مقالة منهجية

زينوبوس لايفيس تحضير مستخلص البيض وطرق التصوير الحية لتصور التنظيم السيتوبلازمي الديناميكي

DOI:

10.3791/61923

⸱

يونيو 6, 2021

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طريقة لإعداد والتصوير الحي للمقتطفات السيتوبلازمية غير المخففة من بيض Xenopus laevis .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا للمقايسات البيوكيميائية السائبة ، وقد ظهرت كأداة قوية قائمة على التصوير لدراسة الظواهر السيتوبلازمية ، مثل التحريك الخلوي وتشكيل المغزل الانقسامي وتجميع النواة. بناء على الطرق المبكرة التي صورت المستخلصات الثابتة التي تم أخذ عينات منها في نقاط زمنية متفرقة ، تقوم الأساليب الحديثة بتصوير المقتطفات الحية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني ، مما يكشف عن ميزات أكثر ديناميكية مع دقة زمنية محسنة. تتطلب هذه الطرق عادة معالجات سطحية متطورة لوعاء التصوير. نقدم هنا طريقة بديلة للتصوير الحي لمستخلصات البيض التي لا تتطلب معالجة سطحية كيميائية. من السهل تنفيذ واستخدام المواد الاستهلاكية المختبرية ذات الإنتاج الضخم للتصوير. وصفنا نظاما يمكن استخدامه لكل من الفحص المجهري واسع المجال والبؤر. وهي مصممة لمقتطفات التصوير في مجال ثنائي الأبعاد (2D) ، ولكن يمكن تمديدها بسهولة إلى التصوير في 3D. إنه مناسب تماما لدراسة تكوين النمط المكاني داخل السيتوبلازم. من خلال البيانات التمثيلية ، نوضح التنظيم الديناميكي النموذجي للأنابيب الدقيقة والنوى والميتوكوندريا في مستخلصات الطور البيني المحضرة باستخدام هذه الطريقة. يمكن أن توفر بيانات الصور هذه معلومات كمية عن ديناميكيات السيتوبلازم والتنظيم المكاني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل السيتوبلازم الحجم الرئيسي للخلية وله تنظيم متميز. يمكن أن تتجمع مكونات السيتوبلازم حقيقي النواة ذاتيا في مجموعة واسعة من الهياكل المكانية ، مثل زهور النجمة microtubule وجهاز Golgi ، والتي بدورها يتم ترتيبها ديناميكيا وقلبها اعتمادا على هوية الخلية وحالتها الفسيولوجية. وبالتالي فإن فهم التنظيم المكاني للسيتوبلازم وارتباطه بالوظائف الخلوية مهم لفهم كيفية عمل الخلية. تم استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis تقليديا في المقايسات البيوكيميائية السائبة1،2،3،4،5،6،7،8 ، لكن العمل الأخير يؤسسها كنظام تصوير حي قوي للدراسات الميكانيكية للهياكل السيتوبلازمية ووظائفها الخلوية9،10،11 ، 12،13،14،15،16،17،18. تحافظ هذه المستخلصات غير المخففة على العديد من هياكل ووظائف السيتوبلازم ، مع السماح بالتلاعب المباشر بمحتويات السيتوبلازم التي لا يمكن تحقيقها في النماذج التقليدية القائمة على الخلايا19,20. هذا يجعلها مثالية لتوصيف الظواهر السيتوبلازمية وتشريح أسسها الميكانيكية.

تتطلب الطرق الحالية لمستخلصات التصوير تعديلات على السطح الكيميائي ، أو تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة. تتطلب إحدى الطرق القائمة على غطاء الغطاء تخميل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لأغطية الزجاج21. تتطلب الطريقة القائمة على المستحلب الدقيق ترسب بخار ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الأسطح الزجاجية22,23. تسمح الأنظمة القائمة على الموائع الدقيقة بالتحكم الدقيق في حجم وهندسة وتكوين قطرات الاستخراج ، ولكنها تتطلب مرافق تصنيع دقيقة متخصصة11،12،24.

نقدم هنا طريقة بديلة لتصوير مستخلصات البيض سهلة التنفيذ وتستخدم مواد متاحة بسهولة ومنخفضة التكلفة. يتضمن ذلك تحضير غرفة تصوير مع شريحة وغطاء مغطى بشريط بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP). يمكن استخدام الغرفة لتصوير المستخلصات مع مجموعة متنوعة من أنظمة الفحص المجهري ، بما في ذلك المجاهر المجسمة والمجاهر المستقيمة والمقلوبة. لا تتطلب هذه الطريقة أي معالجة كيميائية للأسطح مع تحقيق وضوح بصري مماثل تم الحصول عليه باستخدام الطرق القائمة على الزجاج التي تمت مناقشتها أعلاه. وهي مصممة لتصوير طبقة من مقتطفات بسمك موحد عبر حقل 2D ، ويمكن تمديدها بسهولة لتصوير حجم 3D من المستخلصات. إنه مناسب تماما للتصوير بفاصل زمني للسلوك السيتوبلازمي الجماعي على مجال رؤية كبير.

لقد استخدمنا مستخلصات البيض البينية المحتجزة لتوضيح طريقة التصوير لدينا. يتبع إعداد المستخلص بروتوكول Deming و Kornbluth19. باختصار ، يتم سحق البيض الذي يتم القبض عليه بشكل طبيعي في الطور الاستوائي من الانقسام الاختزالي الثاني عن طريق الدوران بسرعة منخفضة. يطلق هذا الدوران السيتوبلازم من الاعتقال الاختزالي ويسمح للمستخلص بالمضي قدما في الطور البيني. عادة ، يتم إضافة السيتوكلاسين B قبل الدوران الساحق لمنع تكوين F-actin. ومع ذلك ، يمكن حذفه إذا كان F-actin مطلوبا. يضاف Cycloheximide أيضا قبل الدوران الساحق لمنع مستخلص الطور البيني من دخول الانقسام التالي. يتم وضع المستخلصات لاحقا في غرف التصوير المذكورة أعلاه وتوضع على المجهر. أخيرا ، يتم تسجيل الصور بمرور الوقت على فترات زمنية محددة بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر ، مما ينتج عنه سلسلة صور بفاصل زمني تلتقط السلوك الديناميكي للمستخلص في حقل 2D.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة ستانفورد.

1. إعداد الشرائح وأغطية

  1. ضع طبقة من الشريط اللاصق الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) على شريحة زجاجية باستخدام قضيب الأسطوانة. قطع الشريط الزائد على الحواف بشفرة حلاقة نظيفة. قم بإعداد أغطية مغلفة بشريط FEP بنفس الطريقة (الشكل 1 أ).
  2. ضع فاصل تصوير لاصق على الوجهين على الجانب المطلي بشريط FEP من الشريحة. اترك البطانة الواقية في الأعلى غير مقشرة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يجب تحضير الشرائح وأغطية الغلاف قبل التجربة. يمكن استخدامها على الفور ، أو تخزينها في صناديق لمنع تراكم الغبار على الأسطح. يبلغ عمق البئر في فاصل التصوير 120 ميكرومتر وقطره 9 مم.

2. التحضير والتصوير الحي لمستخلصات البيض البينية

ملاحظة: تم تكييف البروتوكول التالي من Deming و Kornbluth19 و Murray20 و Smythe و Newport25 مع تعديلات. يجب تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. قبل ثلاثة إلى عشرة أيام من جمع البويضات ، قم بحقن أنثى ضفادع Xenopus laevis الناضجة تحت الجلد في الكيس الليمفاوي الظهري مع 100 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل (PMSG).
  2. قبل ستة عشر إلى ثمانية عشر ساعة من جمع البيض المخطط له ، قم بحقن الضفادع من الخطوة 2.1 ب 500 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية (hCG). اترك الضفادع عند 18 درجة مئوية في مخزن وضع البيض (100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مللي متر KCl ، 1 مللي متر MgSO 4 · 7H 2 O ، 2.5 ملليمتر CaCl 2 · 2H2 O ، 0.5 ملي متر HEPES، 0.1 مللي متر EDTA ، تحضير كمحلول مخزون 20x عند درجة حموضة7.4 وتخفيفه بماء خزان الضفدع النظيف إلى 1x قبل الاستخدام) حتى جمع البيض.
  3. في يوم التجربة ، اجمع البيض في طبق بتري زجاجي كبير وقم بتقييم جودة البيض. تخلص من أي بيض يشبه الكرات البيضاء المنتفخة أو يظهر في خيط (الشكل 1 ب). افحص البيض تحت مجسمة ، واحتفظ بالبيض بمظهر طبيعي (الشكل 1C) ، وتخلص من البيض ذي الصبغة غير المنتظمة أو المرقطة (الشكل 1 د).
    ملاحظة: يعمل هذا البروتوكول مع البيض الذي يتم جمعه من ضفدع واحد ، والذي يضع عادة 25 مل من البيض بعد 16 ساعة من حقن قوات حرس السواحل الهايتية. عادة ، يتم تحفيز ما مجموعه 3 إلى 6 ضفادع بواسطة قوات حرس السواحل الهايتية ، ويتم اختيار الضفدع ذو أعلى جودة للبيض لتجربة تحضير المستخلص.
  4. انقل البيض إلى دورق زجاجي سعة 400 مل ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت لوضع البيض عن طريق الصب.
  5. احتضن البيض في 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج (2٪ وزن / وزن L-cysteine في الماء ، واضبطه على درجة الحموضة 8.0 باستخدام NaOH) وقم بتحريكه برفق بشكل دوري. بعد حوالي 3 دقائق ، اسكب المحلول ، وأضف 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج. استمر في الحضانة حتى يتم تعبئة البيض بإحكام (لا توجد مسافة بين البيض) ، ولكن تجنب ترك البيض في محلول إزالة الشوائب لأكثر من 5 دقائق.
  6. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول إزالة الشوائب عن طريق الصب ، واغسل البيض في محلول 0.25x MMR (25 mM NaCl ، 0.5 mM KCl ، 0.25 mM MgCl 2 ، 0.5 mM CaCl2 ، 0.025 mM EDTA ، 1.25 mM HEPES ، محضر كمحلول مخزون 10x ، معدل إلى درجة الحموضة 7.8 مع NaOH ، ومخفف في ماء Milli-Q قبل الاستخدام) عن طريق إضافة المخزن المؤقت ، تحريك البيض ، ثم سكب المخزن المؤقت. كرر عدة مرات حتى يتم استخدام ما مجموعه 1 لتر من المخزن المؤقت للغسيل.
  7. اغسل البيض عدة مرات بإجمالي 400 مل من محلول تحلل البيض (250 ملي مول سكروز ، 10 مللي مول HEPES ، 50 مللي مول KCl ، 2.5 ملي متر MgCl2 ، 1 مللي مول DTT ، مصنوع طازجا ومعدلا إلى درجة الحموضة 7.7 مع KOH). قم بإزالة البيض ذي المظهر غير الطبيعي باستخدام ماصة باستور بين الغسيل.
    ملاحظة: يشير البيض ذو المظهر غير الطبيعي إلى تلك التي تشبه الكرات البيضاء المنتفخة (الشكل 1 ب) ، أو لديها تصبغ مرقش (الشكل 1 د) ، أو تتدهور مع نمو منطقة بيضاء (الشكل 1 ه) ، أو تظهر منطقة مصطبغة داكنة ومتقلصة في نصف الكرة الحيوانية (الشكل 1F).
  8. باستخدام ماصة نقل مع قطع طرفها على مصراعيها ، انقل البيض إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 17 مل يحتوي على 1 مل من محلول تحلل البيض. قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري بسرعة 400 × جم لمدة 15 ثانية لتعبئة البيض.
  9. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تحلل البيض من أعلى البيض المعبأ باستخدام ماصة باستور.
    ملاحظة: من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت من البيض المعبأ ، من أجل تقليل تخفيف مستخلص البيض. في بعض الأحيان يكون من الضروري إزالة بعض البيض السائب مع المخزن المؤقت المتبقي لتحقيق ذلك.
  10. حدد الحجم التقريبي للبيض المعبأ ، ثم أضف 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من السيتوكلاسين B ، و 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد مباشرة فوق البيض المعبأ.
    ملاحظة: أبروتينين وليوببتين مثبطات الأنزيم البروتيني. يمنع Cytochalasin B بلمرة الأكتين ، مما يمنع المستخلص من الانقباض والتبلور26. Cycloheximide يمنع تخليق البروتين ، وبالتالي الحفاظ على المستخلص في الطور البيني لدورة الخلية.
  11. سحق البيض عن طريق طرد الأنبوب بالطرد المركزي عند 12000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 15 دقيقة ، في دوار دلو متأرجح.
    ملاحظة: في نهاية الطرد المركزي ، يجب أن يكون البيض قد تمزق وانفصل المحللة إلى ثلاث طبقات رئيسية: طبقة دهنية صفراء في الأعلى ، ومستخلص السيتوبلازم (يسمى أيضا المستخلص الخام) في المنتصف ، وطبقة كثيفة داكنة تحتوي على حبيبات الصباغ في الأسفل (الشكل 1G).
  12. نعلق إبرة قياس 18 إلى حقنة. مع توجيه طرف الإبرة لأسفل ، قم بثقب الأنبوب من الجانب الموجود أسفل الطبقة السيتوبلازمية ، واستعد المستخلص عن طريق السحب ببطء.
    ملاحظة: ارسم المستخلص السيتوبلازمي ببطء لتجنب إدراج محتوى ملوث من طبقة الدهون الصفراء.
  13. نقل مستخلص السيتوبلازم المستعاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد والاحتفاظ به على الجليد. استخدم المستخلص في غضون 1 ساعة.
  14. عندما تكون جاهزا للتصوير ، استكمل المستخلص بالكواشف المرغوبة ومجسات التصوير الفلوري.
    ملاحظة: تقوم مجسات التصوير الفلوري بتسمية هياكل سيتوبلازمية محددة بحيث يمكن تصورها بواسطة مجهر مضان.
  15. قم بإزالة البطانة الواقية العلوية من فاصل التصوير على الشريحة المعدة في الخطوة 1.2 ، وقم بإيداع ما يقرب من 7 ميكرولتر من المستخلص في وسط البئر. ضع على الفور غطاء FEP المطلي بالشريط بحيث يكون جانب FEP مواجها للمستخلص لإغلاق البئر. انتقل بسرعة إلى التصوير (الشكل 1H ، I).
  16. اضبط الشريحة على مجهر مقلوب أو مستقيم باستخدام منصة آلية وكاميرا رقمية. قم بتصوير المقتطفات في المواضع المكانية والفترات الزمنية المرغوبة في كل من قنوات المجال الساطع والتألق.
    ملاحظة: عادة ما يتم استخدام هدف 5x للتصوير. تتيح المرحلة الآلية الحصول الآلي على الصور في مواقع مكانية محددة متعددة. يصور الفحص المجهري ذو المجال الساطع الهياكل السيتوبلازمية بدرجات مختلفة من الشفافية. يصور الفحص المجهري الفلوري الهياكل السيتوبلازمية المسماة على وجه التحديد بواسطة مجسات التصوير الفلوري المضافة في الخطوة 2.14. تسجل الكاميرا صورا بفاصل زمني لهذه الهياكل ، وبالتالي تلتقط ديناميكيات التنظيم السيتوبلازمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام مستخلصات بيض Xenopus laevis لدراسة التنظيم الذاتي للسيتوبلازم أثناء الطور البيني. يوضح الشكل 2 أ نتائج تجربة ناجحة. قمنا باستكمال المستخلصات البينية المقبوضة بنوى الحيوانات المنوية Xenopus laevis 19 بتركيز 27 نواة / ميكرولتر و 0.38 ميكرومتر منقى GST-GFP-NLS27،28،29،30 (بروتين اندماج يتكون من الجلوتاثيون-S-trans...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت مستخلصات البيض Xenopus laevis كنظام نموذجي قوي للدراسات القائمة على التصوير لمختلف الهياكل تحت الخلوية10،14،15،16،17،18،21،31،32،33،34،35،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ج. كامينز و Y. Chen و W. Y. C. HUANG على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM110564 و P50 GM107615 و R35 GM131792) الممنوحة لجيمس إي فيريل جونيور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب طرد مركزي 17 ملبيكمان كولتر337986
22 × 22 مم مربع # 1 غطاء زجاجيكورنينج284522
أبروتينينميليبورسيجما10236624001مثبط البروتياز
CycloheximideMilliporeSigma01810مثبط تخليق البروتين
Cytochalasin BMilliporeSigmaC6762Actin مثبط البلمرة
أنثى Xenopus laevis< / em> الضفادع NascoLM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 المسمى بروتين التوبولينCytoskeleton، Inc.TL488M-Aلتصور الهيكل الخلوي للأنابيب
الدقيقة الفلورسنت HiLyte 647 المسمى بروتين التوبولينCytoskeleton، Inc.TL670M-Aلتصور الهيكل الخلوي
الدقيقة الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) الشريط الشفاف بصرياHyde company23-FEP-2-5
ماصة باستور زجاجيةفيشر Scientific13-678-20C
الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG)MilliporeSigmaCG10
فاصل التصويرعلوم المجهر الإلكتروني70327-8S
ليوببتينميليبورسيجما11017101001مثبط البروتياز
مجهر شرائحفيشر ساينتفيك12-518-100B
زيت معدنيMilliporeSigma330760
MitoTracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512لتصور الميتوكوندريا
مصل الفرس الحامل موجهة الغدد التناسلية (PMSG)قضيبRP1782725000
AmazonB07HMBJSP8لتطبيق شريط FEP على الشرائح الزجاجية وأغطية
شفرات الحلاقة أحاديةFisher Scientific12-640لإزالة ماصة نقل شريط FEP المفرطة
فيشر Scientific13-711-7M
للأنابيب CS موجهة الأسطوانة BioVendor الحواف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus FEP

مقالات ذات صلة