يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج ثقافة الخلية Adipocyte لدراسة تأثير البروتين وتعديل الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة Adipocyte
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.
المقدمة
تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية1. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من الدراسات البحثية دور الحمض النووي الريبي ترميز البروتين في فسيولوجيا الخلايا الدهنية وارتباطها مع السمنة.
وفي الآونة الأخيرة، أدى اكتشاف الرناس غير الترميزي، ولا سيما الرنانات الصغرى، إلى صياغة مفاهيم جديدة تتعلق بآلية تنظيم برامج التعبير الجيني. وقد أظهرت الدراسات أن ncRNAs هي المنظمين المهمين لوظيفة adipocyte، وأن dysregulation بهم يلعب دورا هاما في أمراض التمثيل الغذائي4. وبالتالي ، فإن التلاعب بالبروتينات وnCRAS في الخلايا الدهنية أمر بالغ الأهمية لفك أدوارها في وظيفة الخلايا الدهنية وتأثيرها على الأمراض مثل T2D. ومع ذلك ، فإن التلاعب في التعبير عن البروتينات وnCRAS في الجسم الحي وكذلك في الخلايا الدهنية الأولية لا يزال صعبا للغاية ، ويفضل استخدام نماذج الخلايا الدهنية في المختبر.
مورين 3T3-L1 الخلايا الليفية تفرق بسهولة إلى الخلايا الدهنية ناضجة، وظيفية، واستجابة للأنسولين، والتي هي خط الخلية ذات الخصائص الجيدة المستخدمة لدراسة وظيفة adipocyte (على سبيل المثال، إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، انحلال الدهون وإفراز الدهون)5،6،7،8،9،10. هذه الخصائص تجعل 3T3-L1 adipocytes نموذجا جذابا لتعديل التعبير عن البروتين الترميز وNNC-RNAs لفك دورها في وظيفة الدهون ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة. لسوء الحظ ، في حين أن الخلايا الليفية 3T3-L1 سهلة التحميب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، فإن الخلايا الدهنية 3T3-L1 المتمايزة هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا هو السبب في أن العديد من الدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني في خلايا 3T3-L1 ركزت على تمايز الخلايا الدهنية بدلا من التركيز على وظيفة الخلايا الدهنية.
لفترة طويلة ، كانت التقنية الفعالة الوحيدة لخلايا الدهون المتحولة هي الكهربورات5، وهي مملة ومكلفة ويمكن أن تسبب تلفا في الخلايا. تشير هذه الورقة إلى تقنية عكس العدوى باستخدام كاشف العدوى الشائع ، مما يقلل من الوقت العملي للإصابة ، وليس له أي تأثير على صلاحية الخلية ، وهو أقل تكلفة بكثير من الإلكتربو. هذا البروتوكول مناسب تماما لإصابة سيرنا وغيرها من أوليغونوكليوتيدات مثل محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) ومكافحة مير. مبدأ بروتوكول عكس العدوى هو احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مجمع في لوحة ثقافة الخلية ومن ثم زرع الخلايا الدهنية الناضجة في الآبار. ثم، إعادة ربط الخلايا الشحمية إلى سطح لوحة ملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات / العدوى. تسمح هذه المنهجية البسيطة والفعالة وغير المكلفة بدراسة دور الحمض النووي الريبي وترميز البروتين وmiRs في وظيفة الخلايا الدهنية ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: استخدام تقنيات عقيمة لتنفيذ كافة الخطوات من البروتوكول في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلايا تدفق صفح. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف والمعدات.
1. التمايز من الخلايا الليفية مورين 3T3-L1 في الخلايا الدهنية
- تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملم في الثقافة متوسطة-DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1A). ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية).
- بعد يومين من التقاء، تغيير المتوسطة الثقافة، والاستعاضة عن DMEM دون بيروفات، 25 مليون جلوكوز، 10٪ مصل عجل جنيني (FCS)، و1٪ بنسلين وستريبتومايسين مع تكملة 0.25 م 3-إيزابيل-1-ميثيل إكسانثين (IBMX)، 0.25 ميكرومتر ديكساميثازون، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، و10 ميكرومتر روزيجليتازون.
ملاحظة: يستغرق 5 أيام للوصول إلى التقاء عندما يتم بذر الخلايا في 300،000 خلية لكل طبق 100 ملم. - بعد يومين، استبدل الوسط الثقافي ب DMEM بدون بيروفاتي، 25 مليون جلوكوز، 10٪ FCS، و1٪ البنسلين والستريبتوميسين المكمل ب 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين و10 ميكرومتر روزيجليتازون واحتضان لمدة يومين. ثم، تغذية الخلايا كل يومين مع DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1B).
- ترانسفيكت الخلايا الدهنية 3T3-L1 7-8 أيام بعد بداية بروتوكول التمايز.
ملاحظة: من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز (>80٪) قبل العدوى لتجنب انتشار الخلايا الليفية المتبقية بعد العدوى، مما يؤدي إلى مجموعة مختلطة من الخلايا التي قد تحيز النتائج.
2. إعداد لوحات precoated
- في اليوم السابق أو قبل ساعات قليلة من العدوى، قم بإعداد محلول من نوع الكولاجين الأول عند 100 ميكروغرام/مل في الإيثانول بنسبة 30٪ من محلول المخزون عند 1 ملغم/مل. أضف 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من طبق من 12 بئرا و125 ميكرولتر لكل بئر من طبق من 24 بئرا ، ونشر المحلول على سطح البئر.
- اترك الطبق بدون الغطاء تحت غطاء الثقافة حتى يجف الكولاجين. اغسل مرتين مع المالحة المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (D-PBS).
ملاحظة: تتوفر لوحات مسبقة المعطف للشراء.
3. إعداد مزيج العدوى
ملاحظة: التركيز النهائي للsiRNA بين 1 و 100 nM (1 إلى 100 pmol من siRNA لكل بئر من لوحة 12 جيدا). التركيز النهائي لتقليد مير هو 10 nM (10 pmol / جيدا). تحديد أفضل تركيز لكل سيرنا، تقليد مير، أو oligonucleotide أخرى قبل بدء التجربة لتجنب الآثار خارج الهدف. إجراء تجارب العدوى في ثلاثة نسخ لتسهيل التحليل الإحصائي للنتائج. إعداد جميع الكواشف الزائدة لحساب الخسارة العادية أثناء الأنابيب.
- مزيج عن طريق pipetting (حجم / حجم) سيرنا (أو oligonucleotides أخرى) مع تحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية(الجدول 1). حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة كاشف transfection وتحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية إلى siRNA، وماصة لخلط (الجدول 1). حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خلال هذا الوقت، انتقل إلى القسم 4). أضف مزيج العدوى إلى كل بئر من الطبق المغلف بالكولاجين.
4. إعداد الخلايا الشحمية 3T3-L1
- غسل الخلايا في طبق بيتري 100 ملم مرتين مع D-PBS. إضافة 5x تريبسين إلى الخلايا (1 مل لكل طبق 100 ملم)، مع التأكد من تغطية كل من السطح مع تريبسين. انتظر لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية التريبسين.
- احتضان طبق بيتري لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اضغط على طبق 100 مم لفصل الخلايا.
- إضافة 10 مل من DMEM دون بيروفاتي, 25 mM الجلوكوز, 10٪ FCS, و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين لتحييد تريبسين. pipet بعناية المتوسط صعودا وهبوطا لفصل الخلايا وتجانس تعليق الخلية.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد Malassez أو عداد الخلية الآلي، وضبط تركيز الخلايا إلى 6.25 × 105 خلايا / مل من المتوسطة. البذور 800 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 12 جيدا (5 × 105 خلايا) أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 24 جيدا (2.5 × 105 خلايا) التي تحتوي على مزيج العدوى.
ملاحظة: طبق بيتري واحد 100 ملم من الخلايا الدهنية سيسمح بإعداد لوحة واحدة من 12 بئرا أو لوحة واحدة من 24 بئرا. طبق 100 ملم يحتوي عادة على 6-7 × 106 adipocytes، والتي تتوافق مع 5 × 105 الخلايا الدهنية لكل بئر من لوحة 12 جيدا. - احتضان لوحات في حاضنة ثقافة الخلية (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية)، وعدم إزعاج الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدال بعناية supernatant مع DMEM الطازجة دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين.
ملاحظة: من الممكن أيضا زرع الخلايا في لوحات 48-و96-well المطلية بالكولاجين ولكن اتخاذ المزيد من الاحتياطات عند استبدال الوسائط لتجنب انفصال الخلايا الدهنية.
5. التحليل الوظيفي للخلايا الشحمية 3T3-L1 المصابة
- دراسة الهدف ضربة قاضية 24-48 ساعة و 48-96 ساعة بعد siRNA أو مير تقليد التسليم لرنا والبروتين، على التوالي.
- إجراء تحليلات وظيفية من الخلايا الدهنية المصابة لدراسة إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، إفراز أديبوكيني، انحلال الدهون، وتولد الدهون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام إجراء عكس transfection وصفها هنا لتعديل التعبير عن البروتينات أو الحمض النووي الريبي الدقيق في 3T3-L1 adipocytes، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بهم بعد العدوى(الشكل 1B،C). في الواقع ، بعد يومين من العدوى ، كانت الخلايا الدهنية منتشرة بشكل جيد ومرفقة بالطبق وقدمت قطرات دهون متعددة الخلايا التي هي سمة من سمات الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1. لم يكن محتوى الدهون مختلفا بين الخلايا الشحمية المتحولة وغير المصابة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 ، والتي هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا الأسلوب لديه بعض القيود التي تحتاج إلى النظر فيها. هذا البروتوكول غير فعال لالعاب مع الحمض النووي البلازميد، مما يحد من فائدة هذه التقنية للحصول على وظائف الدراسات. على الرغم من أن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل كل من معهد البحوث الدولية، وجامعة كوت دازور، والوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث من خلال برنامج الاستثمارات من أجل مختبر التميز المستقبلي (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ومبادرة التميز (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). 10- وتحظى الجمعية العامة بدعم المنح المقدمة من جمعية الفرانكوفونية للديابييه، وجمعية فرانسيز دي إيتو دي ريشرش سور لوبيستيه، ومعهد التكنولوجيات المتعددة الكائنات من أجل سانتي، ومؤسسة بنجامين - ديهرت. J.G. معتمد من قبل ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. مدعوم بمنحة ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ومنحة من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي C3M الممول من مجلس إدارة ألب ماريتيم وريجيون باكا، والذي يدعمه أيضا منصة التصوير المجهري والتصوير GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 12 لوحة ثقافة الأنسجة | الآبار Dutscher | 353043 | |
| 2.5٪ تريبسين (10x) | Gibco | 15090-046 | مخفف إلى 5x مع D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell غير المستهدف Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما | A7030 | |
| الكولاجين من النوع الأول من جلد العجل | سيجما ألدريتش | C8919 | |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D1756 | |
| D-PBS | جيبكو | 14190144 | |
| Dulbecco's & nbsp ؛ متوسط النسور المعدلة (DMEM) | جيبكو | 41965062 | 4.5 جم / لتر D-Glucose ؛ لام-الجلوتامين; لا بيروفات |
| الإيثانول | Sigma | 51976 | |
| FAM المسمى التحكم السلبي si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 10270-106 | |
| كاشف الجلسرين الحر | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| محلول قياسي للجلسرين | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 الجسم | المضادسانتا كروز | sc-131119 | التخفيف: 0.5 & micro; جم / مل |
| الوسط الأساسي المحسن (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| الأنسولين ، المؤتلف البشري | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA يحاكي | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer فحوصات Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| مصل العجل حديثي الولادة | Gibco | 16010-159 | |
| زيت أحمر O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon ديسكفري | L-056623-01-0005 | |
| البنسلين والستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | |
| خلية الأجسام المضادة Perilipin-1 | 3470 | التخفيف: 1/1000 | |
| طبق بتري 100 مم × 20 مم | المضادة Dutscher | ||
| PKB | 9272 | التخفيف: 1/1000 | |
| PKB Phospho Thr308 خلية الأجسام المضادة | الإشارات | 9275 | التخفيف: 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| كاشف النفدة (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| & alpha -tubulin الأجسام المضادة | Sigma aldrich | T6199 | التخفيف: 0.5 & micro ؛ جم / مل |
| الجسم المضاد Vamp2 | R & | أنظمة MAB5136 | التخفيف : 0.1 & micro; جم / مل |
المراجع
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
