مقالة منهجية

بروتوكول شامل عالي الكفاءة لعزل واستزراع واستقطاب وتوصيف تحلل السكر للضامة المشتقة من نخاع العظام

DOI:

10.3791/61959

⸱

فبراير 7, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 3Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طرقا مفصلة وشاملة لعزل وزراعة واستقطاب وقياس حالة التمثيل الغذائي المحلل للسكر للضامة الحية المشتقة من نخاع العظام (BMDMs). توفر هذه الورقة إرشادات خطوة بخطوة مع رسوم توضيحية مرئية واقعية لسير العمل وتقييم تحلل السكر ل BMDMs في الوقت الفعلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر البلاعم من بين أهم الخلايا العارضة للمستضد. تم تحديد العديد من المجموعات الفرعية من البلاعم بتوقيعات استقلابية فريدة. تصنف البلاعم عادة على أنها أنواع فرعية شبيهة ب M1 (التهابية) وشبيهة ب M2 (مضادة للالتهابات). البلاعم الشبيهة ب M1 هي ضامة مؤيدة للالتهابات يتم تنشيطها بواسطة LPS و / أو السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل INF-γ و IL-12 و IL-2. تشارك البلاعم المستقطبة الشبيهة ب M1 في أمراض مختلفة عن طريق التوسط في دفاع المضيف لمجموعة متنوعة من البكتيريا والفيروسات. هذا مهم جدا لدراسة البلاعم الشبيهة ب M1 التي يسببها LPS وحالاتها الأيضية في الأمراض الالتهابية. تعتبر البلاعم الشبيهة ب M2 ضامة مضادة للالتهابات ، يتم تنشيطها بواسطة السيتوكينات والمنشطات المضادة للالتهابات. في ظل الحالة المؤيدة للالتهابات ، تظهر البلاعم زيادة في تحلل السكر في وظيفة تحلل السكر. تم التحقيق في وظيفة تحلل السكر بنشاط في سياق تحلل السكر ، أو القدرة على تحلل السكر ، أو احتياطي تحلل السكر ، أو تحلل السكر التعويضي ، أو التحمض غير المحلل للسكر باستخدام أجهزة تحليل التدفق خارج الخلية (XF).

توضح هذه الورقة كيفية تقييم حالات تحلل السكر في الوقت الفعلي بخطوات سهلة المتابعة عندما تتنفس البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) وتستهلك الطاقة وتستهلكها. باستخدام مثبطات ومنشطات محددة لتحلل السكر في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية الحصول على رؤية منهجية وكاملة لعمليات التمثيل الغذائي المحلل للسكر في الخلايا وتقديم نتائج أكثر دقة وواقعية. لنكون قادرين على قياس الأنماط الظاهرية المتعددة للسكر ، نقدم طريقة تطبيع سهلة وحساسة قائمة على الحمض النووي لتقييم استقطاب BMDMs. تعد الزراعة والتنشيط / الاستقطاب وتحديد النمط الظاهري والحالة الأيضية ل BMDMs من التقنيات الحاسمة التي يمكن أن تساعد في التحقيق في العديد من أنواع الأمراض المختلفة.

في هذه الورقة ، قمنا باستقطاب البلاعم M0 الساذجة إلى البلاعم الشبيهة ب M1 و M2 باستخدام LPS و IL4 ، على التوالي ، وقمنا بقياس مجموعة شاملة من معلمات حال السكر في BMDMs في الوقت الفعلي والطولي بمرور الوقت ، باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية والمنشطات والمثبطات المحللة للسكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاعم هي واحدة من أهم الخلايا في الجهاز المناعي الفطري الشبيهة ب M1. يشاركون في إزالة الأمراض المعدية ، والبلعمة ، وعرض المستضد ، وتنظيم الالتهاب2. علاوة على ذلك ، فإن البلاعم مطلوبة لتنظيم الخلايا المناعية الأخرى عبر السيتوكينات المختلفة التيتطلقها 3. هناك طيف كبير في الأنماط الظاهرية للبلاعم4. اعتمادا على الإشارات التي تتعرض لها البلاعم ، فإنها تستقطب نحو حالات التهابية وأيضيةمختلفة 5. تظهر البلاعم تغيرات أيضية في أمراض مختلفة ، اعتمادا على الأنسجة التي توجد فيها الضامة6. تتمتع البلاعم المستقطبة بالقدرة على إعادة برمجة أو تبديل عملية التمثيل الغذائي المحلل للسكر ، واستقلاب الدهون ، واستقلاب الأحماض الأمينية ، والفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا (OXPHOS) 7،8. البلاعم الشبيهة ب M1 التي يتم تنشيطها كلاسيكيا والضامة الشبيهة ب M2 التي يتم تنشيطها بدلا من ذلك هما النمطين الظاهريان الأكثر دراسة للبلاعم3. يشار إلى الضامة الهادئة غير المنشطة باسم البلاعم M0. يمكن إحداث استقطاب البلاعم M0 نحو نمط ظاهري يشبه M1 عن طريق تحفيز BMDMs الساذجة بعديدات السكاريد الدهنية البكتيرية (LPS)9. يمكن تنشيط مسار الإشارات PI3K-AKT-mTOR-HIF1a في البلاعم في وجود السيتوكينات الالتهابية أو الإنترفيرون جاما (IFN γ) أو عامل نخر الورم (TNF) 10. زادت البلاعم الشبيهة ب M1 من مستويات استقلاب تحلل السكر ، وانخفاض مستويات الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) ، مما ينتج عنه السيتوكينات الالتهابية المشاركة في الأمراض المعديةوالالتهابية 8. من ناحية أخرى ، يمكن إحداث الاستقطاب نحو النمط الظاهري الشبيه ب M2 بواسطة Interleukin (IL) -4 ، عبر مسارات JAK-STAT و PPAR و AMPK ، أو عن طريق (IL) -13 و TGFβpathays 11،12.

على عكس البلاعم الشبيهة ب M1 ، فإن الضامة الشبيهة ب M2 قد قللت من تحلل السكر وزادت من OXPHOS وتشارك في الأنشطة المضادة للطفيليات وإصلاحالأنسجة 8،13. BMDMs هي نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة البلاعم المشتقة من الخلايا الجذعية لنخاع العظم. تحلل السكر و OXPHOS هما المساران الرئيسيان لإنتاج الطاقة في الخلايا14. بناء على بيئتها الدقيقة ، يمكن ل BMDMs اختيار استخدام أي من هذه المسارات. في بعض الحالات ، قم بالتبديل من واحد إلى آخر ، أو استخدم كلا المسارين14. في هذه الدراسة ، ركزنا على استقلاب تحلل السكر في الضامة المنشطة المؤيدة للالتهابات. عندما يتم تحويل الجلوكوز الموجود في السيتوبلازم إلى بيروفات ثم اللاكتات ، تنتج الخلايا بروتونات في الوسط تسبب ارتفاعا في معدل التحمض في الوسط المحيط بالخلايا الشبيهة ب M15. تم استخدام محلل التدفق خارج الخلية لقياس معدل تحمض وسائط الخلية. يتم الإبلاغ عن النتائج على أنها معدل تحمض خارج الخلية (ECAR) أو معدل تدفق البروتونات.

تعد الطريقة السريعة والسهلة المحسنة للوصول إلى مستويات تحلل السكر في البلاعم المستقطبة ضرورية لتحديد النمط الظاهري المحلل للسكر وتغيرات المستقلب وتأثيرات المثبطات / المنشطات والأدوية على الضامة المستقطبة. تم تحسين الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة لإعطاء معلومات حول عوامل تحلل السكر المحددة (تحلل السكر ، والقدرة على تحلل السكر ، واحتياطي تحلل السكر ، والتحمض غير المحلل للسكر) ، بالإضافة إلى إعادة البرمجة الأيضية لعملية التمثيل الغذائي لتحلل السكر. يستهدف المثبط (2DG) الذي تم استخدامه في هذه الدراسة صراحة مسار تحلل السكر.

تم تعديل هذا البروتوكول المحسن وتحسينه بناء على مزيج من البروتوكولالمنشور 16 ، وتحليل التدفق خارج الخلية لمقايسات حال السكر لأدلة المستخدم الخاصة بالشركة المصنعة ، والتواصل المباشر مع علماء البحث والتطوير في الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التضحية بالفئران بشكل إنساني وفقا لتقييم واعتماد رعاية المختبر (AAALAC) وإرشادات الجمعية الأمريكية لعلوم المختبر (AALAS) وباستخدام البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تكساس إيه آند إم (IACUC).

1. حصاد نخاع عظم الفئران واستزراع BMDMs

  1. التضحية بالفأر (6-10 أسابيع من العمر C57Bl / 6 فئران كانت في هذا البروتوكول) ووضعها على جانبه البطني ، وقطع الجلد والطبقة البريتونية وقشر الساقين برفق.
    ملاحظة: استخدم التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون2 للقتل الرحيم للماوس.
  2. افصل كلا الساقين الخلفيتين عن الورك لأسفل ، مع الحرص على عدم قطع العظم.
  3. ضع الساق بأكملها في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل (مع توجيه القدمين لأعلى لسهولة سحبها لاحقا) على الجليد واستمر في حصاد كلتا الساقين من الماوس.

2. التعرض لعظم الفخذ

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية.

  1. احصد عظم الفخذ عن طريق قطع الساق من كل ساق وإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة بعظم الفخذ بالمقص وورق المختبر.
  2. ضع عظم الفخذ المحصود "النظيف" في طبق مقاس 10 سم يحتوي على قطعة من ورق المختبر المشبع بوسط زراعة الأنسجة (TC) أو PBS. ضعهم على الثلج.
  3. استمر في حصاد عظم الفخذ وإزالة الأنسجة من جميع عظم الفخذ قبل الانتقال إلى مرحلة التنظيف (الشكل 1 أ).

3. تدفق النخاع

  1. لطرد النخاع من عظم الفخذ ، استخدم حقنة سعة 3 مل مملوءة بوسط TC أو PBS بإبرة 23G. املأ المحقنة قبل تعريض النخاع.
  2. استخدم المقص لفضح النخاع عن طريق قطع نهاية عظم الفخذ عند كلا المشاشية.
  3. أدخل طرف الإبرة في عظم الفخذ واغسل النخاع برفق في طبق 10 سم.
  4. مرر الإبرة على طول عظم الفخذ بالكامل ، واشطفها حتى يتحول لون العظام إلى اللون الأبيض. عادة ، يمكن التخلص من معظم النخاع باستخدام 2-3 مل من الوسائط.
  5. اغسل جميع عظم الفخذ ونخاع عظم البركة في الطبق. استخدم إبرة لتفتيت أي كتل مرئية. صفي النخاع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل (الشكل 1 أ).

4. تحلل كرات الدم الحمراء

  1. تدوير النخاع عند 190 × جم لمدة 10 دقائق. شفط المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الحبيبات في 4 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK باستخدام ماصة. اسمح للمخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء بالعمل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 4 مل من TC متوسط RPMI-C 10٪ (RPMI 1640 -GlutaMAX) مكمل ب 2-mercaptoethanol ، gentamicin ، Streptomycin ، و 10٪ FCS إلى تعليق النخاع وتدور عند 1300 × جم لمدة 10 دقائق.
  4. يصفى مرة أخرى لإزالة بقايا كرات الدم الحمراء وأعد تعليقه في حجم صغير من RPMI-C 10٪ للعد.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا (الشكل 1 ب). تم استخدام عداد الخلايا الفيدية لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للبقاء في المعلق.

5. الطلاء والثقافة

  1. أضف 10 مل من RPMI-C 10٪ + 10 نانوغرام / مل لتر M-CSF (عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، وهو منظم أساسي لتكاثر الخلايا الوحيدة / البلاعم والتمايز والبقاء على قيد الحياة) إلى العديد من الألواح 10 سم حسب الرغبة.
  2. أضف حجما مناسبا من الخلايا التي تم عدها بحيث تحتوي كل لوحة مقاس 10 سم على 1 × 106 خلايا. ضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية (تعرف باليوم 0).
  3. في اليوم 3 ، أضف برفق 5 مل من RPMI-C الطازج 10٪ + 10 نانوغرام / مل M-CSF إلى كل طبق.
    ملاحظة: في اليوم 7 ، يجب أن تكون BMDMs جاهزة للاختبار (الشكل 1C).

6. الحصاد من الأطباق

  1. استخدم مجهرا ضوئيا للتأكد من أن معظم الخلايا قد التزمت بالصفائح.
  2. استنشق الوسائط بلطف. ثم أضف 3 مل من PBS وقم بتدوير اللوحة برفق. استنشق هذا جيدا لإزالة أي خلايا غير ملتصقة متبقية.
  3. أضف 7-10 مل من PBS البارد إلى اللوحة ، واستخدم ماصة P1000 لغسل قاع الألواح ، وحصاد جميع الخلايا المتبقية في أنبوب تجميع.
    ملاحظة: احتفظ بالأنابيب على الجليد لأن البلاعم ملتصقة بإحكام شديد وستلتصق بداخل الأنبوب. إذا ظلت الخلايا باردة ، فستكون أقل إلتصاقا بإحكام.
  4. أجهزة الطرد المركزي ، العد ، وخلايا الألواح للتجارب (الشكل 1 د). باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يجب أن تكون الخلايا الناتجة موجبة بنسبة >95٪ ل CD11b و F4 / 80. (تم تحديد استقطاب البلاعم عن طريق التلوين بعلامات تشبه M1 من CD38 و TNF-a و MCP-1 و M2 من CD206.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 6.1-6.3 في خزانة السلامة الحيوية وقم بتنفيذ الخطوة 6.4 على سطح الطاولة. حافظ على تقنيات التعقيم طوال العملية.

figure-protocol-1
الشكل 1: سير العمل الرسومي لثقافة نخاع عظم الفأر للبلاعم المشتقة من BM. (أ) حصاد الساق ، والتعرض لعظم الفخذ ، وتدفق النخاع ؛ (ب) تحلل كرات الدم الحمراء ؛ (ج) الطلاء والثقافة؛ (د) حصاد الخلايا من اللوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. في اليوم السابق لمقايسة محلل التدفق الأيضي: بذر واستقطاب الخلايا لاختبار تحلل السكر

  1. قم بتسخين محلل التدفق الأيضي إلى 37 درجة مئوية عن طريق تشغيل الجهاز.
  2. قم بترطيب خرطوشة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول Caliberrant واحتضان الخرطوشة في حاضنة غير CO2 طوال الليل (الشكل 2 أ). رطوبة حاضنة غير CO2 ليست مهمة لترطيب الخرطوشة.
    1. قبل ساعة من التجربة ، قم بغمس اللوحة عدة مرات لأعلى ولأسفل ، مما يساعد على إزالة فقاعات الهواء.
  3. صمم خريطة اللوحة على البرنامج في اختبار إجهاد تحلل السكر الافتراضي - الحقن الحاد ، باتباع تعليمات الاختبار.
    1. انقر فوق أيقونة البرنامج ، ثم انقر فوق اختبار الحقن الحاد للإجهاد لتحلل السكر. في أيقونة تعريف المجموعة، قم بإنشاء أسماء المجموعات.
  4. هناك خمس دورات قياس مدتها 18 دقيقة وأربع حقن. قم بتغيير حقن المنفذ A إلى الجلوكوز ، والمنفذ B إلى Oligomycin ، والمنفذ C إلى Rotenone و antimycin A (Rot / AA) ، والمنفذ D إلى 2DG.
  5. أعد تعليق الخلايا في RPMI-C 10٪ وسط وبذرة 50 ألف خلية لكل بئر باستثناء الحواف الأربعة للوحة (A1 و A12 و H1 و H12 ؛ أضف الوسائط فقط ، بدون خلايا) في صفيحة دقيقة لمحلل التدفق الأيضي إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر ، وعادة ما يلزم ما لا يقل عن 40 ألف خلية لإجراء هذا الفحص.
  6. اسمح للخلايا بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة لتجنب تأثير حافة الخلايا. يحدث تأثير الحافة عندما يتبخر الوسط من حول محيط اللوحة جزئيا ، مما يتسبب في تغيرات في الحجم والتركيز ويقلل من صلاحية الخلية.
  7. أضف 10 نانوغرام / مل LPS لاستقطاب البلاعم الساذجة نحو الخلايا الشبيهة ب M1 وأضف 20 نانوغرام / مل من IL-4 لاستعصابها نحو الخلايا الشبيهة ب M2. استخدم ما لا يقل عن 3 إلى 6 آبار لكل حالة (الشكل 2 ب).
  8. افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.

figure-protocol-2
الشكل 2: عرض رسومي للبذر واستقطاب الخلايا. (أ) إعداد محلل التدفق خارج الخلية وترطيب الخرطوشة ؛ (ب) استقطاب الخلايا والحضانة الليلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. يوم الفحص: XF الإعداد المتوسط والمركب

  1. استكمل 100 مل من وسط فحص XF RPMI (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 2 ملي مولار من الجلوتامين.
  2. قم بتعقيم الوسائط باستخدام نظام فلتر فراغ 0.2 ميكرومتر.
  3. ضع وسائط الفحص في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بإزالة الخلايا المطلية من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 . اغسل الخلايا بوسائط الفحص مرتين واستبدل الوسائط السابقة بوسائط الفحص إلى الحجم النهائي البالغ 180 ميكرولتر.
  5. استخدم مجهرا للتأكد من أن جميع الآبار تحتوي على خلايا ملتصقة وقم بتمييز أي آبار بها أي خدوش ناتجة عن سحب العينات. إذا كان هناك أي خدوش ، فقم بإزالة تلك اللوحة قبل التحليل.
  6. ضع اللوحة المحتوية على الخلية في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 45 دقيقة (الشكل 3 أ).
  7. استخدام المركبات ووسائط الفحص لصنع محاليل مخزون من الجلوكوز (100 مليمتر) ، أوليغومايسين (100 ميكرومتر) ، روت / AA (50 ميكرومتر) ، و 2DG (500 مليمتر) (الجدول 1).
  8. اصنع خليط حقن 10x لكل مركب باستخدام وسائط الفحص (الجدول 2).
مخزون الحقن (متوفر في المجموعات)إضافة وسائط فحص كاملة (مل)تركيز المخزون النهائي (ميكرومتر)
الجلوكوز3100 كيلو
أوليغومايسين0.72100
2-DG3100 كيلو

الجدول 1. مخزون الحقن

المنافذ الموجودة على الخرطوشةحلول المخزونإضافة حجم المخزونإضافة وسائط الفحصالتركيز النهائي للحقن (10x)إضافة وحدة التخزين هذه إلى المنفذ المعين (ميكرولتر)التركيز النهائي بعد الحقن في كل بئر
Aالجلوكوز (100 مل)3000 ميكرولتر + 0 ميكرولتر100 ملم2010 ملم
Bأوليغومايسين (100 ميكرومتر)300 ميكرولتر + 2700 ميكرولتر10 ميكرومتر221.0 ميكرومتر
Cروتينون / أنتيمايسين أ (50 ميكرومتر)300 ميكرولتر + 2700 ميكرولتر5 ميكرومتر250.5 ميكرومتر
D2-DG (500 مل)300 ميكرولتر + 0 ميكرولتر500 ملم2850 ملم

الجدول 2. تركيزات الحقن النهائية

9. يوم الفحص: إجراء اختبار تحلل السكر الحاد على البلاعم المستقطبة

  1. افتح قالب مقايسة إجهاد تحلل السكر المحفوظ (الحقن الحاد) من البرنامج. يحتوي اختبار الإجهاد الجليكو الحاد الافتراضي على 3 دقائق من المزج والقياس قبل كل حقنة.
  2. تحقق من القالب وتفاصيل الفحص ، وعندما تكون جاهزا ، انقر فوق تشغيل واتبع تعليمات الفحص الافتراضي. ومع ذلك ، يمكن تخصيص جميع المعلمات.
  3. قم بإزالة خرطوشة المستشعر من الحاضنة غير CO2 ، وقم بإزالة الغطاء ، وأدخلها في الجهاز بحيث يقع البئر A1 للوحة الخرطوشة في الزاوية العلوية اليسرى من لوحة الإدخال الخاصة بالماكينة. عادة ، تستغرق المعايرة ما بين 20 إلى 45 دقيقة.
  4. بعد الانتهاء من المعايرة ، سيقوم الجهاز بإخراج اللوحة التي تحتوي على محلول العيار وسيحمل خرطوشة المستشعر. قم بإزالة المعدن الذي يحتوي على اللوحة.
  5. قم بإزالة لوحة الخلية من الحاضنة غير المضادة لثاني أكسيد الكربون2 ، وقم بإزالة غطاء اللوحة ، وأدخلها في الجهاز. انقر فوق تشغيل (الشكل 3 ب).
  6. عند الانتهاء من الفحص ، ستقوم الماكينة بإخراج لوحة الخلية وخرطوشة المستشعر.
  7. قم بإزالة الوسائط من اللوحة وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية لمزيد من التطبيع.
  8. استخدم مجموعة مقايسة تكاثر الخلايا التجارية (على سبيل المثال ، CyQUANT) لتطبيع الخلايا.
  9. أضف 1 مل من المركب B أو المخزن المؤقت للتحلل إلى 19 مل من الماء المقطر الخالي من النوكلياز.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل المركب A أو GR إلى الحل المذكور أعلاه.
  11. تأكد من إذابة الخلايا الموجودة في اللوحة ثم أضف 200 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر.
  12. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  13. قم بقياس التألق في أطوال موجية انبعاث 480 نانومتر و 520 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
  14. تطبيع الخلايا الموجودة على لوحة التسوية الخاصة بالبرنامج.
  15. تطبيع الخلايا بناء على عدد خلايا الضامة الساذجة (الشكل 3 ج). ضع في اعتبارك متوسط البلاعم الساذجة على أنه 1 (بقسمة رقم خلية كل بئر على متوسط عدد خلايا الضامة الساذجة) وقم بتطبيقها على جميع البلاعم.

figure-protocol-3
الشكل 3: يوم الفحص: التحضير المتوسط والمركب وتشغيل المقايسة. (أ) تحضير الخلايا للفحص. (ب) تحضير المركبات ومعايرتها وتشغيلها ؛ (ج) التطبيع وتحليل البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحلل السكر والفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا هما المساران الرئيسيان لإنتاج ATP في الخلايا (الشكل 4 أ). بعض الخلايا لديها القدرة على التبديل بين هذين المسارين لتلبية متطلباتها من الطاقة. يسمى تحويل الجلوكوز إلى بيروفات في السيتوبلازم تحلل السكر. البيروفات له مصيران. سيتم تحويله إلى لاكتات أو استقلابه بشكل أكبر من خلال دورة TCA وفي النهاية من خلال سلسلة نقل الإلكترون (ETC) لإنتاج المزيد من ATP. من أجل الحصول على أفضل فهم لمعلمات تحلل السكر للخلايا ، نقوم بتقليل م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما ذكرنا سابقا ، يمكن لآلة تحليل التدفق خارج الخلية توفير معلومات في الوقت الفعلي حول مسارين رئيسيين لإنتاج الطاقة للخلايا عن طريق قياس OCR (معدل استهلاك الأكسجين) ، ومؤشر لنشاط OXPHOS في الميتوكوندريا ، و ECAR (معدل التحمض خارج الخلية) وهو مؤشر على تحلل السكر. يمكن للبلاعم استخدام كلا المسارين ، اعتمادا على بيئتها الدقيقة. يمكنهم أيضا تبديل مسارات إنتاج الطاقةالخاصة بهم 17،18. إن فهم الحالات النشطة للبلاعم واستجاباتها للأدوية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيدة جوانا روشا على المساعدة التحريرية. تم دعم العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01DK118334 (إلى الدكتورين صن وألانيز) و (المعاهد الوطنية للصحة) R01A11064Z (إلى الدكتورين جايارامان وألانيز).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
23G إبرVWRBD305145
2-mercaptoethanolLife Technologies21985023
50 مل أنبوب مخروطيVWR21008-951
ACK تحلل عازلةThermo Fisher ScientificA1049201يمكن أن تكون مصنوعة في المختبر
Agilent Seahorse XF طقم اختبار إجهاد تحلل السكرAgilent Technologies103020-100
دليل مستخدم مجموعة اختبار إجهاد تحلل السكر Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolet RateKit Agilent Technologies103344-100
دليل مستخدم مجموعة اختبار معدل تحلل السكر Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103344-100
Alexa Fluor 488 المضاد للفأر CD206 (MMR) الأجسام المضادةBioLegend141710
مضاد للفأر CD11b eFluor450 100ugeBioscience48-0112-82
دينار بحريني 3 مل - حقنةVWRالمحاقن الأخرى مقبولة أيضا
عداد الخلية Vi-CELL- XR نظام كاملBECKMAN COULTER LifeSciences 731050يمكن عد الخلايا يدويا أيضا
مصفاة الخلية -70 & micro ؛ mVWR10199-656
CyQUANT Cell Cell AssayKit Thermo Fisher ScientificC7026
F4 / 80 الجسم المضاد أحادي النسيلة (BM8) pe-Cyanine7eBioscience25-4801-82
تقنيات مصل الجنينالبقري16000-044
مقياس التدفق الخلوي: BD LSFRFortessa X-20BD656385
Kim WipesVWR82003-822
LPS-SM فائق النقاء (tlrl-smpls) 5 مجمInvivogentlrl-smlps
MCSF Peprotech315-02
Murine IL-4Peprotech214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38BD Biosciences553764
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)Life Technologies15140122
طبق بتري 100 مم × 15 ممفيشر ساينتفيكF80875712
RPMI ، Glutamax ، HEPESInvitrogen72400-120
Seahorse Caliberrant SolutionAgilent Technologies103059-000
Seahorse XF 200mM محلول الجلوتامينAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate AsiseAgilent تقنيات103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaksAgilent Technologies102416-100
XF طقم اختبار إجهاد تحلل السكرAgilent Technologies103020-100
XF RPMI متوسط ، درجة الحموضة 7.4 بدون الفينول الأحمرAgilent Technologies103336-100
Assay BD309657 Kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 13 (1), (2020).
  2. Martinez-Pomares, L., Gordon, S. The Autoimmune Diseases. , Elsevier. 191-212 (2020).
  3. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) vs. classically and M2- (LPS–) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in immunology. 10, 1084(2019).
  4. Barrett, T. J. Macrophages in atherosclerosis regression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (1), 20-33 (2020).
  5. Ni, Y., et al. Adipose tissue macrophage phenotypes and characteristics: the key to insulin resistance in obesity and metabolic disorders. Obesity. 28 (2), 225-234 (2020).
  6. Chu, C., et al. Modulation of foreign body reaction and macrophage phenotypes concerning microenvironment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (1), 127-135 (2020).
  7. Batista-Gonzalez, A., Vidal, R., Criollo, A., Carreño, L. J. New insights on the role of lipid metabolism in the metabolic reprogramming of macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 2993(2020).
  8. Kang, S., Kumanogoh, A. The spectrum of macrophage activation by immunometabolism. International Immunology. , (2020).
  9. Shi, Y., et al. M1 But Not M0 Extracellular Vesicles Induce Polarization of RAW264. 7 Macrophages Via the TLR4-NFκB Pathway In Vitro. Inflammation. , 1-9 (2020).
  10. Zhang, L., Li, S. Lactic acid promotes macrophage polarization through MCT-HIF1α signaling in gastric cancer. Experimental Cell Research. 388 (2), 111846(2020).
  11. Geng, T., et al. CD137 signaling induces macrophage M2 polarization in atherosclerosis through STAT6/PPARδ pathway. Cellular Signalling. , 109628(2020).
  12. Liu, Q., et al. Combined blockade of TGf-β1 and GM-CSF improves chemotherapeutic effects for pancreatic cancer by modulating tumor microenvironment. Cancer Immunology & Immunotherapy. , 1-16 (2020).
  13. Rigoni, T. S., et al. RANK Ligand Helps Immunity to Leishmania major by Skewing M2 Into M1 Macrophages. Frontiers in Immunology. 11, 886(2020).
  14. Viola, A., Munari, F., Sánchez-Rodríguez, R., Scolaro, T., Castegna, A. The metabolic signature of macrophage responses. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  15. Ivashkiv, L. B. The hypoxia–lactate axis tempers inflammation. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 85-86 (2020).
  16. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).
  17. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial dysfunction prevents repolarization of inflammatory macrophages. Cell reports. 17 (3), 684-696 (2016).
  18. Liu, P. S., Ho, P. C. Metabolic Signaling. , Springer. 173-186 (2019).
  19. Wang, F., et al. Glycolytic stimulation is not a requirement for M2 macrophage differentiation. Cell metabolism. 28 (3), 463-475 (2018).
  20. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. Quantifying Cellular ATP Production Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Agilent Technologies, Inc. (2018).
  21. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  22. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
  23. Yang, S., et al. Macrophage polarization in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 501, 142-146 (2020).
  24. Hörhold, F., et al. Reprogramming of macrophages employing gene regulatory and metabolic network models. PLoS Computational Biology. 16 (2), e1007657(2020).
  25. Han, X., Ma, W., Zhu, Y., Sun, X., Liu, N. Advanced glycation end products enhance macrophage polarization to the M1 phenotype via the HIF-1α/PDK4 pathway. Molecular and Cellular Endocrinology. , 110878(2020).
  26. Müller, E., et al. Toll-like receptor ligands and interferon-γ synergize for induction of antitumor M1 macrophages. Frontiers in Immunology. 8, 1383(2017).
  27. Soto-Heredero, G., Gómez de las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis–a key player in the inflammatory response. The FEBS Journal. , (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Bone Marrow Derived MacrophagesM1 like Macrophage PolarizationM2 like Macrophage PolarizationGlycolytic CharacterizationExtracellular Flux AnalysisDNA based NormalizationMacrophage Culture ProtocolLPS ActivationIL4 StimulationMetabolic Phenotyping
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة