مقالة منهجية

تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) - تقنية متعددة الاستخدامات لقياس الحركية الخلوية

DOI:

10.3791/62025

⸱

مارس 18, 2021

 ,  ,  , 
1Faculty of Physics and Center for NanoScience (CeNS), Ludwig-Maximilians-Universität München, Geschwister-Scholl-Platz 1, 80539 München, Germany

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة للحصول على دورات زمنية لمراسل مضان من خلايا واحدة باستخدام صفائف micropatterned. ويصف البروتوكول إعداد صفائف أحادية الخلية، وإعداد وتشغيل المجهر الفاصل الزمني لمسح الخلايا الحية، وأداة تحليل الصور مفتوحة المصدر للاختيار المسبق الآلي، والتحكم البصري وتتبع دورات زمنية مضانة متكاملة للخلايا لكل موقع التصاق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) هو طريقة متعددة الاستخدامات لجمع الدورات الزمنية للإشارات الفلورية من الخلايا الفردية في الإنتاجية العالية. بشكل عام، يعوق الحصول على دورات الوقت خلية واحدة من الخلايا المستزرعة من قبل حركة الخلية وتنوع أشكال الخلايا. صفائف صغيرة لاصقة توحيد ظروف خلية واحدة وتسهيل تحليل الصورة. تجمع LISCA بين الميكروبات أحادية الخلية مع الفحص المجهري الفاصل زمنيا ومعالجة الصور الآلية. هنا، نقوم بوصف الخطوات التجريبية لأخذ دورات زمنية للفلورسينس أحادية الخلية في شكل LISCA. نحن خلايا العدوى المنضمة إلى صفيف micropatterned باستخدام ترميز مرنا لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ورصد الحركية التعبير eGFP من مئات الخلايا بالتوازي عن طريق المسح الضوئي المجهر الفاصل الزمني. تتم معالجة مداخن بيانات الصورة تلقائيا بواسطة برامج مطورة حديثا تدمج كثافة الفلورسينس على معالم الخلايا المحددة لإنشاء دورات زمنية للفلورسينس أحادية الخلية. نحن نثبت أن دورات وقت التعبير eGFP بعد نقل الحمض النووي الريبي موصوفة بشكل جيد من خلال نموذج ترجمة حركي بسيط يكشف عن معدلات التعبير والتدهور في الحمض النووي الريبي. تتم مناقشة تطبيقات أخرى من LISCA لارتباطات وقت الحدث من علامات متعددة في سياق الإشارة إلى موت الخلايا المبرمج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة، أصبحت أهمية التجارب ذات الخلية الواحدة واضحة. تسمح البيانات من خلايا واحدة بالتحقيق في تقلب الخلية إلى الخلية ، وحل الارتباطات المعلمة داخل الخلية والكشف عن الحركية الخلوية التي لا تزال مخفية فيقياسات الفرقة 1و2و3. من أجل التحقيق في الحركية الخلوية لآلاف الخلايا المفردة بالتوازي ، هناك حاجة إلى نهج جديدة تمكن من مراقبة الخلايا في ظل ظروف موحدة على مدى فترة زمنية تصل إلى عدة ساعات إلى عدة أيام تليها تحليل البيانات الكمية 4. هنا ، نقدم تصوير الخلايا الحية للصفائف أحادية الخلية (LISCA) ، والذي يجمع بين استخدام الصفائف المجهرية مع المجهر الفاصل الزمني وتحليل الصور الآلي.

وقد تم إنشاء عدة طرق لتوليد صفائف الخلية الواحدة microstructured ونشرت في الأدب5،6. هنا، ونحن نصف بإيجاز Microscale البلازما التي بدأت نمط البروتين (μPIPP). كما تم العثور على بروتوكول مفصل لتصنيع صفيف خلية واحدة باستخدام μPIPP في المرجع7. استخدام صفائف وحيدة الخلية تمكن من محاذاة الآلاف من الخلايا على بقع التصاق موحدة تقديم البيئات الدقيقة المحددة لكل خلية، وبالتالي يقلل من مصدر للتغير التجريبي(الشكل 1A). وتستخدم صفائف أحادية الخلية لرصد المسارات الزمنية للعلامات الفلورية التي تهدف إلى الإشارة إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. يسمح الفحص المجهري طويل الأجل في وضع الفاصل الزمني المسح الضوئي بمراقبة مساحة كبيرة من صفائف الخلية الواحدة وبالتالي أخذ عينات من بيانات الخلية الواحدة في إنتاجية عالية على مدى عدة ساعات أو حتى أيام. وهذا يولد مداخن خط الوقت من الصور من كل موقف من الصفيف (الشكل 1B). من أجل تقليل كمية كبيرة من بيانات الصورة واستخراج المقررات الزمنية ذات الخلية الواحدة المطلوبة بطريقة فعالة ، يلزم معالجة الصور الآلية التي تستفيد من تحديد مواقع الخلايا(الشكل 1C).

ويتمثل التحدي الذي تواجهه اللجنة في تكييف البروتوكولات التجريبية والأدوات الحاسوبية لتشكيل تقييم عالي الإنتاجية يولد بيانات كمية وقابلة للاستنساخ من الحركية الخلوية. في هذه المقالة نقدم وصفا خطوة بخطوة للأساليب الفردية وكيفية دمجها في اختبار LISCA. على سبيل المثال، نناقش المسار الزمني للتعبير المحسن عن البروتين الفلوري الأخضر (eGFP) بعد تسليم الحمض النووي الريبي الاصطناعي. يوصف التعبير eGFP بعد تسليم مرنا من قبل معادلات معدل رد الفعل النمذجة الترجمة وتدهور مرنا. إن تركيب وظيفة النموذج للمسار الزمني لتركيز eGFP مع قراءات LISCA لشدة الفلورسينس لكل خلية على حدة بمرور الوقت يؤدي إلى أفضل تقديرات لمعلمات النموذج مثل معدل تدهور الحمض النووي الريبي. ونتيجة لذلك، نناقش كفاءة تسليم الحمض النووي الريبي (mRNA) لاثنين من عوامل العدوى المختلفة القائمة على الدهون وكيف تختلف توزيعات المعلمات الخاصة بها.

figure-introduction-1
الشكل 1:تمثيل سير عمل LISCA الذي يجمع (أ) صفائف أحادية الخلية صغيرة النمط (B) المسح الضوئي الفاصل الزمني وتحليل الصورة الآلي (C) لسلسلة الصور المسجلة. تتكون صفائف الخلية الواحدة من نمط ثنائي الأبعاد من المربعات اللاصقة للخلايا مع مساحة مشتركة طاردة للخلايا تؤدي إلى ترتيب الخلايا على الميكروبيترن ، كما يمكن رؤيته في صورة تباين المرحلة وكذلك صورة الفلورية لخلايا التعبير عن eGFP (A). يتم تصوير المنطقة المجهرية بأكملها في وضع الفاصل الزمني المسح الضوئي التقاط الصور مرارا وتكرارا في سلسلة من المواقف(B). تتم معالجة سلسلة الصور المسجلة لقراءة كثافة الفلورسينس لكل خلية مع مرور الوقت (C). أشرطة المقياس: 500 ميكرومتر (A)، 200 ميكرومتر (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
الشكل 2:الحصول على البيانات التي تجمع بين الخلايا المفردة المجهرية (A) مع المسح الضوئي الفاصل الزمني (B). 11- واستعدادا لتجربة الفاصل الزمني، يتم إعداد صفيف أحادي الخلية يحتوي على جزء صغير ثلاثي الأبعاد من مربعات التصاق (1)، يليه بذر الخلايا ومحاذاة الخلايا على الميكروبيترن (2) وكذلك توصيل نظام التشوه بالشريحة ذات القنوات الست، مما يتيح المناولة السائلة أثناء قياس الفاصل الزمني (3). يتم إعداد تجربة المسح الضوئي الفاصل الزمني (4) ويتم إصابة الخلايا على المجهر عن طريق حقن محلول ليبوبلكليكس مرنا من خلال نظام التشوه أثناء تجربة الفاصل الزمني (5). أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. Microstructured تصنيع صفيف وحيد الخلية (الشكل 2A)

  1. إعداد المواد اللازمة لتصنيع صفيف μPIPP.
    1. إعداد المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4.
    2. إعداد المياه فائقة النحافة مع مقاومة لا تقل عن 18 MΩcm في 25 درجة مئوية.
    3. إعداد PLL (20 kDa) - ز [3.5] PEG (2 كيلو دا) (PLL-PEG) حل العمل مع تركيز 2 ملغم / مل من PLL-PEG في المياه فائقة الشراء التي تحتوي على 150 مليون م م NaCl و 10 مللي متر 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك (HEPES).
    4. إعداد محلول بروتين مصفوفة خارج الخلية لطلاء السطح: 1 ملغم / مل فيبروكتين (FN) في برنامج تلفزيوني.
    5. إعداد رقاقة السيليكون مع micropattern ملفقة من قبل التصوير الضوئي8 الذي يعمل سيد قابلة لإعادة الاستخدام. يتكون المايكروباترن من مربعات بطول حافة 30 ميكرومتر وعمق 12 ميكرومتر ومسافة بين مربعين تبلغ 60 ميكرومتر، مرتبة بستة خطوط يبلغ عرض كل منها 6 مم وارتفاع 18 ملم.
  2. مزيج بوليديمثيلسيلوكسينا (PDMS) مونومر مع 9٪ وصلة متقاطعة (كتلة ٪) باستخدام مجموعة elastomer السيليكون وdgas لحوالي 30 دقيقة حتى أنها فقاعة خالية باستخدام desiccator. يلقي رقاقة السيليكون مع ما يقرب من 3-5 ملم طبقة PDMS سميكة وdgas مرة أخرى لمدة 30 دقيقة حتى يكون خاليا من فقاعة.
    1. وضع رقاقة السيليكون مع PDMS في فرن الخبز في 50 درجة مئوية لعلاج PDMS لمدة 4 ساعة على الأقل.
  3. قص طوابع PDMS.
    1. استخدام مشرط وقطع من طبقة PDMS تحفة واحدة PDMS التي تحتوي على ستة خطوط micropattern.
    2. ضع تحفة PDMS على مقعد مع micropattern التي تواجه صعودا.
    3. قطع كل من المشارب micropattern ستة من تحفة PDMS مع شفرة حلاقة في طابع PDMS. الحرص على أن حواف الطوابع PDMS مفتوحة عن طريق قطع بعض من منطقة منقوشة.
  4. ضع طوابع PDMS على غطاء من شريحة من ست قنوات (الشكل 3-1).
    1. استخدام غطاء غير مطلي ووضع علامة على مواقف القناة من الشريحة ست قنوات عن طريق خدش بعناية احباط حماية من coverslip. ثم ضع غطاء على مقاعد البدلاء مع احباط الحماية التي تواجه لأسفل.
    2. ضع طوابع PDMS مع الميكروبيترن المواجه لأسفل على غطاء الغطاء في موضع القناة المميز باستخدام ملاقط.
    3. تحقق من مرفق طوابع PDMS تحت المجهر. إذا تم إرفاق طابع PDMS بالكامل إلى coverlip، المربعات في الاتصال تظهر أغمق من interspace. إن إرفاق ختم PDMS بالقطعة الأغطية أمر بالغ الأهمية لجودة الميكروباترن.
  5. ضع غطاء مع ستة طوابع PDMS على ذلك في منظف البلازما وعلاجه مع البلازما الأكسجين (ضغط 0.2 mbar، ~ 40 W لمدة 3 دقائق) لجعل السطوح بين الطوابع PDMS والهيدروفيليا coverslip (الشكل 3-2).
  6. تنفيذ جميع الخطوات الأخرى لتصنيع micropattern في خزانة السلامة البيولوجية. استخدام 15 ميكرولتر من محلول PLL-PEG وماصة قطرة واحدة منه بجانب كل ختم PDMS بحيث يتم امتصاص حل PLL-PEG في النمط المائي لختم PDMS (الشكل 3-3). دع PLL-PEG يحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. شطف 1 مل من المياه فائقة الشراء على غطاء مع الطوابع PDMS على ذلك وإزالة الطوابع PDMS باستخدام ملاقط (الشكل 3-4). ثم شطف coverslip للمرة الثانية مع 1 مل من المياه فائقة البور والسماح لها الجافة.
  8. عندما يجف غطاء تماما، عصا شريحة لزجة ست قنوات إلى coverlip (الشكل 3-4). الحرص على أن المناطق micropatterned تتماشى مع الجزء السفلي من القنوات.
  9. إضفاء الطابع الوظيفي على مربعات التصاق مع FN.
    1. ملء 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل قناة.
    2. إعداد حل 100 ميكروغرام /مل FN في برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من حل FN لكل قناة (الشكل 3-5). امزج محلول FN مع برنامج تلفزيوني في القناة جيدا عن طريق إزالة 40 ميكرولتر من خزان واحد وإضافته إلى الخزان المقابل لنفس القناة لمدة 3 مرات لتوليد حل متجانس. احتضان حل FN لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. غسل كل قناة ثلاث مرات مع 120 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (الشكل 3-6).
  10. للتحقق من جودة النمط، استخدم FN المسمى fluorescently في الخطوة 9.2. (الشكل 4A).
    ملاحظة: نوصي إعداد صفيف μPIPP لا يزيد عن يوم واحد قبل البذر الخلية كما PLL-PEG و FN غير مرتبطة بشكل مكافئ إلى الركيزة ونوعية النمط قد إنقاص بمرور الوقت. تخزين صفيف μPIPP المعدة في الثلاجة.

figure-protocol-2
الشكل 3:يتم ترتيبتصنيع microarray أحادي الخلية بواسطة μPIPP. (1) طوابع PDMS ذات بنية micropattern ثلاثية الأبعاد على السطح على غطاء من شريحة من ست قنوات. (2) يتم التعامل مع coverlip مع الطوابع PDMS على ذلك مع البلازما الأكسجين لجعل الأسطح hydrophilic. (3) يتم إضافة PLL-PEG. يتم امتصاصه في البنية المجهرية من قبل القوى الشعرية ويجعل الأسطح غير مغطاة بختم PDMS طارد الخلية. (4) يتم شطف غطاء مع الماء لإزالة PLL-PEG المتبقية. ثم تتم إزالة طوابع PDMS ولصق شريحة لزجة من ست قنوات إلى غطاء الغطاء. (5) فيبروكتين، وهو بروتين من مصفوفة خارج الخلية، يضاف إلى جعل المناطق دون PLL-PEG الخلية لاصقة. (6) يتم غسل الشريحة ذات الست قنوات بمحلول ملحي عازل للفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. زرع الخلايا (الشكل 2A)

ملاحظة: بالنسبة لخطوات الغسيل التالية، أضف السائل المعني إلى خزان واحد ثم قم بإزالة كمية متساوية من السائل من الخزان المقابل للقناة.

  1. غسل كل قناة مع 120 ميكرولتر من 37 درجة مئوية تكملها تماما نمو الخلايا المتوسطة. قبل إضافة تعليق الخلية، تأكد من أن القنوات فقط مليئة بالمواس المتوسطة ولكن ليس الخزانات.
  2. فصل خلايا HuH7 من قارورة ثقافة الخلية باتباع البروتوكول القياسي الخاص بك لتمرير الخلية وضبط تركيز تعليق الخلية إلى 4 × 105 خلايا / مل.
  3. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية وخلط متوسط نمو الخلية مع تعليق الخلية عن طريق إزالة 40 ميكرولتر من خزان واحد وإضافته إلى الخزان المقابل للقناة نفسها لمدة 3 مرات للوصول إلى توزيع الخلايا المتجانسة(الشكل 4B).
  4. إزالة 40 ميكرولتر من التعليق من القناة بحيث يتم تعبئة القناة فقط مع تعليق الخلية.
  5. وضع الشريحة في حاضنة والتحقق من الالتصاق الخلية 1 ساعة بعد البذر باستخدام المجهر المرحلة التباين.
  6. إضافة 120 ميكرولتر من 37 درجة مئوية متوسط نمو الخلايا الدافئة.
  7. ولكن الشريحة مرة أخرى في الحاضنة لمزيد من 3 ساعة لتمكين الخلوية التنظيم الذاتي على micropattern(الشكل 4C).

figure-protocol-3
الشكل 4:التنظيم الذاتي الخلوي ومراقبة الجودة لمجموعة μPIPP. (A)يتكون السطح المجهري من بقع التصاق مغلفة ب FN مربعة تظهر باللون الأحمر محاطة بوليمر طارد للخلايا. (ب) بعد بذر الخلايا، يتم توزيع خلايا HuH7 بشكل عشوائي و (C) تلتزم أساسا على بقع التصاق على مدى فترة زمنية من 4 ساعة. أعيد طبعها بإذن 7. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. نظام التغلغل (الشكل 2A)

ملاحظة: لا يلزم استخدام نظام التشوه إلا إذا كانت هناك حاجة إلى إضافة الكواشف أو العلامات الفلورية أثناء قياس الفاصل الزمني. اعتمادا على احتياجاتك، يمكنك توصيل كل قناة بنظام بث منفصل أو توصيل عدة قنوات في سلسلة إلى نفس نظام التغلغل. ويتوافق عدد نظم التشويش مع عدد الحالات التجريبية المستقلة. ربط الأنابيب في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية وتجنب إدراج فقاعات الهواء في نظام التشوه. إذا لم يتم استخدام نظام التشويش، أضف الكواشف/العلامات في خزانة السلامة الحيوية قبل قياس الفاصل الزمني. نظام التشويش هو في المنزل ملفقة، يتم سرد المواد المستخدمة في جدول المواد. وقد وصفت تجميع نظام التغلغل سابقا9.

  1. استخدام حقنة 1 مل (مع استبدال سبورن) وملء حقنة مع 1 مل من 37 °C نمو الخلايا المتوسطة.
  2. قم بتوصيل المحاقن بأنبوب المدخل باستخدام الصمام وملء الأنبوب بالمتوسط.
  3. قم بتوصيل أنبوب المدخل بخزان قناة وتأكد من عدم وجود فقاعات هوائية محاصرة.
  4. لتوصيل قناة أخرى في السلسلة بنظام التشوه هذا، قم بتوصيل موصل تسلسلي بالمخزان المقابل للأنبوب المدخل للقناة الحالية. انتقل إلى القناة التالية ثم قم بتوصيل الطرف الحر من الموصل التسلسلي بأحد خزاناته.
  5. كرر الخطوات السابقة حتى يتم توصيل العدد المطلوب من القنوات في السلسلة.
  6. قم بتوصيل أنبوب المنفذ مباشرة بخزان القناة الحالية المجاني. ملء أنبوب متصل مع المتوسطة من أجل التحقق من أن نظام التسريب لا تسرب.
  7. كرر الخطوات السابقة حتى يتم توصيل كافة القنوات الستة للشريحة بنظام perfusion.
  8. ضع الشريحة مع نظام (أجهزة) التشوه المتصلة في الحاضنة حتى يتم استخدامها أو وضعها مباشرة في غرفة التدفئة بالمجهر التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية لقياس الفاصل الزمني.

4. الوقت الفاصل المجهري (الشكل 2B)

ملاحظة: للقياسات طويلة الأجل، حافظ على درجة حرارة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ومستوىمستقر من ثاني أكسيد الكربون. كبديل لثانيأكسيد الكربون تعتمد على الخلايا المتوسطة النمو، استخدم L15 المتوسطة التي لا يلزم نظام حضانة الغاز.

ملاحظة: للتصوير الكمي، استخدم وسيط نمو الخلية بدون فينول أحمر أثناء قياس الفاصل الزمني لتقليل مضان الخلفية واستخدام نفس إعدادات بروتوكول الفاصل الزمني وكذلك المجهر نفسه للنسخ المتماثلة التقنية.

  1. إعداد بروتوكول الفاصل الزمني لتسجيل صورة التباين المرحلي وصورة مضانة مع أوقات التعرض من 750 مللي ثانية (اعتمادا على الكاميرا)، 10 دقيقة الفاصل الزمني بين حلقات متتالية من خلال قائمة الموقف، ووقت المراقبة من 30 ساعة، وذلك باستخدام هدف 10x والمرشحات الفلورية المناسبة.
  2. ضع الشريحة ذات الست قنوات مع الخلايا الموجودة على صفائف الخلية الواحدة في حامل العينة لغرفة التدفئة الدافئة التي يبلغ ارتفاعها 37 درجة مئوية. إذا كانت أنظمة التشويش متصلة بالشريحة ذات الست قنوات، قم بإصلاح الأنابيب إلى المرحلة باستخدام بعض الأشرطة لضمان عدم نقل الشريحة ذات الست قنوات أثناء التبادل السائل. أدخل النهايات الحرة لأنابيب المنفذ من خلال ثقب أنبوب تفاعل سعة 15 مل لجمع النفايات السائلة.
  3. تعيين قائمة الموضع لقياس الفاصل الزمني للمسح الضوئي. تأكد من إمكانية مسح عدد المواضع ضوئيا ضمن الفاصل الزمني المحدد بين الحلقات المتتالية عبر قائمة المواضع. مع هدف 10x ، يمكن تعيين 10-30 موقعا لكل قناة لمسح إجمالي منطقة micropattern اعتمادا على حجم رقاقة الكاميرا.
  4. بدء قياس الفاصل الزمني. للحصول على جودة صورة أفضل للقياسات طويلة الأجل، استخدم نظام تصحيح التركيز التلقائي.

5. علامة الفلورسنت - مرنا transfection (الشكل 2B)

ملاحظة: بالنسبة لإصابة في قناتين متصلتين بنظام أنابيب، يلزم وجود حجم إجمالي قدره 600 ميكرولتر من خليط العدوى (300 ميكرولتر لقناة واحدة). تشير وحدات التخزين المشار إليها إلى إصابة في قناتين متصلتين.

  1. إعداد محلول عامل العدوى عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من عامل العدوى في 200 ميكرولتر من المتوسطة انخفاض المصل والسماح للحل احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد محلول مرنا عن طريق تخفيف 300 نانوغرام من ترميز مرنا لeGFP في 150 ميكرولتر من المتوسطة انخفاض المصل.
  3. إعداد مزيج العدوى عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول عامل العدوى إلى محلول مرنا ومزجها بشكل جيد. دع مزيج العدوى يحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تدفق نظام أنابيب مع 1 مل من 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني دافئ باستخدام حقنة أثناء حضانة مزيج transfection. عند تنظيف الأنابيب، تأكد من أن مرحلة المجهر لا تتحرك. إيقاف قياس الفاصل الزمني مؤقتا إذا لزم الأمر.
  5. تمييع مزيج العدوى إلى تركيز الحمض النووي الريبي النهائي من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر عن طريق إضافة 300 ميكرولتر متوسطة انخفاض المصل.
  6. قم بغسل نظام الأنابيب بمزيج العدوى باستخدام حقنة والسماح لضفيرات الدهون من الحمض النووي الريبي بالحضانة لمدة ساعة واحدة (أوقف قياس الفاصل الزمني إذا لزم الأمر).
  7. وقف حضانة العدوى وطرد lipoplexes مرنا غير منضم عن طريق غسل مع 1 مل من 37 درجة مئوية دافئة تكملها تماما وسيلة نمو الخلية باستخدام حقنة (وقفة قياس الفاصل الزمني إذا لزم الأمر).

6. تحليل الصور وقراءة مضان

  1. عند تشغيل تحليل الصورة لأول مرة، قم بتثبيت الإصدار 0.1.6 من برنامج مفتوح المصدر "تحليل البنية المجهرية الآلي في بيثون" (PyAMA) من الموقع المذكور10 وفقا للتعليمات المقدمة هناك.
  2. تأكد من توفر قنوات الصور (تباين المرحلة والفلورسينس) كملفات TIFF متعددة الصور 16 بت. إذا لزم الأمر، تحويلها وفقا لذلك.
  3. ابدأ PyAMA وانقر على فتح المكدس... لفتح الصور للتحليل.
  4. لفتح ملف TIFF متعدد الصور، انقر فوق فتح وحدد الملف بحيث يتم عرضه في قائمة الملفات المحملة على الجانب الأيسر من مربع الحوار (الشكل 5-1).
  5. ضع علامة على القنوات التي يجب تضمينها في التحليل. لكل قناة، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. حدد في قائمة الملفات المحملة ملف TIFF الذي يحتوي على القناة.
    2. في المقطع إضافة قناة جديدة، حدد فهرس القناة في ملف TIFF. الفهرسة هي صفرية؛ القناة الأولى لديها مؤشر 0، والقناة الثانية لديها مؤشر 1 وهلم جرا.
    3. حدد نوع القناة. حدد تباين المرحلة أو الفلورسينس لقنوات الصور المناظرة والتجزئة لقناة ثنائية تشير إلى ملامح الخلية.
    4. اختياريا، أدخل ملصق القناة لتمييز قنوات الفلورسينس المختلفة: eGFP و DAPI.
    5. بعد تكوين القناة، انقر فوق إضافة.
  6. عند عرض كافة القنوات المضافة في قائمة القنوات على الجانب الأيمن من مربع الحوار، انقر فوق موافق لتحميل المكدس.
  7. لإجراء التقسيم باستخدام خوارزمية التقسيم المضمنة في PyAMA للتعرف على الخلايا استنادا إلى صور تباين الطور(الشكل 5-2)، انتقل إلى Tools | بينارز... وأدخل اسم ملف لملف NumPy مع القناة الثنائية.
    ملاحظة: في الإصدار الحالي، يتطلب تحميل القناة الثنائية إعادة تحميل كافة القنوات.
  8. لإجراء تصحيح الخلفية11 على قناة مضان (الشكل 5-3)، تأكد من تحميل قناة مضان وقناة تجزئة. إذا لم يتم تحميل قناة تجزئة، تأكد من تحميل قناة تباين المرحلة للتجزئة التلقائية. انتقل إلى "أدوات > تصحيح الخلفية..." وحدد اسم ملف لملف TIFF الناتج مع قناة الفلورسينس المصححة.
    ملاحظة: في الإصدار الحالي، يتطلب تحميل القناة تصحيح الخلفية إعادة تحميل كافة القنوات.
  9. تفقد الخلايا المختارة مسبقا(الشكل 5-4)وإشاراتها الفلورية المتكاملة(الشكل 5-5)من خلال التمرير عبر الأطر الزمنية، وعرض القنوات المدرجة في قائمة القناة على الجانب الأيسر والنقر على الخلايا لتسليط الضوء على دوراتها الزمنية الفلورية(الشكل 1C). استخدم تحديد الخلية لاستبعاد الخلايا غير القابلة للتطبيق، أو غير المحصورة في بقعة التصاق أو المرفقة بخلية أخرى من التحليل الإضافي. تبديل اختيار الخلايا للقراءة عن طريق الضغط على Shift والنقر على الخلية، أو عن طريق تمييز الخلية والضغط على Enter.
  10. حفظ الدورات الزمنية وحيدة الخلية لمنطقة الخلية والمضان المتكامل(الشكل 5-6)عن طريق النقر على ملف | حفظ دليل وتحديده لحفظه.

figure-protocol-4
الشكل 5: يتم استيرادمعالجة الصور الآلية لسلسلة الصور الفاصلة زمنيا باستخدام PyAMA. (1) سلسلة صور التباين التدريجي والفلورسينس لكل موضع تصوير. (2) يتم تحديد معالم الخلية عن طريق التقسيم على كومة صورة التباين المرحلي. (3) يتم تطبيق تصحيح الخلفية على الصور الفلورية. (4) يتم تعقب ملامح الخلية مع مرور الوقت ويتم اختيارها مسبقا للتصدير. (5) يتم دمج كثافة الفلورسينس على أساس ملامح الخلية المتعقبة. (6) يتم تقييم مناطق الخلية الواحدة وكثافات الفلورسينس المتكاملة وتصدير دورات زمنية لكل خلية. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لتحليل حركية الترجمة بعد نقل الحمض النووي الريبي ، تناسب نموذج الترجمة على أساس معادلات معدل البيوكيميائية لكل دورة زمنية من خلية واحدة كما وصفها سابقا ريزر وآخرون12. البيانات والرمز المستخدم في تلك الدراسة متاحة للجمهور13.
  2. لكل دورة زمنية من خلية واحدة، استرجع المعلمات المناسبة المقدرة لنموذج الترجمة التي تمثل معدل تدهور الحمض النووي الريبي والنقطة الزمنية لبداية الترجمة. تتم مناقشة مجموعة بيانات مثال في قسم النتائج التمثيلية.
  3. إجراء مزيد من التحليل على توزيع أفضل تقديرات المعلمات لظروف تجريبية متنوعة للتحقيق في التباين بين الخلايا داخل مجموعات الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن نهج LISCA من جمع دورات زمنية للفلورسين بكفاءة من خلايا واحدة. وكمثال تمثيلي، نوضح كيفية تطبيق أسلوب LISCA لقياس تعبير eGFP أحادي الخلية بعد العدوى. وتستخدم بيانات تجربة LISCA لتقييم الحركية تسليم مرنا، وهو أمر مهم لتطوير الأدوية مرنا كفاءة.

ونبين على وجه الخصوص التأثير المختلف لنظم تسليم الحمض النووي الريبي القائمة على الدهون فيما يتعلق بالنقطة الزمنية لبدء الترجمة ومعدل التعبير على مستوى الخلية الواحدة. قمنا باستزراع الخلايا وقسمنا الدفعة إلى مجموعتين سكانيتين. وقد تم نقل شريحة فرعية وا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا وصفنا LISCA بأنها تقنية متعددة الاستخدامات لمتابعة الحركية الخلوية للتسميات الفلورية داخل الخلايا على مستوى الخلية الواحدة. من أجل إجراء تجربة LISCA ناجحة، يجب تأسيس كل خطوة من الخطوات الموضحة من مقطع البروتوكول بشكل فردي ومن ثم يجب دمج كافة الخطوات. كل واحد من الجوانب الرئيسية الثلاثة لل LISCA يتميز بخطوات حاسمة.

تصنيع ميكرواراي أحادي الخلية
نوعية microarray أمر بالغ الأهمية كما المحاذاة الخلوية على microarray ليست مهمة فقط لجميع الخطوات التجريبية الأخرى ولكن أيضا لها تأثير عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الألمانية للعلوم (DFG) إلى مركز البحوث التعاونية (SFB) 1032. يتم الاعتراف بامتنان بدعم وزارة التعليم والبحوث والتكنولوجيا الاتحادية الألمانية (BMBF) في إطار المشروع التعاوني 05K2018-2017-06716 Medisoft بالإضافة إلى منحة من بايريشفورشونجستفتونغ. تم دعم أنيتا رايزر من خلال زمالة DFG من خلال كلية الدراسات العليا للعلوم الحيوية الكمية في ميونيخ (QBM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing فيشر ساينتفيك10178071
فرن الخبزالموثق9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10xنيكونMRH20100
المجففRothNX07.1
Eclipse Ti-Eنيكون
eGFP mRNATrilinkL-7601
أنثى Luer إلى موصل الأنبوبMEDNETFTL210-6005
مصل الأبقار الجنينيThermo Fisher10270106
FibronectinYo Proteins663
مجموعة المرشحات eGFPAHFF46-002
Fisherbrand  أنابيب سيليكون شفافة معالجة بالبلاتينفيشر 11768088
HEPES (1 م)15630080ثيرمو
حاضنة OkolabOKO-H201
حاضنةالموثق9040-0012
L-15 بدون فينول أحمرثيرموفيشر 21083027
ليبوفيكتامين 2000ثيرمو فيشر11668027
ذكر لورداخليا ملفقة تتكون من تفلون
ذكر لور إلى أنبوب موصلMEDNETMTLS210-6005بديل للسحر الذكور المصنع
NaCl (5 M)Thermo FisherAM9760G
صمام بدون إبرة إلى ذكر Luer موصلMEDNETNVFMLPC
NIS عناصرنيكونبرنامج التصوير الإصدار 5.02.00
NOA81ThorlabsNOA81لاصق بصري سريع المعالجة لتجميع نظام
الأنبوب Opti-MEMThermo Fisher31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCOpco
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)محضر داخليا
منظف البلازماDiener FemtoPico-BRS
PLL(20 كيلو دالتون) -ز[3.5]-PEG(2 كيلو دالتون)SuSoS AG
رقاقة السيليكون mit mircorstructuresالداخلية المصنعة
Sola Light EngineLumencor
الشريحة اللاصقة VI 0.4 & nbsp;ibii80608
Sylgard 184 سيليكون المطاط الصناعي كيتداو كورنينج1673921
تانغو 2م & أومل ؛ rzh ä المستخدم00-24-626-0000
فائقة النقاءمعدة
في المنزل أغطية غير مطلية ibidi10813
Injekt-F Solo ، 1 ملOmilab9166017Vمع بديل sporn
علمية صندوق حضانة فيشر داخليا مياه

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  2. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
  3. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  4. El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
  5. Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005(2016).
  6. Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
  7. Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
  8. Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
  9. Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
  10. Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
  11. Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
  12. Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
  13. Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
  14. Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
  15. Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
  16. Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077(2019).
  17. Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
  18. Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8(2016).
  19. Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
  20. Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
  21. Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EGFP mRNA

مقالات ذات صلة