مقالة منهجية

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

DOI:

10.3791/61994

⸱

نوفمبر 9, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Institute of Chemistry, University of Sao Paulo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الربط قبل مرنا هي عملية ديناميكية للغاية التي تنطوي على العديد من الإعادة ترتيب الجزيئية من الربط الفرعي اللصقات أثناء التجميع، وتجهيز الحمض النووي الريبي، والإفراج عن المكونات المعقدة. وقد استخدم الطرد المركزي التدرج الجلسرين لفصل البروتين أو RNP (ريبونوكليوبروتين) مجمعات للدراسات الوظيفية والهيكلية. هنا ، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج) ، والتي وضعت لأول مرة لتنقية واستقرار المجمعات الجزيئية الكلية للجسيم واحد المجهر الكريكترون المبرد ، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرة لمجمع الربط. وتستند هذه الطريقة إلى الطرد المركزي للعينات في تركيز متزايد من كاشف التثبيت لتحقيق الاستقرار في المجمعات. بعد الطرد المركزي من خلاصات الخميرة الإجمالية المحملة على تدرجات الجلسرين ، يتم تحليل الكسور المستردة بواسطة نقطة لطخة لتحديد المجمعات الفرعية اللصق وتحديد وجود عوامل الربط الفردية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الربط هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب ربط وإطلاق العديد من العوامل بطريقة منسقة. وتشمل هذه العوامل الربط البروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي, ATPases, هيليكيس, كيناس البروتين وفوسفاتاسيس, ليغاسي في كل مكان, من بين أمور أخرى1,2,3; وللسماح لإعادة ترتيب الجزيئية أن يحدث، بعض هذه العوامل ربط عابر جدا إلى الربط الفرعي، مما يجعل عزل وتحديد هذه المجمعات المتوسطة RNP صعبة للغاية.

هنا، استخدمنا طريقة Grafix4،5 لتحقيق الاستقرار في التفاعل بين عامل الربط الخميرة Cwc24 معB act complex6 للسماح بتحديد العوامل الأخرى المرتبطة بيكوبليكس وتحديد ما إذا كان وpp19 ubiquitin ligase يلعب أي دور في ربط أو الافراج عن Cwc24 إلى تسعة عشر (NTC) المعقدة و إلى نهاية 5 'من intron قبل التنشيط وأول رد فعل عبر الترانس يأخذ مكان. ميزة تعريض الجزيئات الكلية لتركيز متزايد من crosslinker على طول التدرج الجلسرين هو أنه يتجنب الوصلات المتقاطعة بين المجمعات4،5، وبالتالي ، تشكيل المجاميع.

وقد استخدمت هذه الطريقة كتكميل للبروتين coimmunoprecipitation والانسحاب إلى أسفل المقايسات، والتي، على الرغم من السماح لعزل المجمعات الكبيرة، قد لا تكون موثوقة للحفاظ على التفاعلات العابرة داخل المجمعات الديناميكية الكبيرة7،8. استخدام الكواشف التثبيت في التدرج الجلسرين يستقر الربط من هذه العوامل، مما يسمح لتأكيد التفاعلات من بروتينات محددة مع الربط subcomplexes. ولأن الوصلة المتقاطعة المختارة لا رجعة فيها كيميائيا، فقد تم تحليل البروتينات الموجودة في الكسور المستردة بواسطة لطخة نقطة بعد الطرد المركزي المتدرجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخميرة إعداد استخراج مجموع

  1. تنمو خلايا الخميرة التعبير عن واحدة من عوامل الربط تنصهر على علامة TAP9 في 1 L YNB-غلو وسائل الإعلام (الخميرة النيتروجين الأساس تكملها 2٪ م / v الجلوكوز) مع الأحماض الأمينية المناسبة أو القواعد النووية, في هذه الحالة، أدينين (20 ميكروغرام/ مل)، ليوستين (30 ميكروغرام/مل)، تريبتوفان (30 ميكروغرام/مل)، حتى OD600 = 1.0.
  2. جمع الخلايا من الثقافة 1 لتر عن طريق الطرد المركزي في ثلاث زجاجات الطرد المركزي 500 مل في 17000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وغسل مرتين مع 10 مل الماء البارد العقيم.
  3. Resuspend خلايا الخميرة التي تم جمعها في 1/10 من حجم الخلية من العازلة الباردة A (10 مليمول L-1 HEPES pH = 7.9، 1.5 ملليمول L-1 MgCl2، 50 ملليمول L-1 KCl ، 5٪ v / v الجلسرين ، 0.5 ملليمول L-1 DTT ، كوكتيل مثبطات Protease الخالي من EDTA).
  4. تجميد قطرات صغيرة من تعليق الخلية في النيتروجين السائل. يمكن الحصول على قطرات صغيرة عن طريق pipetting محلول الخلية resuspended وإسقاط 50 ميكرولتر مباشرة إلى النيتروجين السائل.
    تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل إصابات ملامسة للبشرة أو العينين. التعامل مع استخدام معدات السلامة المخصصة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين قطرات تجميد تعليق الخلية عند -80 درجة مئوية.
  5. إعداد خلايا الخميرة lysates عن طريق طحن في جهاز مطحنة الكرة من خلال ست دورات في 20 هرتز / ثانية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: بعد كل دورة، تزج الحاوية التي تؤوي الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل لتجنب ذوبان. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين المستخلصات المجمدة عند -80 درجة مئوية. ويمكن أيضا أن تكون مستعدة مقتطفات الربط الخميرة باستخدام المتجانسات لlysate spheroplasts10، أو باستخدام هاون والحشرات11،12.
  6. تذوب استخراج عن طريق وضع الأنابيب التي تحتوي عليها في الماء في درجة حرارة الغرفة، ويهتز في بعض الأحيان.
  7. مستخلصات الطرد المركزي عند 45,000 × غرام ل 1 ساعة عند 4 °C.
  8. قياس محتوى البروتين من supernatant تطهيرها من قبل طريقة BCA13.
  9. إعداد aliquots من مقتطفات، وتجميد سريع لهم في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. إعداد التدرج الجلسرين

  1. إعداد اثنين من حلول الجلسرين في المخزن المؤقت A, واحد يحتوي على 10٪ v/v والآخر يحتوي على 30٪ v/v الجلسرين.
  2. إضافة عامل الربط الجلوتارارالدهيد إلى 0.1٪ v/v في محلول 30٪ v/v الجلسرين ومزيج لتجانس.
    تنبيه: التعامل مع الجلوتارالدهيد داخل غطاء الدخان باستخدام معدات السلامة المناسبة.
  3. أضف 6 مل من محلول الجلسرين البارد 10٪ v/v في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 12 مل (14 × 89 مم).
  4. إضافة 6 مل من الباردة 30٪ v/v محلول الجلسرين تكملها الجلوتارارالدهيد مع حقنة تعلق على إبرة طويلة المقدمة مع جهاز ماجستير التدرج في الجزء السفلي من الأنبوب, فقط تحت 10٪ v/v حل الجلسرين.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الحل 10٪ v/v الجلسرين pipetted بعناية على الجزء العلوي من الحل 30٪ v/v الجلسرين / الجلوتارالدهيد.
  5. استخدم الجهاز الرئيسي التدرج لإنشاء تدرج كثافة مستمر.
    ملاحظة: في الجهاز الرئيسي المتدرجة، يتم وضع الأنابيب في رف مناسب وتدويرها لفترة وجيزة، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لتحديد المعلمات (الوقت / الزاوية / السرعة). في هذا العمل استخدمنا: 2:25 دقيقة / 81.5 درجة / 11 دورة في الدقيقة.
  6. إضافة بعناية 200 μL من 7٪ v/v الجلسرين / العازلة وسادة على الجزء العلوي قبل إضافة مقتطفات الخلية.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الجلسرين للوسادة أقل من محلول الجلسرين الأقل تركيزا المستخدم لإنشاء التدرج الخطي.

3. مقتطفات الطرد المركزي

  1. تحميل ما يقرب من 2 ملغ من البروتين الكلي على رأس كل 12 مل خطية الجلسرين الانحدار 10٪-30٪ الغلوتارارالدهيد مع وسادة.
  2. ضع الأنابيب في دوار دلو أرجوحة مبرد مسبقا.
    ملاحظة: التعامل مع الأنابيب بلطف لتجنب الاختلاط قبل الطرد الفائق.
  3. جهاز طرد مركزي عند 194,000 x g لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  4. Aliquot كل أنبوب 12 مل في أربعة وعشرين 500 ميكرولتر الكسور باستخدام نظام EconoSystem تكييفها أو عن طريق الأنابيب بعناية.
    ملاحظة: يتكون نظام EconoSystem المكيف من مضخة تعلجية وكاشف الأشعة فوق البنفسجية وجامع الكسور المتصل بجهاز ثقب الأنبوب. ويمكن رصد ملامح الترسيب عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.
  5. استخدام 40٪ v/v حل الجلسرين من خلال مضخة التجبير لدفع الجلسرين 10٪-30٪ الانحدار من الأنبوب إلى جامع الكسور.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين الكسور في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. تحميل 50 ميكرولتر من كل كسر مباشرة على أغشية النيتروسليلوز على بقعة نقطة أو فتحة جهاز لطخة. الكشف عن البروتين عن طريق المناعة باستخدام الأجسام المضادة ضد CBP (1:6،000، للكشف عن الجزء CBP من علامة TAP) ومكافحة أرنب IgG المقترنة مع الفجل Peroxidase (1:15،000) كأجسام مضادة ثانوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحليل الملف الشخصي للترسيب Cwc24-TAP وتحديد ما إذا كانت طريقة Grafix فعالة لتحقيق الاستقرار في ربطها بالربط subcomplexes ، فصلنا إجمالي مستخلصات الخميرة من الخلايا التي تعبر عن Cwc24-TAP من خلال الطرد المركزي على تدرجات الجلسرين ، في وجود أو عدم وجود glutaraldehyde كعامل ربط متقاطع. ثم تم تحليل عينات من أربعة وعشرين كسر 500 ميكرولتر بواسطة فتحة لطخة مع الأجسام المضادة ضد الجزء CBP من علامة TAP. تظهر النتائج أنه في غياب الوصلة المتقاطعة ، يتركز Cwc24 بين الكسور 5 و 13(الشكل 1B)، المقابلة للم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين البروتين والريبونوكليك الأحماض البروتين التفاعلات يمكن استقرت باستخدام عوامل الربط المتبادل. من المهم أن يكون المركب الناتج مستقرا لتحمل الطرد المركزي الفائق على تدرج الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تسمح شروط المخزن المؤقت التفاعل ولكن تكون صارمة بما يكفي لتجنب الربط غير محددة. في التجارب المبينة هنا، استخدمنا حل العازلة التي أنشئت بالفعل لردود الفعل الربط في المختبر15.

وينبغي تحسين سرعة ووقت الطرد المركزي للمجمعات التي يجري تحليلها. اختبرنا ظروف الترسيب الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة FAPESP (15/06477-9).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بروتين ملزمة مضاد للكالمودولين حاتمةMillipore07-482
ECL مضاد للأرانب IgGGE HealthcareNA934
EconoSystemBio-Rad1-800-424-6723أجزاء من EconoSystem المستخدمة: مضخة تمعجية ، كاشف الأشعة فوق البنفسجية ومجمع الكسور
من EDTA مثبط البروتياز كوكتيلروش11873580001
نظام استرداد الكسورBeckman Coulter270-331580جهاز تثقيب الأنبوب الذي تم توصيله بأجزاء EconoSystem
Gradient Master Model 107ipBiocomp107-201M
Mixer Mill MM 200Retsch207460001جهاز مطحنة الكرة
الدوار F12-6x500LexThermo Scientific096-062375
Sorvall RC 6 Plus جهاز الطردالمركزيThermo Scientific36-101-0816
دلو متأرجح دوار P40STهيتاشي
أجهزة الطرد المركزي الفائقة CP 80 NXهيتاشي901069
أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (14 × 89 مم)بيكمانكولتر 344059
خال

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).
  2. Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).
  3. Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
  4. Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
  5. Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
  6. Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
  7. Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
  8. Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
  12. Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
  13. Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
  14. Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
  15. Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Grafix MethodGradient FixationGlycerol Gradient CentrifugationSpliceosome SubcomplexesTransient InteractorsYeast Total ExtractDot Blot AnalysisGlutaraldehyde Cross linkerWestern BlotProtein Detection

مقالات ذات صلة