التنميط الأيضي عالي الإنتاجية لتحسينات نموذج الطحالب الدقيقة

يتطلب تحسين عملية التمثيل الغذائي للطحالب من أجل إنتاج معزز ومستقر من الأيض المستهدف تطوير استراتيجيات هندسية استقلابية معقدة من خلال تحليلات على مستوى الأنظمة لشبكات التمثيل الغذائي. نماذج شبكة الأيض يمكن أن توجه تصاميم عقلانية للتطوير السريع لاستراتيجيات التحسين^1،2،3،4. على الرغم من أن ما يقرب من 160 نوعا من الطحالب الدقيقة قد تم تسلسل⁵، وهناك ، على حد علمنا ، فقط 44 نماذج التمثيل الغذائي الطحالب المتاحة^4،6،7. نظرا لصعوبة الحصول على بيانات التمثيل الغذائي عالية الإنتاجية للتحقق التجريبي من المعلومات الجينومية ، فإن إعادة بناء نماذج الشبكة عالية الجودة متخلفة عن التطور السريع لتسلسل الجينوم الطحالب.

C. reinhardtii هو نظام نموذج جذاب للدراسات القائمة على الطحالب. هذا النوع يمكن أن تنمو فوتوتوتروفيكالي أو غير مداري، وقد استخدمت على نطاق واسع ككائن حي نموذجي في البحوث الأساسية والتطبيقية. وقد نشرت تسلسل الجينوم في 2007⁸, مع نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم أعيد بناؤها في وقت لاحق للأنواع^9,10,11. تم إعادة بناء نموذج الجينوم على نطاق C. reinhardtii (iRC1080) من قبل تشانغ وآخرون. ¹⁰ استنادا إلى أدلة الجينوم والأدب (التي تنطوي على مصادر ~ 250). لديها 1,706 الأيض مع 2,190 ردود الفعل¹⁰; ومع ذلك، لم يكن من الممكن التحقق من اكتمال النموذج بما يتجاوز الأدلة التجريبية المنشورة المتاحة في ذلك الوقت.

التكنولوجيا microarrays النمط الظاهري (PMs) هي منصة عالية الإنتاجية التي يمكن أن توفر معلومات التنميط الأيضي للكائنات الحية الدقيقة غير المتغايرة وكذلك خلايا زراعة الأنسجة. على وجه الخصوص ، يمكن استخدامه لمعالجة الفجوة المعرفية من النمط الظاهري إلى النمط الجيني في الطحالب الدقيقة ، كما ذكرت لأول مرة ل Chlamydomonas reinhardtii¹² وبعد ذلك لنوع من الكلورويديوم¹³ وكلوريلا¹⁴. من خلال دراسة استجابات الخلايا لآلاف الأيضات ، والجزيئات الإشارات ، الأوسموليت ، وجزيئات التأثير ، يمكن أن توفر مقايسات PM التنميط الأيضي الوظيفي وتقدم رؤى حول الوظيفة والتمثيل الغذائي والحساسية البيئية^15و16و17. على وجه التحديد، PM المقايسات الكشف عن استخدام الخلايا المستقلب في 96-جيدا microplates مع مختلف المواد الغذائية، المستقلبات، أو الأوسموليت الواردة في كل بئر. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أيضا أن تقس الجزيئات النشطة بيولوجيا، مثل المضادات الحيوية والهرمونات. كما تحددها كثافة إنتاج الألوان من خلال الحد من NADH من صبغة الأكسدة المستندة إلى رباعي الزوليوم ، يتم تقييم الاستخدام الأيضي للركائز من حيث تنفس الخلية^15،16،17. يمكن مراقبة التجارب في 96 لوحة صغيرة بشكل جيد وتحديدها تلقائيا بمرور الوقت باستخدام منصة أداة microarray النمط الظاهري (PMI). تم تصميم 20 لوحة صغيرة من 96 بئرا لتمثيل الأيضات المشتركة لدراسة الأنماط الظاهرية الخلوية للاستفادة من مصادر الكربون والنيتروجين والكبريت والفوسفور ، إلى جانب تأثيرات مختلفة من التناضح / الأيونات والأساتذة. وقد استخدمت بنجاح التكنولوجيا PM لتحديث ورفع مستوى عدد من النماذج الأيضية القائمة على نطاق الجينوم للكائنات الحية الدقيقة^{15،16،17،18}.

يستند البروتوكول والبيانات المعروضة هنا إلى أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. ¹² العمل المعروض تفاصيل استخدام طريقة الفحص PM لتوصيف الأنماط الظاهرية الأيضية من الطحالب الدقيقة وتوسيع نموذج التمثيل الغذائي الطحالب القائمة من C. reinhardtii وكذلك لتوجيه إعادة بناء نماذج التمثيل الغذائي الجديدة.

1. تجارب ميكرواراي النمط الظاهري

1. الحصول على سلالة C. reinhardtii CC-503 من مركز موارد الكلاميدوموناس في جامعة مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية (https://www.chlamycollection.org).
2. تنمو الخلايا في الطازجة تريس أسيتات فوسفات (TAP) وسائل الإعلام¹⁹ مع تركيزات النهائي من 400 ميكروغرام / مل timentin، 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين، و 100 ميكروغرام / مل kanamycin (لمنع نمو البكتيريا) تحت 400 الفوتونات ميكرومول / م²ثانية، في 25 درجة مئوية، لمدة يومين إلى منتصف مرحلة السجل.
3. تدور أسفل الثقافة في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 22 درجة مئوية والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
4. إعداد وسائل الإعلام TAP الطازجة التي تحتوي على 0.1٪ رباعي الزوليوم صبغة البنفسجي "D".
   ملاحظة: تعديل وسائط TAP في هذه الخطوة لاستبعاد بعض العناصر الغذائية اعتمادا على فئة المستقلب التي تم اختبارها في كل لوحة (على سبيل المثال، استبعاد كلوريد الأمونيوم للوحات مصدر النيتروجين).
5. Resuspend بيليه في وسائل الإعلام TAP الطازجة المعدة (من الخطوة 1.2) إلى تركيز النهائي من 1 × 10⁶ خلايا / مل.
6. استخدام لوحات المقايسة صفيف مركب كيميائي (مصادر الكربون، مصادر النيتروجين، الفوسفور والكبريت مصادر لوحات، ومصادر النيتروجين الببتيد).
7. تلقيح a 100 ميكرولتر aliquot من الوسائط المحتوية على الخلية في كل بئر من لوحات المقايسة.
   ملاحظة: تأكد من تكرار المقايسات.
8. الخلايا المتتالية على استخراج الخميرة / لوحات بيبتون وأداء تلطيخ غرام، كما هو الحال في سميث وآخرون. ²⁰ قبل وبعد الفحص لرصد التلوث البكتيري.
9. أدخل لوحات المقايسة صفيف المركب الكيميائي في نظام القارئ microplate.
10. احتضان جميع لوحات في 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام وبرنامج نظام القارئ microplate لقراءة تغيير لون صبغ كل 15 دقيقة.
    ملاحظة: بما أن معظم قارئات اللوحات الدقيقة لا توفر مصدرا للضوء المستمر أثناء الحضانة ، يجب أن تكون الطحالب قادرة على تنفيذ التنفس غير التروفي.

2. تحليل البيانات

1. تصدير البيانات الحركية الخام من قارئ microplate كملفات CSV ، والتي سيتم استخدامها لاحقا كمدخل لحزمة Omnilog Phenotype Microarray (OPM) في R. أضف المعلومات البيولوجية كبيانات تعريفية (على سبيل المثال ، تعيين السلالة ، وسائط النمو ، درجة الحرارة ، وما إلى ذلك).
   1. استخدام برنامج تحويل البيانات الحركية PM؛ تحميل ملفات البيانات D5E وتحويلها إلى ملفات OKA باستخدام أسطر الأوامر التالية في برنامج التحليل الحركي PM:
      تحميل | استيراد (تحديد موقع المجلد من ملفات OKA) | ملء عوامل التصفية | استيراد | إضافة جميع لوحات | غلق.
      تصدير | اختيار قراءة البيانات (الحركية)، واختيار تنسيق (CSV) (رأس جدولة)،واختيار لوحات (كل لوحة (ملفات فردية)) | تصدير البيانات | أنقذ.
   2. لتنفيذ تحليل البيانات Microarray النمط الظاهري (PM) ، استخدم حزمة البرامج OPM^21،22 التي تعمل ضمن بيئة البرامج R. الحزمة، البرنامج التعليمي، والوثائق المرجعية متوفرة في: http://www.goeker.org/opm/. في RStudio، واجهة مستخدم رسومية ل R، قم بتثبيت حزمة opm وتبعياتها باستخدام الأوامر التالية:
      المصدر (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      المكتبة (opm)
   3. انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات CSV من البيانات الحركية واستيراد البيانات باستخدام الدالةopm read_:
      x <-read_opm(",تحويل="grp", تضمين=قائمة ("csv:"))
   4. تجميع وتدفير البيانات الحركية باستخدام تقدير المعلمة المنحنية.
      ل (i في 1:length(x)) {
      x [i]] <افعل _aggre(x [i]] ، التمهيد = 0 لتر ، النوى = 1 لتر ، الطريقة ="splines" ، الخيارات = set_spline_options("smooth.spline"))
      x [i]] <-do_disc(x [i]، قطع = FALSE)
      }
      #Collection بيانات التعريف
      بيانات التعريف <-collect_template(".)"
      البيانات الوصفية $Strain <-c("BLANK"," CC-503")
      ل (I في 1 :length(x)) {x [i]] <-include_metadata(x [i]] md = بيانات التعريف، استبدال = TRUE)}
   5. استخدم الدالة xy_plot لتعيين قياسات التنفس (أو النمو) (المحور ص) كدالة للوقت (المحور س) للوحات 96 بئرا المقايسة.
      الطباعة (xy_plot(x [[ 1 ]] ، وتشمل ="سلالة" ، واسور .max = FALSE))
   6. تصور البيانات كخريطة حرارية باستخدام الدالة level_plot للسماح بنظرة عامة مقارنة سريعة للبيانات الحركية.
      level_plot(x، الرئيسي = قائمة()، الألوان = opm_opt("color.borders")، لوحة.headers = البيانات الوصفية $سلالة، cex = NULL، strip.fmt = قائمة()، striptext.fmt = قائمة()، legend.sep =" "، الفضاء ="مختبر"، التحيز = 0.7، num.colors = 200 L)
   7. استخراج المعلومات البيولوجية الهامة، والمعلمات منحنى، من منحنيات الحركية الخام وتشمل مرحلة تأخر (λ)، ومعدل النمو (μ)، وتنفس الخلية القصوى (A)، والمنطقة تحت منحنى (AUC)²¹. لتحديد الأيض الإيجابي، استخدم القيم A للتحكم السلبي، والتي تمثل التفاعل اللاأحيائي للصبغة مع الوسط، بالإضافة إلى فارغة من كل لوحة ميكروويل كقيم طرح الخلفية. يتم استخدام الدالة استخراج للحصول على المعلمة A.
      opm_opt("curve.param")
      بارام <- استخراج (س، as.labels = قائمة ("سلالة")))

3. تحديد ردود الفعل والجينات المرتبطة المستقلبات الجديدة

1. البحث KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينوم) (http://www.genome.jp/kegg/) و MetaCyc (http://metacyc.org/) لتحديد أرقام لجنة الإنزيم (ECs) لردود الفعل باستخدام الأيض وجدت من صفائف المركبات الكيميائية23,24^23,24.
2. استخدام أرقام EC المحددة كأساس للبحث في موارد الشرح الطحالب المتاحة متعددة مثل معهد الجينوم المشترك (JGI)، Phytozome (http://www.phytozome.net)، والمنشورات استعراض الأقران^{23،25،26،27}.
3. إذا كان الاستعلام لا يعود أي دليل وراثي لعدد المفوضية الأوروبية معينة، وتحديد البروتينات المرتبطة ذات الصلة في الكائنات الحية الأخرى، بدءا من الأنواع الأقرب إلى C. reinhardtii،ثم إجراء بحث القائم على ملف تعريف باستخدام خادم NCBI PSI-BLAST مع الإعدادات الافتراضية واستخدام البروتينات غير زائدة عن الحاجة (nr) في C. reinhardtii (taxid:3055) لتحديد الجينات المرشحة المرتبطة رد الفعل¹².
4. تنظيم يدويا PSI-BLAST يضرب مع القيم E من < 0.05 لأهمية لرقم EC بحثت من خلال الاستعلام عن تلك الزيارات BLAST من خلال EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search)، أو InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) خوادم التنبؤ مجال البروتين. لاحظ أن الفحصين الأخيرين هما خطوتان حاسمتان لضمان تحديد النشاط الأنزيمي الصحيح للبروتين.

4. نموذج التحسين والتقييم

1. استخدام أحدث الأدوات COBRA v.3.0²⁸في ماتلاب^29,30منصة لتنفيذ الخطوات التالية لتحسين النموذج. يمكن تثبيت مربع أدوات COBRA باتباع الخطوات التالية: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . بدلا من ذلك، لاحظ أن COBRA Toolbox يتم تنفيذه أيضا عبر لغات برمجة مفتوحة المصدر أخرى، مثل Python (COBRApy³¹) ومتاح في: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .
   1. بعد تثبيت مربع أدوات COBRA v.3.0 فتح MATLAB وتنفيذ الأمر التالي تهيئة مربع الأدوات:
      إينتكوبراتولبوكس;
   2. إضافة ردود الفعل المحددة مع الجينات المرتبطة بها إلى نموذج التمثيل الغذائي، مثل IRC1080، وذلك باستخدام وظائف COBRA Toolbox addReaction و changeGeneAssociation. انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على طراز iRC1080، الذي تم تنزيله من http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 وتنفيذ الأوامر التالية لتحميل النموذج، وإعادة تسميته، وإضافة رد فعل جديد وجين مقترن به.
      تحميل('iRC 1080 .mat')
      modelNew = iRC 1080;
      modelNew = addReaction (modelNew، 'D-ALA 2'، ...
      {'d-ala[c]' ، 'ATP [ج]' ، ...
      'D-aladata [ج]' ، 'adp [ج]' ، 'بي [ج]' ، ...
      'ح [ج]' }،[- 2 - 1 1 1 1 1 ]، كاذبة)؛
      modelNEW = التغييرالاختلاء(modelNew, ...
      'D-ALA 2'،'au.g 14655 _t 1'؛
   3. في بعض الحالات عندما لا يتم إنتاج المستقلب داخل الخلايا ولكن يتم تناوله من الوسط, إضافة ردود فعل النقل للمييضات الجديدة إلى النموذج. تمثل ردود فعل النقل هذه الانتشار السلبي لم المستقلب من الوسط خارج الخلية إلى السيتوسول. بالإضافة إلى ذلك، إضافة تفاعل تبادل اصطناعي المقابلة باستخدام الدالة addExchangeRxn لإدخال أو إخراج المستقلب في الوسط خارج الخلية.
      modelNew = addReaction (modelNew، 'CYCPt'، ...
      {'cycp[e]'،'cycp[c]' }،[- 1 ]،صحيح''
      modelNew = addExchangeRxn (modelNew، 'cycp [ه]' ،- 1000، 1000 )؛
   4. اختبار سلوك النموذج الناتج الجديد، على سبيل المثال، iBD1106، من خلال إجراء تحليل توازن التدفق (FBA) باستخدام وظيفة optimizeCbModel في ظل ظروف الضوء والظلام لتحقيق أقصى قدر من الكتلة الحيوية كوظيفة الهدف. للنمو الخفيف، حدد الحدود السفلية والعليا لتفاعلات الضوء PRISM الشمسية إلى 646.07 (الحد الأقصى للسعر). للنمو المظلم، تعيين حدود جميع ردود الفعل ضوء PRISM إلى الصفر. استخدم وظيفة الكتلة الحيوية المحددة سابقا¹⁰ للنمو في ظل ظروف الظلام والضوء. سيؤدي حل FBA إلى إخراج ناقلين متوافقين مع تدفقات التفاعل (solution.v) وخفض التكلفة (solution.w) ، بالإضافة إلى ناقل واحد مقابل لأسعار ظل الأيض (solution.y).
      ٪محاكاة النمو في ظل ظروف الإضاءة:
      modelNew = changeRxnBounds (modelNew،{ ...
      ٪ 'PRISM_solar_litho'، ...
      "PRISM_solar_exo" ، ...
      'PRISM_incandescent_ 60 W' ، ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' ، ...
      "PRISM_metal_halide" ، ...
      "PRISM_high_pressure_sodium" ، ...
      "PRISM_growth_room" ، ...
      "PRISM_white_LED" ، ...
      'PRISM_red_LED_array_ 653 نانومتر' ، ...
      'PRISM_red_LED_ 674 نانومتر' ، ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' ، ...
      "PRISM_design_growth" ، ...
      }, 0, 'ب');
      modelNew = التغييرالجهازة(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = الأمثلCbModel (modelNew، 'ماكس')؛
   5. كرر الخطوة 4.1.4 ل iRC1080 لمقارنة حلول FBA التي تم الحصول عليها ل iBD1106 مع تلك التي تم الحصول عليها ل iRC1080.
   6. هناك مجموعة من أساليب COBRA المتاحة التي يمكن استخدامها لمقارنة النماذج (على سبيل المثال، تحليل تقلب التدفق، ودراسات حذف الجينات، وتحليلات المتانة، والتنبؤات انقسام التدفق، FBA، وأخذ العينات، وما إلى ذلك). يمكن العثور على دروس مفصلة في https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. هنا، يتم توفير مثال حيث تتم مقارنة نموذج IRC1080 مع نسخته المكررة، iBD1106، من خلال الحصول على أسعار الظل (حساسية الوظيفة الموضوعية للكتلة الحيوية للتغيرات في متغير النظام) من الأيضات التي تم حسابها في كل نموذج.
      الحصول على أسعار الظل للم المستقلبات:
      shadowPrices = الجدول (modelNew.mets، ...
      modelNew.metNames، FBAsolutionNew.y)؛

عرض النمط الظاهري Microarray لنموذج الطحالب الكلاميدوموناس راينهارتي
تختبر فحوصات رئيس الوزراء قدرة الطحالب على استخدام مصادر مختلفة من الكربون والنيتروجين والكبريت والفوسفور في الحد الأدنى من المتوسط. في وصف هذه الأساليب، أظهرنا كيف تم استخدام المقايسات PM لتحديد استقلاب الكربون والنيتروجين. تم قياس حركية استخدام الكربون والنيتروجين باستخدام قارئ ميكروبليت. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج PMI. تظهر الحركية الموجزة للوحة المقايسة المختارة من بعد الظهر (PM01 وPM03) في الشكل 1. تعرض "مؤامرات xy" قياسات التنفس بمرور الوقت المرسومة لمقاايسات اللوحات المكونة من 96 بئرا، حيث يمثل المحور ص ومحور س قيم القياسات الخام والوقت، على التوالي. تم تحويل البيانات إلى نمط خريطة الحرارة لتحليل تجميع البيانات الحركية نسبيا.

خط أنابيب من شبكة التكرير الأيضية على نطاق الجينوم باستخدام بيانات PM (الشكل 2) يوضح تكامل المقايسات PM عالية الإنتاجية مع الأدلة التجريبية التي تقدمها عمليات البحث الجينومي يمكن توسيع نموذج شبكة التمثيل الغذائي.

لتحديد إمكانية استنساخ بيانات PM التي تم الحصول عليها من لوحات PM01 - 04 و PM10 ، تم تحليل انحدار خطي لرسم البيانات من تجربتي تكرار مستقلتين ضد بعضها البعض(الشكل 3). ويبين الشكل 3 أن غالبية البيانات كانت متشابهة تقريبا لأنها تقع على خط 45 درجة، مع وجود عدد قليل فقط من القيم المتطرفة، وكان معامل تحديدها R2 هو 0.9. يتم التحقق من اتساق وقابلية استنساخ التجارب للطحالب من خلال هذه المؤامرة.

تحديد الأيض الجديد
وحدد فحص رئيس الوزراء 662 مستقلبات في سبع لوحات؛ PM01-PM04 وPM06-PM08، في حين أن الغاز كروماتوغرافيا وقت الطيران (GC-TOF) قد حددت 77 المستقلبات32 (الشكل 4). عند مقارنة هاتين المجموعتين مع 1068 الأيضات التي شكلت في IRC1080, تداخلت ستة فقط الأيض بين المجموعات الثلاث, و 149 تداخلت بين IRC1080 ورئيس الوزراء. هذه النتيجة يدل على أن منصة التنميط الأيضي يمكن أن يكون مصدرا هاما للمعلومات الأيضية الجديدة.

كان حمض الخليك مصدر الكربون الوحيد الذي تم اكتشافه في لوحة PM01 ككربون داعم بعد طرح إشارة الخلفية. هذه النتيجة تتفق مع الأدب33 ويظهر خصوصية المقايسات PM. كشفت فحوصات رئيس الوزراء عن مصادر جديدة للكبريت والفوسفور والنيتروجين يمكن أن يستخدمها C. reinhardtii للنمو. وكانت الأيض الكبريت كبريتات، ثيوسلفيت، رباعي الثيرثيونات، وDL-ليبواميد. وكانت مصادر الفوسفور هي ثيوفوسفات، وديثيوفوسفات، وحمض د-3-فوسفو-غليسريك، وسيستامين-إس-فوسفات. وكانت الأيضات مصدر النيتروجين L-الأمينية والأحماض الأمينية D, بما في ذلك الأحماض الأمينية أقل شيوعا; L-homoserine, L-بيروجلوتاميك, ميثيلامين, الإيثيلامين, الإيثانولامين, و D,L-α-أمينية-بوتيريك, و 108 دي الببتيدات وخمسة ثلاثي الببتيدات (الجدول 1). تم البحث في جميع الأيضات التي تم تحديدها حديثا في KEGG و MetaCyc عن ردود الفعل المرتبطة بها وأرقام المفوضية الأوروبية والمسارات.

وارتبطت المستقلبات الجديدة 128 مع 49 أرقام المفوضية الأوروبية فريدة من نوعها. ومن بين هذه الأجهزة، ارتبطت 15 شركة من هذه المركبات بالأدلة الجينومية باستخدام خمسة مصادر منها؛ و 15 من هذه المركبات، بما في ذلك المركبات التي تستخدمها في مجال المركبات؛ و 15 من هذه المصادر، بما في ذلك المركبات التي تستخدمها Phytozome الإصدار 10.0.234 JGI الإصدار 435، AUGUSTUS 5.0 ، و 5.210 التعليقات التوضيحية من Manichaikul وآخرون. 36 وKEGG13. تم إدخال الأيض دون أدلة الجينوم في موقع الموارد البروتين العالمي (UniProt، http://www.uniprot.org/)37،38 حيث تم العثور على تسلسلات ذات الصلة في الكائنات الحية الأخرى. تم تحديد التسلسلات المتجانسة في C. reinhardtii عن طريق تشغيل BLAST Iterated الخاص بالموقع (PSI-BLAST، https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) من موقع NCBI بالنظر فقط إلى التسلسلات التي أنتجت محاذاة كبيرة (القيمة E <0.005).

تحسين النموذج
تمت إضافة ردود الفعل المرتبطة بالميثابات ال 128 الجديدة ، إلى جانب جيناتها المشفرة ، إلى نموذج iRC1080 ، مما وسع الشبكة. النموذج الناتج iBD1106, تمثل 2,444 ردود الفعل, 1,959 الأيض, و 1,106 الجينات (الجدول 2). وكانت ردود الفعل الجديدة 254 وأضاف 20 تفاعلات أكسدة الأحماض الأمينية، 108 دي الببتيد التحلل المائي ردود الفعل، وخمسة ردود فعل التحلل المائي تريببتيد، و 120 ردود فعل النقل، المشفرة من قبل أربعة جينات (Cre02.g096350.t1.3، au.g14655_t1، e_gwW.1.243.1، Cre12.g486350.t1.3).

وأضاف ما مجموعه 113 ردود فعل جديدة لحساب التحلل المائي من دي الببتيدات وثلاثي الببتيدات. ويرتبط التحلل المائي للدي الببتيدات وثلاثي الببتيدات مع اثنين من الجينات، واحدة لدي الببتيدات (Cre02.g078650.t1.3) وواحدة للببتيدات الثلاثية (Cre16.g675350.t1.3).

وفيما يتعلق بمصادر الفوسفور، أضيف تفاعل للتحلل المائي للسيستامين - S - الفوسفات إلى السيستامين والفوسفات المرتبطة JLM_162926 الجينية.

أداة WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) والنتائج التي أبلغ عنها غامساري وآخرون. 35 تم تطبيقها للحصول على مواصفات المقصورات الخلوية حيث تحدث ردود الفعل الجديدة. من خلال تحليل تسلسل البروتين المرتبطة ردود الفعل الجديدة، وتوقع WoLF PSORT السيتوسول كمقصورة الخلوية لردود الفعل.

قد يحتوي نموذج التمثيل الغذائي المتولد على فجوات عندما تكون المعلومات الكيميائية الحيوية غير كاملة. في مثل هذه الحالات، يتم استخدام gapFind، وهو أمر COBRA. وهو يسرد الثغرات الجذرية ويسمح بتحديد الثغرات الجديدة في النموذج الجديد. ويشار إلى الأيض التي لا يمكن إنتاجها في نموذج الأيض والفجوات الجذرية40،41. تحليل الفجوة الجذرية أشار إلى أن كلا من IRC1080 و iBD1106 نماذج تحتوي على نفس الفجوات 91. وهذا يدل على أن إضافة الأيض الجديدة وردود الفعل المرتبطة بها لم يقدم أي فجوات الجذر إضافية. وتجدر الإشارة إلى أن طريقة phenotyping المستخدمة في هذا البروتوكول لا تسد الفجوات الجذرية، لأن الأيضات الفجوة الجذرية الأصلية تفتقر إلى آليات النقل أو الإنتاج، والتي لم تعالج في المقايسات phenotyping. تم إجراء تحليل توازن التدفق لاختبار السلوك الأيضي ل iBD1106 في ظل ظروف خفيفة ومظلمة؛ (لا خلات) و (مع خلات)، على التوالي. تزيد الخوارزمية من تفاعلات سلائف الكتلة الحيوية لوظيفة موضوعية (نمو الكتلة الحيوية). لتقييم مشاركة كل مستقلب إلى وظيفة الهدف المحدد, تم حساب "أسعار الظل" لجميع الأيض. التغير في الوظيفة الموضوعية المتعلقة بتغيرات التدفق للم المستقلب يحدد سعر الظل للم المستقلب30،42. ويمكن تحديد الإشارة إلى ما إذا كان المستقلب "زائدا" أو "يحد" من الوظيفة الموضوعية من خلال تحليل الأسعار الظلية، مثل إنتاج الكتلة الحيوية. القيم السلبية أو الإيجابية سعر الظل تكشف الأيض التي، عند إضافة، سوف يقلل أو زيادة وظيفة الهدف. صفر قيم أسعار الظل تكشف الأيض التي لن تؤثر على وظيفة الهدف. وتبين مقارنة أسعار الظل بين iBD1106 و iRC1080 في الشكل 5 أنه لا يلاحظ حدوث تغير كبير بالنسبة لمعظم الأيضات؛ على الرغم من ذلك، تم العثور على اختلافات في 105 و 70 حالة في ظل ظروف النمو الخفيفة والداكنة، على التوالي. ويتضمن الجدول 4 أمثلة على هذه الأيضات.

الشكل 1: فينوتبيك microarray التنميط من C. reinhardtii. التنفس XY-المؤامرات والمؤامرات مستوى من PM01 (مصادر الكربون; A، C) وPM03 (مصادر النيتروجين؛ B, D) تظهر لوحات المقايسة. الرقم هو صفيف 8x12 حيث تمثل كل خلية لوحة جيدة ، وبالتالي ، بيئة مستقلب أو نمو معينة. داخل كل خلية أو تمثيل جيد، تمثل المنحنيات تحويل الصبغة عن طريق التخفيض (المحور ص) كدالة للوقت (المحور س). تظهر منحنيات التنفس PM من CC-503 والآبار الفارغة في كل خلية ويشار إليها بالألوان (يمثل لون البط البري آبار فارغة ويمثل اللون الأرجواني CC-503). يمثل مخطط المستوى كل منحنى تنفس كخط أفقي رفيع يتغير لونه (أو يبقى دون تغيير) بمرور الوقت. تغييرات لون خريطة الحرارة هي من الأصفر الفاتح (حدث القليل من التنفس أو لا) إلى البرتقالي الداكن أو البني (حدث تنفس كبير). يتم عرض الأيض المستخدمة من قبل C. reinhardtii (CC-503) ولوحات فارغة. هذا الرقم هو من عمل نشر سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل 2: الجينوم على نطاق خط أنابيب تحسين شبكة التمثيل الغذائي باستخدام بيانات PM. بعد إجراء اختبارات مركبة جديدة إيجابية في فحص PM ، يتم تحديد رقم لجنة الإنزيم (EC) ، والتفاعل ، والمسار من قواعد البيانات المتاحة ، على سبيل المثال ، KEGG و MetaCyc. ثم يتم استخراج الأدلة الجينومية من موارد الجينوم والشروح عندما تكون متاحة وتشكل حلقة وصل بين النمط الجيني والنمط الظاهري. عندما لا تتوفر الأدلة الجينومية المباشرة، يتم تحديد تسلسل البروتين من أرقام المفوضية الأوروبية، ويتم تحديد الأدلة الجينية عن طريق PSI-Blast. ثم يتم صقل شبكة التمثيل الغذائي التي أعيد بناؤها على أساس المركبات التي تم تحديدها حديثا ، ولكن فقط بعد خطوة مراقبة الجودة التي تنطوي على الاستعلام عن مجالات البروتين باستخدام قواعد البيانات ذات الصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال نشرت سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل 3: استنساخ اختبارات PM. تم جمع قيم مؤشر مديري المشتريات على مدى فترة 168 ساعة، وتم رسم الحد الأقصى لقيم مؤشر مديري المشتريات لدرايتين متماثلتين. يمثل كل محور قيم مؤشر مديري المشتريات القصوى لكل دراسة (محور س هو دراسة واحدة متماثلة والمحور ص آخر). القيم المستنسخة متساوية البعد عن كل محور. تمثل كل نقطة قيمة الحد الأقصى واحد. تم تنفيذ الانحدار الخطي بواسطة برنامج جدول بيانات، ويظهر معامل التحديد الناتج (R2). وقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال نشرت سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل 4: رسم تخطيطي Venn من الأيض. يعدد الرسم البياني Venn الأيضات التي حددتها لوحات PM ، ونموذج الأيض iRC1080 ، ووقت كروماتوغرافيا الغاز للتجارب (GC-TOF). كل دائرة تشير إلى العدد الإجمالي من الأيض الموجودة في كل طريقة من طرق الدراسة. وفي الوقت نفسه، تمثل المناطق المتداخلة عدد الأيضات المشتركة بين تلك الأساليب. نموذج الأيض IRC1080 يحتوي على ما مجموعه 1,068 المستقلبات فريدة من نوعها. حددت GC-TOF ما مجموعه 77 المستقلبات32, في حين أن هناك ما مجموعه 662 الأيض التي تم تحديدها باستخدام لوحات PM. هذا الرقم مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: أسعار الظل من الأيض في IRC1080 و IBD1106 في ظل ظروف مختلفة لتحقيق أقصى قدر من الكتلة الحيوية. كل دائرة على "مؤامرات الرادار" يتوافق مع قيمة سعر الظل، في حين أن كل سطر يمتد من وسط مؤامرة يشير إلى المستقلب. (أ) أسعار الظل والسلوكيات الأيضية من iRC1080 و IBD1106 في ظل حالة نمو خفيفة؛ (ب) ، والسلوكيات الأيضية المختلفة من IRC1080 وIBD1106 في ظل حالة نمو مظلمة. هذا الرقم مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة من الأيض استخدام الركيزة الإيجابية المحددة (C, P, S, N) غير موجودة في نموذج التمثيل الغذائي IRC1080.   *لم يتم تضمين رد الفعل إذا لم يتم التعرف على أي جين.  1 Phytozome الإصدار 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI الإصدار 4 35.  3 أوغسطس الإصدار 510.  4 كي جي جي (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI الإصدار 3.136.  هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12

الجدول 2: محتويات IRC1080 و iBD1106.  هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12

الجدول 3:ملخص ردود الفعل الجديدة في iBD1106. هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12

الجدول 4: مثال على أسعار الظل الكبيرة ل iRC1080 و iBD1106. هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.