يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعديل الجزيئي بواسطة shRNAs المحددة التي يتم توصيلها بواسطة فيروس Lentivirus في الخلايا العصبية المجهدة للشبكة الإندوبلازمية

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61974

⸱

أبريل 24, 2021

 ,  , 
1Instituto de Investigación Médica M y M Ferreyra, INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، تم هدم التعبير لاثنين من مكونات الإشارات النهائية لمسار PERK ، الكالسينورين الواقي للخلايا و CHOP المؤيد لموت الخلايا المبرمج ، باستخدام shRNAs محددة. بطرق معاكسة ، تعدل هذه قابلية الخلايا العصبية القشرية الأولية لضمور الخلايا العصبية بعد تحريض إجهاد الشبكة الإندوبلازمية.

الملخص

يؤدي تراكم البروتينات غير المطوية داخل الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، الناجم عن أي حالة إجهاد ، إلى استجابة البروتين غير المطوية (UPR) من خلال تنشيط أجهزة الاستشعار المتخصصة. يحاول الاستعراض الدوري الشامل أولا استعادة التوازن. ولكن إذا استمر الضرر ، فإن الإشارات تحفز موت الخلايا المبرمج.

هناك أدلة متزايدة على أن إجهاد الطوارئ المستمر وغير المحلوف يساهم في العديد من الحالات المرضية بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية. نظرا لأن الاستعراض الدوري الشامل يتحكم في مصير الخلية عن طريق التبديل بين عمليات الحماية الخلوية وموت الخلايا المبرمج ، فمن الضروري فهم الأحداث التي تحدد هذا الانتقال ، وكذلك العناصر المشاركة في تعديله.

في الآونة الأخيرة ، أثبتنا أن تراكم العقد GM2 غير الطبيعي يسبب استنفاد محتوى ER Ca2+ ، والذي بدوره ينشط PERK (كيناز PKR-like-ER) ، أحد مستشعرات الاستعراض الدوري الشامل. علاوة على ذلك ، تشارك إشارات PERK في ضمور الخلايا العصبية وموت الخلايا المبرمج الناجم عن تراكم GM2. في هذا الصدد ، أنشأنا نظاما تجريبيا يسمح لنا بتعديل التعبير الجزيئي عن مكونات PERK النهائية وبالتالي تغيير ضعف الخلايا العصبية للخضوع لضمور عصبي.

أجرينا ضربة قاضية للكالسينورين (cytoprotective) و CHOP (مؤيد apoptotic) التعبير في الثقافات العصبية القشرية للفئران. أصيبت الخلايا بالحمض النووي الريبي المحدد الذي يتم توصيله بواسطة فيروس العدس ثم عولجت ب GM2 في أوقات مختلفة ، مثبتة وملطخة بالمناعة بجسم مضاد ل MAP2 (البروتين 2 المرتبط بالأنابيب الدقيقة). في وقت لاحق ، تم تسجيل صور الخلايا باستخدام مجهر مضان وتم تقييم إجمالي نمو الخلايا العصبية باستخدام برنامج معالجة صور المجال العام ImageJ. من الواضح أن تثبيط التعبير عن مكونات إشارات PERK هذه جعل من الممكن إما تسريع أو تأخير الضمور العصبي الناجم عن إجهاد ER.

يمكن استخدام هذا النهج في نماذج نظام الخلية لإجهاد ER لتقييم مدى تعرض الخلايا العصبية لضمور الخلايا العصبية.

المقدمة

يعرف إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) بأنه أي اضطراب يضر بقدرة طي البروتين في العضية. يؤدي تراكم البروتينات غير المطوية داخل تجويف ER إلى تنشيط إشارة سلسلة نقل تسمى استجابة البروتين غير المطوية (UPR). يتم تنظيم مسار الإشارات المعقد هذا بواسطة ثلاثة مستشعرات إجهاد: PERK (بروتين كيناز الحمض النووي الريبي [PKR] مثل ER كيناز) ، IRE1 (إنزيم يتطلب الإينوزيتول 1) و ATF6 (عامل النسخ المنشط 6). كلهم معا يحاولون استعادة التوازن. ولكن إذا استمر الإجهاد ، فإن الاستعراض الدوري الشامل يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج1.

PERK ، وهو بروتين ER عبر الغشاء ، عند إجهاد ER ، يقود فسفرة عامل بدء حقيقي النواة -2 ألفا (eIF2α) ، مما يقلل من تخليق البروتين العالمي وبالتالي حمل البروتين في ER2. لقد أثبتنا أن الكالسينورين A / B (CNA / B) ، وهو فوسفاتيز غير متجانسCa 2+ ، يربط مباشرة المجال الخلوي ل PERK ، مما يزيد من الفسفرة الذاتية ويعزز بشكل كبير تثبيط ترجمة البروتين وصلاحية الخلية 3,4. ومن المثير للاهتمام ، أن CNA / B وفيرة في دماغ الثدييات ، وتميز شكلين متساويين من الوحدة الفرعية A من CN: α و β.

تحت ضغط ER المستمر ، فإن مسار إشارات PERK هو فرع الاستعراض الدوري الشامل الوحيد الذي لا يزال نشطا ، وبالتالي يتوسط في كل من الاستجابة المؤيدة للبقاء وموت الخلايا المبرمج. في المرحلة المزمنة ، يتمثل أحد الأحداث الرئيسية في اتجاه مجرى النهر في تحريض عامل النسخ ، CHOP (بروتين متماثل ملزم CCAAT / محسن) 5. كما يتم التعرف بشكل متزايد على إجهاد ER المزمن كمساهم شائع في مجموعة واسعة من الاضطرابات المرضية ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية6. من المهم أن نفهم كيف يمكن للاستعراض الدوري الشامل أن يسهل الإشارات الواقية للخلايا بدلا من موت الخلايا 7. ومع ذلك، لا يعرف في الوقت الحاضر سوى القليل عن الآلية الدقيقة التي تتحكم في الانتقال بين مرحلتي الاستعراض الدوري الشامل.

في الآونة الأخيرة ، وجدنا أنه في الخلايا العصبية المستزرعة ، يتراكم العقد GM2 في أغشية ER ويؤدي إلى استنفاد الكالسيوم اللماعي. وهذا بدوره ينشط إشارات PERK ، التي تتوسط ضمور الخلايا العصبية وموت الخلايا المبرمج 8. في هذه الدراسة ، يتم استخدام تراكم GM2 في الخلايا العصبية المستزرعة كنموذج لنظام الخلية لضمور الخلايا العصبية الناجم عن الإجهاد ER. على وجه التحديد ، يتم التلاعب بتعبيرين عن عامل PERK ، CN-Aα و CHOP ، مما يحول الانتقال بين الأحداث المبكرة / الوقائية والمرحلة المزمنة / موت الخلايا المبرمج. لتحقيق ذلك ، يتم إسكات الجينات المعنية. وبالتالي ، فإن مزارع الخلايا العصبية القشرية الأولية مصابة ب shRNA محدد يتم توصيله بواسطة فيروس العدس. يكشف تحليل اللطخة الغربية عن انخفاض كبير في مستويات تعبير CN-Aα و CHOP مقارنة بالخلايا الضابطة المصابة بفيروس lentivirus الذي يحمل shRNA المخفوق. بعد هذا العلاج ، تخضع الخلايا العصبية لأوقات حضانة مختلفة من GM2 الخارجي ، ثابتة ، وملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة للبروتين 2 (MAP2) المرتبطة بالأنابيبالدقيقة 9. يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر التألق. يتم تقييم إجمالي نمو الخلايا العصبية بالنسبة إلى إجمالي عدد الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات المعتمدة لدليل المعهد الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يتم منح الموافقة على إجراء الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات (CICUAL) التابعة ل INIMEC-CONICET-UNC (القرار رقم 014/2017 B و 006/2017 A).

1. مزارع الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران

  1. تخدير الفئران الحوامل E18 Wistar في غرفة CO 2 بمزيج من 80٪ CO 2/20٪ O2 لمدة 60 ثانية من التعرض ثم التضحية ثم عن طريق خلع الفقرات العنقية.
  2. قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء التدفق الصفحي. استخراج الدماغ من الأجنة مع نمط ملقط # 3 ومقص الربيع الصغير الحاد على التوالي (جدول المواد) إلى حل هانكس في أطباق زراعة الخلايا.
  3. تشريح الأنسجة تحت عدسة مكبرة 20x ، باستخدام اثنين من ملقط ذات رؤوس دقيقة نمط # 5 ، فصل القشرة الأمامية عن السحايا. نقل القشرة الأمامية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتضان الأنسجة ب 3-4 مل من Trypsin-EDTA (0.25٪) لمدة 15 دقيقة ، عند 37 درجة مئوية للهضم الكيميائي.
  4. بعد الهضم ، قم بتخفيفه باستخدام 3-4 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بالإضافة إلى 10٪ مصل عجل الجنين (FCS). ثم اغسله 3 مرات بمحلول ملح هانكس المتوازن المجانيCa 2 + / Mg2+ و 0.1٪ جلوكوز عن طريق الطرد المركزي (3000 جم لمدة 5 دقائق).
  5. قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام طرف 1000 ميكرولتر ، في DMEM بالإضافة إلى 10٪ FCS (جدول المواد). ثم أجهزة الطرد المركزي المجانسة في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة ، وجمع طاف واستكمال الحجم المتبقي إلى 1000 ميكرولتر.
  6. طبق معلق الخلية على أطباق زراعة الخلايا بكثافة 520 خلية / مم 2 مع2 مل من DMEM يحتوي على 10٪ FCS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1٪ من مادة مضافة أساسية للحمض الأميني (انظر جدول المواد). ثم احتضان في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5 ٪ CO 2 لمدة2 ساعة.
    1. إزالة المواد العضوية وطلاء بولي-L-lysine لأطباق زراعة الخلايا
      1. قم بإزالة المادة العضوية عن طريق وضع المادة الزجاجية في غرفة التفاعل وإضافة 96٪ من الكحول الإيثيلي لتغطية المادة تقريبا. ثم أضف 68٪ (وزن / حجم) من حمض النيتريك قطرة قطرة حتى تبدأ الفقاعات ذات اللون البني المخضر في الظهور. بمجرد حدوث ذلك ، قم بتغطية الحاوية جزئيا واترك التفاعل يستمر حتى يتوقف الانفجار.
        ملاحظة: قم بإزالة المادة العضوية الموجودة أسفل كابينة استخراج الغاز لتجنب التعرض للغازات الضارة.
      2. قبل طلاء poly-L-lysine ، شطف النظارات بماء Mili-Q المعقم حوالي عشر مرات. ثم احتضان أكواب وأطباق الثقافة مع 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر بولي-L-ليسين لمدة 4 ساعات قبل استخدامها. بعد الحضانة ، شطف النظارات بماء Mili-Q المعقم حوالي عشر مرات.
  7. للسماح بتمايز الخلايا العصبية ، قم بتغيير الوسط للحصول على وسط عصبي قاعدي خال من المصل ، باستخدام المكمل الخالي من المصل (جدول المواد). الحفاظ على المزارع في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 حتى العلاج.

2. إنتاج فيروس Lentivirus

ملاحظة: يتم سرد oligonucleotides التي تحتوي على التسلسلات التي تستهدف 3'UTRs إما من الشكل المتماثل CN-Aα أو CHOP ومع التسلسلات غير المستهدفة (التدافع) في الجدول 1.

  1. بالنسبة للتلدين ، امزج اثنين من قليل النيوكليوتيدات أحادي الشريط مع تسلسلات تكميلية بكميات مولية متساوية ، باستخدام مخزن التلدين (10 مللي متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5-8.0 ، 50 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 1 مللي متر EDTA).
  2. يسخن على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم يبرد ببطء عن طريق نقل العينات من كتلة الحرارة أو حمام مائي إلى سطح الطاولة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف المنتج الناتج [الحمض النووي الريبي قصير الشعر ، (shRNA) بنهايات متماسكة] إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومتر ، وقم بقسمها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  3. استنساخ إدخال shRNA في ناقل الفيروس العدسي pLKO.3G ، مع GFP كعلامة فلورية خضراء. لهذا ، هضم 1 ميكروغرام من المتجه مع إنزيمات تقييد EcoRI و PacI عن طريق خلط ما يلي في أنبوب معقم: 2 ميكرولتر من محلول إنزيم تقييد 10x (100 mM bis-Tris propane-HCl ، pH 6.5 ، 100 mM MgCl2 ، 1 mg / mL ألبومين مصل البقري) ، 1 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر pLKO.3G ، 0.5 ميكرولتر من 10 وحدة / ميكرولتر ECoRI ، 0.5 ميكرولتر من PacI (10 وحدة / ميكرولتر) ، و 16 ميكرولتر من الماء المتأين المعقم.
    1. تخلط بلطف عن طريق الماصة. احتضان التفاعل لمدة 3-4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الهضم بين عشية وضحاها غير ضروري بشكل عام وقد يؤدي إلى تدهور الحمض النووي.
  4. للربط ، امزج المتجه المهضوم وأدخله بنسبة مولية 3: 1 واحتضنه باستخدام T4 ligase و ligase buffer (المقدم من الشركة المصنعة) طوال الليل عند 16 درجة مئوية.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن تخزين تفاعل الربط عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  5. قم بتحويل الخلايا المختصة DH5α (جدول المواد) أو سلالة E. coli مناسبة أخرى مع تفاعل الربط على النحو التالي.
    1. امزج الإشريكية القولونية المختصة مع الحجم الكلي لتفاعل الربط وقم بتبريده على الثلج لمدة 15 دقيقة ، ثم ضعه في حمام 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم برد على الثلج مرة أخرى لمدة 15 دقيقة.
    2. انقل الحجم الكلي المعرض لصدمة حرارية إلى أنبوب سعة 15 مل وأكمل الحجم إلى 1000 ميكرولتر باستخدام وسط سائل Luria-Bertani (LB) الذي تم الحفاظ عليه مسبقا عند 37 درجة مئوية. رج البكتيريا لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند حوالي 330 دورة في الدقيقة.
    3. قم بطردها عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من 900 ميكرولتر من المادة الطافية. استخدم المادة الطافية المتبقية لإعادة تعليق الحبيبات. انشر معلق البكتيريا بالتساوي على لوح LB أمبيسيلين صلب (100 ميكروغرام / مل).
    4. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم تحقق من نمو البكتيريا. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين البكتيريا عند 4 درجات مئوية لمدة 4-5 أيام.
    5. اختر مستعمرة واحدة لنقلها إلى أنبوب سعة 50 مل مع 10 مل من وسط سائل LB وأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل). رج البكتيريا عند 37 درجة مئوية عند حوالي 330 دورة في الدقيقة.
    6. قم بطرد مركزي للثقافة لتكوير البكتيريا عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية وحافظ على الحبيبات البكتيرية. يمكن تخزين هذا في -20 درجة مئوية.
  6. تنقية البلازميد باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي من حبيبات البكتيريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). احسب تركيز الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر والضرب في عامل التخفيف ، باستخدام العلاقة التالية:A 260 من 1.0 = 50 ميكروغرام / مل الحمض النووي المزدوج النقي (ds).

3. عدوى فيروس لينتي

ملاحظة: قم بإجراء توليد الفيروس العدسي في غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية.

  1. 24 ساعة قبل النقل ، البذور 1-5 × 106 HEK 293 خلية في 100 مم من أطباق الاستزراع ذات القطر في 8 مل من وسط النمو واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. امزج 14 ميكروغرام من ناقل pKLO.3G مع إدراج محدد ، و 10.5 ميكروغرام من psPAX بلازميد التعبئة و 3.5 ميكروغرام من مغلف البلازميد pMD2.G (جدول المواد). تمييع 45 ميكرولتر من كاشف نقل البلازميد (جدول المواد) في 700 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة (جدول المواد) واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم يمزج خليط الحمض النووي مع كاشف نقل البلازميد المخفف ، ويخلط بلطف ، ويحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. وفي الوقت نفسه ، قم بتغيير DMEM الطازج وسط طبق الاستزراع لمزارع الخلايا HEK 293 (70٪ متقاربة في وقت النقل). ثم أضف الحجم الكامل لمحلول الحمض النووي قطرة قطرة. هز الطبق بلطف. ليس من الضروري إضافة / تغيير وسيط بعد النقل.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة - 72 ساعة للسماح ل shRNAs بالوصول إلى نقلها الأمثل الذي تم فحصه بواسطة مضان GFP باستخدام مجهر مضان. بعد ذلك ، اجمع الوسط مع فيروس lentivirus واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. ترشيح طاف فيروسي بغشاء نايلون 0.45 ميكرومتر. قسمة التدفق في 1 مل. بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة 4 ساعات. تخلص من المادة الطافية وحافظ على الحبيبات. اترك الحبيبات غير المرئية تجف ، وبمجرد تجفيفها ، قم بتخزينها في درجة حرارة - 80 درجة مئوية.
    1. إجراء المعايرة الفيروسية عن طريق قياس التدفق الخلوي. البذور 4 × 105 خلايا HEK 293 في لوحات 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم أعد تعليق الجسيمات الفيروسية في 200 ميكرولتر من وسط زراعة DMEM (جدول المواد) وأضف 0.05 و 0.02 و 0.005 ميكرولتر إلى كل بئر.
    2. احتضان العدوى الفيروسية لمدة 72 ساعة ، وإزالة المتوسطة والتربسين (0.05 ٪ التربسين ، 1 مل) لمدة 3 دقائق. أضف 1 مل من DMEM في محلول FCS 10٪ وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
    3. أعد تعليق الحبيبات ب 100 ميكرولتر من PBS وقم بإصلاح الخلايا ب 100 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS. تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية لخلايا الفلورسنت GFP. اجمع هذه البيانات لحساب المعايرة الفيروسية باستخدام الصيغة التالية:
      المعايرة الفيروسية
      figure-protocol-1

4. تم التأكيد على مزارع الخلايا العصبية الأولية مع تراكم GM2 العقدي والكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل MAP2

  1. تصيب مزارع الخلايا العصبية القشرية الأولية (15 يوما في المختبر) بقليل نيوكليوتيدات shRNA محددة تستهدف 3 'UTRs إما CN-Aα أو CHOP واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة يوم واحد.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مزارع الخلايا العصبية القشرية الأولية لمدة 7-8 أيام في المختبر إذا أظهرت الخلايا نموا عصبيا عاليا.
    1. قم بإعداد محلول مخزون 500 ميكرومتر من ganglioside GM2 في الإيثانول وصوتينته لمدة 1 ساعة.
    2. أضف محلول مرق GM2 إلى وسط أطباق الاستزراع بتركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر. اتركيه يحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 16 و 24 و 48 ساعة.
  2. استخدم بعض الثقافات لإعداد التجانس الخلوي لتحليل اللطخة الغربية (لمعرفة مواصفات الأجسام المضادة ، انظر جدول المواد).
  3. اتبع الخطوات 1.4. و 1.5. ثم قم بإصلاح الخلايا باستخدام 4٪ PFA وسكروز 120 mM في PBS لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسلها باستخدام PBS. نفذ هذا الإجراء على غشاء مضاد للانزلاق في غرفة رطبة. بعد ذلك ، أضف محلول النفاذية (0.2٪ Triton X-100 في PBS) لمدة 5 دقائق واغسله باستخدام PBS.
    1. استخدم 5٪ BSA مخففا في PBS لمدة 45 دقيقة للسماح بالحجب ، ثم احتضانه بجسم مضاد ل MAP2 ، مخفف 1: 800 في محلول مانع ، عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    2. في نهاية وقت الحضانة ، اغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) لمدة 1 ساعة. ثم اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتركيب النظارات على شرائح باستخدام وسيط تركيب مائي (جدول المواد).

5. تحليل ضمور الخلايا العصبية

  1. احصل على صور باستخدام عدسة هواء 20x (NA 0.8) باستخدام مجهر مقلوب بالتألق مزود بكاميرا CCD. تحليل الصور باستخدام المكونات الإضافية ImageJ. لهذا ، قم بتحميل الصورة إلى ImageJ واطرح الخلفية بالنقر فوق عملية | طرح الخلفية.
  2. انقر على الصورة | ضبط | عتبة أو اكتب المفاتيح التالية: Ctrl (أو Cmd) + Shift + T. تنبثق نافذة مفتوحة لضبط القيم الدنيا، مما يسمح بتمييز تتبع المسار والسوما. انقر على الصورة الثنائية (الخلايا العصبية و somas بيضاء اللون). في هذه الصورة ، استخدم التحديد اليدوي لحذف somas ؛ تتحول منطقة SOMA المحددة إلى اللون الأسود مرة أخرى.
  3. حدد عمليات التتبع وانقر فوق تحرير | الاختيار | إنشاء التحديد. احصل على عائد الاستثمار بالنقر فوق مفاتيح Ctrl (أو Cmd) و T للتحديد وحفظه. افتح الصورة الأصلية ، ثم انقر فوق لوحة مدير عائد الاستثمار وحدد عائد الاستثمار التابع ، الذي تم الحصول عليه مسبقا. ثم انقر على الصورة الأصلية.
  4. بمجرد تتبع عائد الاستثمار على الصورة ، اكتب مفتاحي Ctrl (أو Cmd) و M (تحليل | التدبير). نافذة مفتوحة للملوثات العضوية الثابتة. انسخ القيمة المتوسطة (الوحدات التعسفية a.u.) لمعالجة التحليل الإحصائي.
    ملاحظة: للحصول على القيم ك μm ، انقر فوق تحليل | تعيين مقياس. تنبثق نافذة مفتوحة لتعيين القيم. تأكد من إضافة المقياس الصحيح (تحليل | ضبط المقياس) اعتمادا على خصائص المجهر المستخدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا ، نتناول مسألة ما إذا كان إسكات مكونين من مكونات PERK النهائية يؤثر على المرحلة الانتقالية من الاستعراض الدوري الشامل في نموذج خلية الإجهاد ER. لتحقيق ذلك ، نقوم بإسكات جين CN-Aα وكذلك جين CHOP بواسطة تسلسلين محددين من shRNA لكل منهما (الجدول 1) في زراعة الخلايا العصبية الأولية لمدة يومواحد 10. يتم تحليل التعبير عن طريق النشاف الغربي (الشكل 1 والشكل 2). لوحظ تثبيط واضح لزيادة CN-Aα و CHOP بوساطة الإج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفنا نظاما تجريبيا يتيح التعديل الجزيئي للانتقال من مراحل البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة الاستعراض الدوري الشامل لموت الخلايا المبرمج في نموذج الخلية العصبية.

لإجراء تحليل مناسب لضمور الخلايا العصبية ، من الضروري الحصول على ثقافات الخلايا العصبية الأولية مع العديد من العمليات الطويلة والمتفرعة للغاية 9,11. هذا يسهل فحص تمديد عملية الخلايا العصبية ، مما يسمح باكتشاف الاختلافات الواضحة بين العلاجات. من المهم ملاحظة أنه إذا أظهرت مزارع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور غونزالو كواسولو على مساعدته القيمة في التصوير والدكتور أندريا بيليجريني على الدعم الفني لزراعة الخلايا.

تم دعم هذا البحث بمنح من: المعهد الوطني للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية (#RO1AG058778-01A1 ، اتفاقية المنح الفرعية رقم 165148/165147 بين UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) ومن الوكالة الوطنية للوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي ، الأرجنتين (ANPCyT ، PICT 2017 # 0618).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 488 المضاد للفأرثيرمو فيشر العلمي#R37120
مضاد لchopThermo Fisher# MA1 - 250
Anti-CN-A & alpha ؛Millipore# 07-067
Anti-GM2Matreya# 1961
anti-MAP2Sigma Aldrich# M2320
مضاد للبيتا ؛ الأكتينثيرمو فيشر# PA1 - 183
أبروتينينسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية# 3595
Axiovert 200 مجهر التألقZeiss
B27 تكميليلتقنيات الحياة# 17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies# 11966025
EcoRIPromega#R6011
مصل عجل الجنين (FCS) LifeTechnologies# 16000044
ملقط Fine-tippeds   ; style # 5Dumont
Soft Style # 3Dumont
HEK 293ATCC#CRL-1573
IRDye 680 CW الجسم المضاد الثانويLI-COR Biosciences# 92632221
IRDye 680 الجسم المضاد الثانويLI-COR Biosciences# 92632220
IRDye 800 CW الجسم المضاد الثانويLI-COR Biosciences# 92632210
IRDye 800 CW الجسم المضاد الثانويLI-COR العلوم البيولوجية# 92632211
البلازميد المغلف الفيروسي pMD2.GAddgene# 12259
البلازميد التعبئة الفيروسي psPAX2Addgene# 12260
ناقل الفيروس pLKO.3GAddgene# 14748
Leupeptin hemisulfateSanta Cruz Biotechnology# 295358
Lipofectamine LTX & amp كاشف Plus (كاشف نقل البلازميد)Life Technologies#A12621
MISSION shRNASigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2Matryya# 1502
NanoDrop 2000تقنيات العمر المتوسط العصبي
الحراري العلمي # 21103049
غشاء النيتروسليلوز 0.45 & الصغيره; mBIO-RAD# 1620115
نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء OdysseyLI-COR Bioscience
OneShot Top 10Life Technology#C404010
Opti-MEM (وسائط مصل مخفضة) LifeTechnologies # 105802
PacIBioLabs#R0547S
البنسلين والستربتومايسينلايف# 15140122
Pepstatin Aسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية# 45036
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية# 329-98-6
Poly-L-lysinesigma aldrichP # 2636
مقص زنبركي صغير حاد مستقيمأدوات العلوم
الدقيقة T4 DNA LigasePromega#M1801
Trypsin-EDTA 0.25٪Life Technologies# 25200056
سائل بالموجات فوق الصوتية Vibra-Cell (VCX 130)Sonics
Wizard بالإضافة إلى نظام تنقية الحمض النووي SV MiniprepsPromega#A1330
العصبي تقنيات معالج معالج

المراجع

  1. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
  2. Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
  3. Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
  4. Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
  5. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
  6. Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
  7. Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
  8. Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
  9. Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
  10. Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  12. Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
  13. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
  14. Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

shRNA A alpha CHOP MAP2 GM2
التعديل الجزيئي بواسطة shRNAs المحددة التي يتم توصيلها بواسطة فيروس Lentivirus في الخلايا العصبية المجهدة للشبكة الإندوبلازمية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.