تحديد خلل التنسج في ميكروبات الأمعاء الدقيقة في العديد من الأمراض بما في ذلك فرط نمو بكتيريا الأمعاء الدقيقة ، ومتلازمة الأمعاء القصيرة ، والتهاب الجيب ، والخلل المعوي البيئي ، ومتلازمة القولون العصبي7.

نحن مهتمون بالعلاقة بين الميكروبيوم والمراحل المختلفة لأمراض الكبد المزمنة. على وجه التحديد ، يعمل الاثني عشر كموقع أول للانهيار الكيميائي والامتصاص الغذائي في الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجلب الدورة الدموية الكبدية البابية العناصر الغذائية والمستقلبات إلى الكبد ، حيث تتم معالجتها وتنظيمها في مجرى الدم. يخلق القرب التشريحي بين الأمعاء والكبد بيئة عرضة للاستجابات المؤيدة للالتهابات التي يمكن أن تنشأ بسبب فشل حاجز الأمعاء أو التغيرات في ميكروبيوم الأمعاء9. حددت الدراسات التي تبحث في تطور الميكروبيوم وأمراض الكبد خلل التنسج الميكروبي في المرضى الذين يعانون من مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والتهاب الكبد الدهني (NASH) ، ومرض الكبد الكحولي ، وتليفالكبد 10،11. في حين أن غالبية الدراسات تميز ميكروبيوم القولون ، فقد كنا مهتمين بالتحقيق في ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة فيما يتعلق بأمراض الكبد. من خلال استخدام الطريقة الجديدة المعروضة هنا ، حددنا الملامح الميكروبية الفريدة للاثني عشر في المرضى الذين يعانون من تليف الكبد فيما يتعلق بالنظام الغذائي12.

نظرا لأن توصيف ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة لا يزال مجالا ذا أهمية متزايدة ، فمن الضروري تطوير تقنيات موحدة للحصول على عينات تمثل بدقة ميكروبات الأمعاء الدقيقة. ومع ذلك ، هناك تحديات مرتبطة بشراء العينات التي أدت إلى تعقيد دراسة بيئة ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة. تتطلب طرق أخذ العينات الحالية إجراءات جراحية غالبا ما تكون عرضة للتلوث ، كما هو موضح من قبل Kastl et al7. نشرح هنا بالتفصيل طريقة جديدة للحصول على شفط الاثني عشر والخزعات للتحليل الميكروبي من المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الذين يخضعون لتنظير المريء والمعدة والاثني عشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على عينات من الاثني عشر في نظام الرعاية الصحية لشؤون المحاربين القدامى في لوس أنجلوس الكبرى ، ومركز سيدارز سيناي الطبي ، ومركز رونالد ريغان الطبي بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس بعد قبول البروتوكول السريري لدراسة الميكروبيوم والعلامات الميكروبية وأمراض الكبد (M3LD) من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجنة مراجعة الأخلاقيات المحلية. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى المشاركين.

1. موافقة المشاركين

  1. اقترب من الأشخاص الذين تم تشخيص تليف الكبد من أي مسببات باستخدام التنظير الداخلي المقرر لفحص الدوالي أو ارتفاع ضغط الدم البابي للتجنيد. استبعاد المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكبدية (HCC).
  2. قدم الدراسة ، وتأكد بعناية من فهم المشاركين ، واسأل المشارك عما إذا كان يرغب في التطوع في الدراسة. أكمل نموذج الموافقة المستنيرة إذا وافقوا.
  3. تأكد من أن أخصائي طبي مدرب ومعتمد بشكل صحيح يقوم بإجراء التنظير الداخلي.

2. جمع العينات

  1. تخدير المريض ب 50 مجم من الفنتانيل و 2 مجم من الميدازولام. قم بزيادة الجرعة حسب الحاجة حتى يتم تخدير المريض بشكل معتدل ويمكنه تحمل المنظار الداخلي.
  2. أدخل منظارا داخليا (على سبيل المثال ، Pentax EG29-i10) في مريء المريض وتقدم نحو البواب.
    ملاحظة: سيختلف حجم المنظار بناء على فسيولوجيا المريض. لا تستخدم المنظار الداخلي لأي شفط قبل جمع العينة لتجنب تلويث قناة المنظار بإفرازات المعدة أو البلعوم.
  3. احصل على شريحة مجهرية وإبرة حقنة غير حادة عيار 18 للتحضير لشراء العينات. قم بإعداد وسادة معقمة ستستخدم لنقل الخزعات من شريحة المجهر إلى المجهر.
  4. عندما يصل المنظار إلى الجزء الثاني من الاثني عشر البعيد عن أمبولة Vater ، قم بشفط أي سائل موجود من خلال قسطرة شفط معقمة يمكن التخلص منها تمر عبر قناة العمل الخاصة بالمنظار العلوي واجمعها في حاوية عينة يمكن التخلص منها سعة 40 مل. اغسل ما يصل إلى 30 مل من الماء المعقم الإضافي عن طريق المحقنة في الاثني عشر وشفط السائل في مصيدة عينة سائلة لجمع إجمالي 15 مل.
  5. قم بإزالة حاوية الشفط المرفقة بمكون الشفط في القسطرة على الفور وقم بتغطيتها. ضع الحاوية في الترمس فوق الثلج وفي كيس نقل العينات لنقلها إلى مختبر المعالجة.
  6. أدخل ملقط خزعة أحادي الاستخدام مقاس 2.8 مم في المنفذ الموجود على جانب المنظار الداخلي لإزالة عينات الأنسجة للبحث. قم بإجراء تمريرتين عشوائيتين من الملقط داخل الجزء الثاني من الاثني عشر ، وجمع لدغتين من الأنسجة في كل تمريرة.
  7. استخدم إبرة حقنة غير حادة عيار 18 لاستخراج عينات الأنسجة من الملقط وعلى شريحة المجهر قبل نقل العينات إلى أربع مباردات فارغة منفصلة سعة 2 مل. برغي بإحكام على الأغطية.
  8. أدخل جميع 4 أنواع كريوفيال مغطاة بإحكام في وعاء فارغ ، مثل كوب البول ، وقم بإنشاء حمام يتكون من 20 مل من الإيثانول والثلج الجاف ، لتجميد الخزعات.
  9. ضع الخزعة المبردة في وعاء معزول من الستايروفوم على طبقة من الثلج الجاف وانقل العينات إلى فريزر -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل للحفاظ على العينات.

3. معالجة الشفط

  1. بعد جمع العينات الحيوية ، انقل العينات الحيوية على الفور إلى مختبر BSL2 أو أعلى للمعالجة.
  2. اقلب حاوية سائل الشفط برفق أربع مرات ، ثم قم بتحويل ما يقرب من 1.5 مل من السائل إلى 2 مل من التبريد.
  3. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى يمكن إجراء تحليل الدفعات.

4. إدارة الاستبيان وجمع البيانات السريرية

  1. اطلب من المشاركين إكمال الاستبيانات للحصول على معلومات عن النظام الغذائي والتركيبة السكانية وعادات التدخين / الكحول والحالات الطبية / الأدوية ونوعية الحياة13.
  2. راجع المخططات الطبية لالتقاط البيانات السريرية بما في ذلك المختبرات السريرية وبيانات التصوير والأدوية والمضاعفات الطبية.

5. استخراج الحمض النووي

  1. قم بإجراء استخراج الحمض النووي فور إزالة خزعات الاثني عشر والشفط من التخزين عند -80 درجة مئوية. لا توجد خطوات تحضيرية مطلوبة لاستخراج الحمض النووي من عينات خزعة الاثني عشر.
  2. إجراء استخراج الحمض النووي وتسلسله لجميع العينات في نفس اليوم لتقليل مخاطر تأثير الدفعة في التحليل. قم بإعداد مكتبة خاصة بالعينات التي تم جمعها قبل تسلسل العينات.
  3. استخدم مجموعة أدوات التحضير الدقيق للحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من عينات خزعة الاثني عشر ، وفقا لبروتوكول الشركةالمصنعة 14.
  4. أضف الحد الأقصى لكمية العينة لكل إرشادات بروتوكول إلى أنبوب تحلل يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول التحلل وحجم جاف 0.7 مل من الخرز الزجاجي 2 مم.
  5. قم بتأمين أنابيب التحلل في مضرب حبة بحامل أنبوب وقم بتشغيل الخافق بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق على الأقل. سيختلف الوقت بناء على مضرب الخرزة والعينة التي يتم تحليلها.
  6. الطرد المركزي أنابيب التحلل في جهاز طرد مركزي دقيق عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  7. انقل ما يصل إلى 400 ميكرولتر من المادة الطافية من خلال أنبوب تجميع مفلتر وجهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 8000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  8. أضف 1200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى المرشح في أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه جيدا حتى يتجانس.
  9. انقل 800 ميكرولتر من الخليط إلى عمود الدوران ومجموعة الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق.
  10. ضع عمود الدوران على أنبوب طرد مركزي جديد مع 400 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي واخلطه جيدا حتى يتجانس. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق.
  11. كرر الخطوة 5.10 مرتين ، مع 700 ميكرولتر ثم 200 ميكرولتر مخزن غسيل الحمض النووي لكل غسلة.
  12. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي جديد. احتضن لمدة دقيقة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية الحمض النووي. تجاهل العمود.
  13. قم بتصفية الحمض النووي مرة أخرى. الحمض النووي جاهز الآن لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

6. تضخيم الحمض النووي

  1. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة V4 لجين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S بواسطة 250 × 2 تسلسل مزدوج على aMiSeq أو HiSeq أو NovaSeq15.
  2. قم بإنشاء لوحة أولية من 96 بئرا. قم بإنشاء مزيج رئيسي من 165 ميكرولتر من ILHS_515f التمهيدي الأمامي المحفوظ (مخزون 100 ملليمتر) و 2970 ميكرولتر من الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية. أضف 28.5 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل بئر.
  3. أضف 1.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي المقابل من لوحة 96 بئر من الباركود IL_806r الاشعال الفريدة (مخزون 100 ميكرومتر). ستحدد هذه الرموز الشريطية عينات فريدة من نوعها.
  4. قم بإنشاء مزيج رئيسي من الماء (23.1 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، ومخزن PCR المؤقت (3 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، و dNTPs (0.6 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، و JumpStart Taq DNA polymerase (0.3 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات).
    ملاحظة: يجب إجراء تضخيم الحمض النووي 16S في ثلاث نسخ.
  5. أضف 81 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر في أول 96 بئر من الصفيحة. أضف 6 ميكرولتر من الحمض النووي و 3 مل من مزيج التمهيدي إلى كل بئر. استخدم ماصة P200 متعددة القنوات لخلط الآبار، ثم قم بإدخال ماصة 30 ميكرولتر في البئر المقابل لكل من لوحي PCR الآخرين. أغلق اللوحة.
  6. استخدم إعدادات التدوير الحراري التالية: 94 درجة مئوية × 3 دقائق ؛ 35 دورة: 94 درجة مئوية × 45 ثانية ، 50 درجة مئوية × 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية × 1.5 دقيقة. بعد 35 دورة: 72 درجة مئوية × 10 دقائق ، 94 درجة مئوية × 5 دقائق ، 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.

7. التنظيف وإعداد المكتبة

  1. استخدم مجموعة أدوات تنظيف PCR أو DNA لتنقية منتجات PCR. قم بتخفيض الحمض النووي ب 30 ميكرولتر من الماء من فئة PCR (معالج ب DEPC).
  2. استخدم مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية الذي لديه القدرة على تحديد عينات PCR.
  3. افتح برنامج مقياس الطيف الضوئي على سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق الحمض النووي.
  4. امسح المنفذ بالماء المقطر. أضف 1 ميكرولتر من 1x PCR buffer / ماء إلى المنفذ والمعايرة.
  5. أدخل معرف العينة وقم بإدخال 1 ميكرولتر من العينة على المنفذ.
  6. أغلق المنفذ واضغط على قياس.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند إضافة عينات إلى المنفذ.
  7. امسح العينة بمناديل المختبر والماء المقطر ، ثم قم بإعداد العينة التالية. سجل القيم مع كل عينة. يجب أن يقوم الكمبيوتر أيضا بالحفظ التلقائي.
  8. اجمع بين 250 نانوغرام من كل منتج PCR مضخم في 1 أنبوب. هذه هي مكتبة الحمض النووي.
  9. قم بتسليم المكتبة ، جنبا إلى جنب مع القراءتين 1 و 2 وبادئات تسلسل الفهرس إلى مختبر التسلسل للتسلسل.
    ملاحظة: إذا لم يكن المختبر المحلي متاحا ، فيمكن استخدام مختبر تسلسل تجاري لهذه الخطوة.

8. تنسيق البيانات

  1. توفر بيانات التسلسل نتائج في ملفات .fastq للأمام والعكس. قم بتحويل هذه البيانات إلى ورقة بيانات وتنظيفها بحيث يمكن تحليل المعلومات للتطبيقات النهائية
  2. افتح برنامج البرمجة R. اتبع التعليمات والتعليمات البرمجية المدرجة في ملف الترميز التكميلي للمتابعة عبر خط أنابيب DADA2 وتنظيف بيانات تسلسل الحمض النووي16. قم بتنزيل قاعدة البيانات المرجعية SILVA لتعيين التصنيف بعد تمرير التسلسلات عبر خط الأنابيب17.
  3. باختصار ، قم بتحميل حزمة DADA2 في R. حدد مسارا يتم فيه حفظ جميع ملفات .fastq في نفس الدليل واستخراج الملفات إلى R.
  4. اقرأ أسماء ملفات fastq وقم بمطابقة قوائم ملفات fastq للأمام والعكس.
  5. افحص جودة القراءات الأمامية والقراءات العكسية.
    ملاحظة: يمكن اقتطاع تسلسلات النيوكليوتيدات للحفاظ على تسلسلات عالية الجودة.
  6. قم بتصفية ملفات fastq وتقليمها. استخدم أسلوب learnErrors لمعرفة نموذج الخطأ البارامتري الذي يستخدمه DADA2. سيوضح هذا معدلات الخطأ المرصودة والمتوقعة لكل استبدال محتمل للنيوكليوتيدات (A → C ، A → T ، A → G ، إلخ).
  7. قم بتطبيق خوارزمية استدلال العينة لتحديد عدد التسلسلات الفريدة في كل عينة وفحص كائن فئة dada للوصول إلى عدد المتغيرات الفريدة الحقيقية لكل عينة.
  8. ادمج القراءات الأمامية والخلفية للحصول على تسلسلات كاملة وخالية من الضوضاء.
  9. قم بإنشاء جدول متغير تسلسل amplicon (ASV).
  10. قم بإزالة الوهم من جدول ASV. التسلسلات الخيميرية هي تسلسل واحد ناتج عن تسلسلين أصليين أكثر وفرة.
  11. تعقب العدد الإجمالي للقراءات التي مرت عبر البنية الأساسية لبرنامج ربط العمليات التجارية. سيستخدم DADA2 SILVA لتعيين تصنيف لكل تسلسل فريد. يمكن تحليل الدقة من خلال تضمين مجتمع من تسلسلات البكتيريا المعروفة في خط أنابيب DADA2 ومقارنة متغيرات تسلسل DADA2 بالتكوين المتوقع للمجتمع.
    ملاحظة: تم الآن تنظيف بيانات تسلسل الحمض النووي وجاهزة للتحليل بناء على النطاق والأهداف المحددة لمشروع البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الاختلافات السكانية بين الميكروبيوم المخاطي واللمعي للأمعاء القريبة
وجدت الدراسات السابقة اختلافات في التجمعات الميكروبية لعينات القولون اللمعية والمخاطية4،5،18. تظهر النتائج الأولية أن عينات الخزعة والنفطة الاثني عشر يمكن أن تقيس لكل من الجراثيم اللمعية والمخاطية في الأمعاء القريبة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن مجموعات الميكروبيوم هذه تختلف عن بعضها البعض (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط الأح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتبر دراسات الميكروبيوم مهمة للغاية ، حيث أن هذا النظام البيئي المعقد له دور حاسم في توازن الطاقة ، والاستجابات المناعية ، والتمثيل الغذائي19. توجد اختلافات في الميكروبيوم الإقليمي قد تعكس الوظائف الفسيولوجية المتميزة لمناطق مختلفة من الجهاز الهضمي ، والتي قد تؤثر على حالات مرضية مختلفة20. تتم دراسة ميكروبيوم البراز بشكل شائع ولكن في الآونة الأخيرة ، خضع ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة للتحقيق6،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح المالية المتنافسة للإبلاغ عنهم.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان رقم المنحة رقم RO1CA204145.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 مل من ألواح Corning430659
96 بئراالأنظمة الحيوية التطبيقية4306737
dNTPsSigmaD7295
الثلجمقدمة من المؤسسة
EG29-i10 المنظارالداخلي PentaxN / Aقد يختلف حجم المنظار اعتمادا على فسيولوجيا المريض
صفيحة دقيقة Epoch مقياس الطيفBiotekN / A
الإيثانولسيجما ألدريتش676829
HiSeq 2500IlluminaN / A
IL_806r التمهيدي العكسيIDT تقنيات الحمض النوويبادئات مخصصة
ILHS_515f التمهيدي إلى الأمامتقنيات IDT DNAبادئات مخصصة
JumpStart Taq DNASigmaD4184
مصيدة عينة المخاطمستهلكات مستشفى40540 سم مكعب مصيدة عينة مع غطاء نقل
برنامج Nanodrop Gen5ThermoFisher Scientific
PCR bufferSigmaP2192
طقم تنظيف PCRZymo ResearchD4204
فك شعاعي 4 ملقط جامبوبوسطن M00513343 العلمي2.8 مم الفك OD
استبيان غذائي VioScreenVioCareN / A
ZymoBIOMICS DNA Microprep KitZymo ResearchD430025 ug قدرة الربط
الجاف الضوئي مخصصة بوس

المراجع

  1. Kau, A., Ahern, P., Griffin, N., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474, 327-336 (2011).
  2. Young, V. B. The intestinal microbiota in health and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 28 (1), 63-69 (2012).
  3. Kolodziejczyk, A. A., Zheng, D., Elinav, E. Diet-microbiota interactions and personalized nutrition. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 742-753 (2019).
  4. Tuddenham, S., Sears, C. L. The intestinal microbiome and health. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 464-470 (2015).
  5. Dieterich, W., Schink, M., Zopf, Y. Microbiota in the Gastrointestinal Tract. Medical Sciences (Basel). 6 (4), 116(2018).
  6. Martinez-Guryn, K., et al. Small Intestine Microbiota Regulate Host Digestive and Absorptive Adaptive Responses to Dietary Lipids. Cell Host Microbe. 23 (4), 458-469 (2018).
  7. Kastl, A. J., Terry, N. A., Wu, G. D., Albenberg, L. G. The Structure and Function of the Human Small Intestinal Microbiota: Current Understanding and Future Directions. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (1), 33-45 (2020).
  8. Angelakis, E., et al. A Metagenomic Investigation of the Duodenal Microbiota Reveals Links with Obesity. PLoS One. 10 (9), 0137784(2015).
  9. Yu, L. X., Schwabe, R. F. The gut microbiome and liver cancer: mechanisms and clinical translation. Nature Reviews. Gastroenterology and Hepatology. 14 (9), 527-539 (2017).
  10. Schnabl, B., Brenner, D. A. Interactions between the intestinal microbiome and liver diseases. Gastroenterology. 146 (6), 1513-1524 (2014).
  11. Shen, T. D., Pyrsopoulos, N., Rustgi, V. K. Microbiota and the liver. Liver Transplant. 24 (4), 539-550 (2018).
  12. Hussain, S. K., et al. Dietary Protein, Fiber and Coffee Are Associated with Small Intestine Microbiome Composition and Diversity in Patients with Liver Cirrhosis. Nutrients. 12, 1395(2020).
  13. Kristal, A. R., et al. Evaluation of web-based, self-administered, graphical food frequency questionnaire. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 114 (4), 613-621 (2014).
  14. Benhammou, J. N., et al. Novel Lipid Long Intervening Noncoding RNA, Oligodendrocyte Maturation-Associated Long Intergenic Noncoding RNA, Regulates the Liver Steatosis Gene Stearoyl-Coenzyme A Desaturase As an Enhancer RNA. Hepatology Communications. 3 (10), 1356-1372 (2019).
  15. Earth Microbiome Project. 16S Illumina Amplicon Protocol. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2020).
  16. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, 590-596 (2013).
  18. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  19. Nieuwdorp, M., Gilijamse, P. W., Pai, N., Kaplan, L. M. Role of the microbiome in energy regulation and metabolism. Gastroenterology. 146 (6), 1525-1533 (2014).
  20. Jacob, N., et al. Inflammation-independent TL1A-mediated intestinal fibrosis is dependent on the gut microbiome. Mucosal Immunology. 11 (5), 1466-1476 (2018).
  21. Fujimori, S. What are the effects of proton pump inhibitors on the small intestine. World Journal of Gastroenterology. 21 (22), 6817-6819 (2015).
  22. Garcia-Tsao, G., Abraldes, J. G., Berzigotti, A., Bosch, J. Portal hypertensive bleeding in cirrhosis: Risk stratification, diagnosis, and management: 2016 practice guidance by the American Association for the study of liver diseases. Hepatology. 65 (1), 310-335 (2016).
  23. Prodan, A., Tremaroli, V., Brolin, H., Zwinderman, A. H., Nieuwdorp, M., Levin, E. Comparing bioinformatic pipelines for microbial 16S rRNA amplicon sequencing. PLoS One. 15 (1), (2019).
  24. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  25. Li, G., et al. Diversity of Duodenal and Rectal Microbiota in Biopsy Tissues and Luminal Contents in Healthy Volunteers. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 1136-1145 (2015).
  26. de Groot, P. F., et al. Distinct fecal and oral microbiota composition in human type 1 diabetes, an observational study. PLoS One. 12 (12), (2017).
  27. Kong, X., et al. New and Preliminary Evidence on Altered Oral and Gut Microbiota in Individuals with Autism Spectrum Disorder (ASD): Implications for ASD Diagnosis and Subtyping Based on Microbial Biomarkers. Nutrients. 11 (9), 2128(2019).
  28. Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing. PLOS Biology. 6 (11), 280(2008).
  29. Dethlefsen, L., Relman, D. A. Incomplete recovery and individualized responses of the human distal gut microbiota to repeated antibiotic perturbation. PNAS. 108 (1), 4554-4561 (2011).
  30. Williams, R. C., Showalter, R., Kern, F. In vivo effect of bile salts and cholestyramine on intestinal anaerobic bacteria. Gastroenterology. 69 (2), 483-491 (1975).
  31. Seto, C. T., Jeralod, P., Orenstein, R., Chia, N., DiBiase, J. K. Prolonged use of a proton pump inhibitor reduces microbial diversity: implications for Clostridium difficile susceptibility. Microbiome. 2 (42), (2014).
  32. De Luca, F., Shoenfeld, Y. The microbiome in autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 195 (1), 74-85 (2019).
  33. Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ميكروبيوم الأمعاءتحليل الميكروبيومشفط السائل الاثني عشريخزعة الاثني عشرالتنظير العلويتسلسل 16Sالميتابولومياتمحور الأمعاء والكبد

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.