يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج ثقافة الخلية Adipocyte لدراسة تأثير البروتين وتعديل الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة Adipocyte
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.
المقدمة
تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية1. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: استخدام تقنيات عقيمة لتنفيذ كافة الخطوات من البروتوكول في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلايا تدفق صفح. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف والمعدات.
1. التمايز من الخلايا الليفية مورين 3T3-L1 في الخلايا الدهنية
- تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملم في الثقافة متوسطة-DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1A). ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (7٪ CO2 و 37 درجة مئوية).
- بعد يومين من التقاء، تغيير المتوسطة الثقافة، والاستعاضة عن DMEM دون بيروفات، 25 مليون جلوكوز، 10٪ مصل عجل جني....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام إجراء عكس transfection وصفها هنا لتعديل التعبير عن البروتينات أو الحمض النووي الريبي الدقيق في 3T3-L1 adipocytes، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بهم بعد العدوى(الشكل 1B،C). في الواقع ، بعد يومين من العدوى ، كانت الخلايا الدهنية منتشرة بشكل جيد ومرفقة بالطبق وقدمت قطرات دهون متعددة الخلايا التي هي سمة من سمات الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1. لم يكن محتوى الدهون مختلفا بين الخلايا الشحمية المتحولة وغير المصابة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 ، والتي هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا الأسلوب لديه بعض القيود التي تحتاج إلى النظر فيها. هذا البروتوكول غير فعال لالعاب مع الحمض النووي البلازميد، مما يحد من فائدة هذه التقنية للحصول على وظائف الدراسات. على الرغم من أن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل كل من معهد البحوث الدولية، وجامعة كوت دازور، والوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث من خلال برنامج الاستثمارات من أجل مختبر التميز المستقبلي (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ومبادرة التميز (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). 10- وتحظى الجمعية العامة بدعم المنح المقدمة من جمعية الفرانكوفونية للديابييه، وجمعية فرانسيز دي إيتو دي ريشرش سور لوبيستيه، ومعهد التكنولوجيات المتعددة الكائنات من أجل سانتي، ومؤسسة بنجامين - ديهرت. J.G. معتمد من قبل ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. مدعوم بمنحة ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ومنحة من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). كما نشكر مرفق التصوير الأساسي C3M الممول من مجلس إدارة ألب ماريتيم وريجيون باك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 12 لوحة ثقافة الأنسجة | الآبار Dutscher | 353043 | |
| 2.5٪ تريبسين (10x) | Gibco | 15090-046 | مخفف إلى 5x مع D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell غير المستهدف Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما | A7030 | |
| الكولاجين من النوع الأول من جلد العجل | سيجما ألدريتش | C8919 | |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D1756 | |
| D-PBS | جيبكو | 14190144 | |
| Dulbecco's & nbsp ؛ متوسط النسور المعدلة (DMEM) | جيبكو | 41965062 | 4.5 جم / لتر D-Glucose ؛ لام-الجلوتامين; لا بيروفات |
| الإيثانول | Sigma | 51976 | |
| FAM المسمى التحكم السلبي si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 10270-106 | |
| كاشف الجلسرين الحر | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| محلول قياسي للجلسرين | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 الجسم | المضادسانتا كروز | sc-131119 | التخفيف: 0.5 & micro; جم / مل |
| الوسط الأساسي المحسن (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| الأنسولين ، المؤتلف البشري | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA يحاكي | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer فحوصات Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| مصل العجل حديثي الولادة | Gibco | 16010-159 | |
| زيت أحمر O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon ديسكفري | L-056623-01-0005 | |
| البنسلين والستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | |
| خلية الأجسام المضادة Perilipin-1 | 3470 | التخفيف: 1/1000 | |
| طبق بتري 100 مم × 20 مم | المضادة Dutscher | ||
| PKB | 9272 | التخفيف: 1/1000 | |
| PKB Phospho Thr308 خلية الأجسام المضادة | الإشارات | 9275 | التخفيف: 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| كاشف النفدة (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| & alpha -tubulin الأجسام المضادة | Sigma aldrich | T6199 | التخفيف: 0.5 & micro ؛ جم / مل |
| الجسم المضاد Vamp2 | R & | أنظمة MAB5136 | التخفيف : 0.1 & micro; جم / مل |
المراجع
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
