يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62027

⸱

أبريل 18, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Northwest Normal University, 2State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم طريقة بسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض حمار وحشي، والتي سوف تسهل التحقيقات في تطور المبيض في حمار وحشي.

الملخص

أصبح حمار وحشي نموذجا مثاليا لدراسة تطور المبيض من الفقاريات. الجريبات هي الوحدة الأساسية للمبيض ، والتي تتكون من البويضات والخلايا الجريبية المحيطة بها. من الضروري فصل كل من الخلايا الجريبية والبويضات لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية ، وتحليل التعبير الجيني ، ونضوج البويضات والإخصاب في المختبر ، إلخ. تستخدم الطريقة التقليدية ملقط لفصل كلا المقصورتين ، وهو أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا ويلحق ضررا كبيرا بالبويضات. هنا، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية سحبت. تحت منظار مجسم ، يمكن فصل البويضات والخلايا الجريبية بسهولة عن طريق الأنابيب في الشعيرات الدموية الزجاجية الدقيقة التي يتم سحبها (يعتمد القطر على قطر الجريب). بالمقارنة مع الطريقة التقليدية، هذه الطريقة الجديدة لديها كفاءة عالية في فصل كل من البويضات والخلايا الجريبية ولها ضرر منخفض للبويضات. والأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة على بصيلات المرحلة المبكرة بما في ذلك في مرحلة ما قبل تكوين الفيتيلوجينيسيس. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات من حمار وحشي.

المقدمة

حمار وحشي هو كائن نموذجي رئيسي لدراسة تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء. الحمار الوحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة الآليات الجزيئية لتطوير المبيض1،2،3. يتم الحفاظ على العديد من ملامح تطور المبيض كثيرا خلال التطور من الأسماك إلى الثدييات1،2. على غرار الفقاريات الأخرى ، فإن البالغين حمار وحشي لديهم مبايض غير متزامنة ، تحتوي على بصيلات المبيض لجميع مراحل النمو4. الجريب هو العنصر التناسلي الأساسي للمبيض. تتكون الجريبات من البويضات التي تحيط بها طبقة أو عدة طبقات من الخلايا الجسدية تسمى الخلايا الجريبية. يعتمد تطور الجريبات على الاتصال ثنائي الاتجاه بين البويضات والخلايا الجريبية5. من الضروري فصل الخلايا الجريبية والبويضات عن بصيلات المبيض لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية، وتحليل التعبير الجيني، ونضوج البويضات، والإخصاب في المختبر.

طرق الفصل التقليدية تشمل الفصل الميكانيكي بواسطة ملقط والهضم الأنزيمي6،7،8،9،10. ومع ذلك ، فإن الفصل الميكانيكي عن طريق ملقط يستغرق وقتا طويلا وشاقة. وسوف يسبب أيضا ضررا كبيرا على البويضات أثناء الانفصال. على الرغم من أن طريقة هضم الإنزيم بسيطة للعمل وتتطلب وقتا قصيرا ، إلا أنه يجب التحقق من صحة وقت العلاج وتركيز الإنزيم ، ومعدل سلامة البويضات المعزولة وبقائها ليست مثالية. لذلك، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين في مراحل النمو المختلفة باستخدام أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية المنسحبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات التي أجريت في تجارب الأسماك تتفق مع لوائح لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في جامعة نورث ويست العادية.

1. الاستعدادات

  1. الحيوانات
    1. استخدام حمار وحشي أنثى بالغة مع طول الجسم من 4-6 سم.
      ملاحظة: استخدمنا حمار وحشي من السوق المحلية.
    2. الحفاظ على حمار وحشي في نظام المياه المتداولة مع ضوء 14 ساعة ودورة مظلمة 10 ساعة في حوالي 28 درجة مئوية.
    3. إطعام الأسماك مرتين يوميا مع الروبيان محلول ملحي فقست حديثا.
  2. سحب الشعيرات الدموية الزجاجية
    1. استخدام شعيرات زجاجية 15 سم ووضع رأسه في موقد الكحول لتسخينه. عقد نهاية واحدة من الشعيرات الدموية الزجاجية باليد وعقد الطرف الآخر مع ملقط.
    2. بعد تسخين 5-10 ثانية، والزجاج على النار من الموقد الكحول تصبح حمراء وناعمة. تمتد رأس الشعيرات الدموية الزجاجية مع ملقط لجعل افتتاح الشعرية مع القطر المطلوب.
      ملاحظة: القطر يعتمد على أقطار المسام: previtellogenic (PV؛ حوالي 0.30 مم في القطر)، فيتيلوجينيك في وقت مبكر (EV؛ حوالي 0.40 مم في القطر)، midvitellogenic (MV؛ حوالي 0.50 ملم في القطر)، في وقت متأخر vitellogenic (LV؛ حوالي 0.60 ملم في القطر) وكامل نمت ولكن غير ناضجة (FG؛ حوالي 0.65 ملم في القطر).
    3. تمتد فتح الشعيرات الدموية الزجاج إلى القطر المناسب، وهو أصغر قليلا حجم بصيلات منفصلة. لا يمكن للشعيرات الدموية الزجاجية ذات الفتحة الأكبر بكثير من حجم بصيلات المبيض إجراء فصل ، ولكن الأصغر بكثير من شأنه أن يكسر الجريبات أثناء الانفصال. ممارسة تمتد من الشعرية الزجاجية عدة مرات.
      ملاحظة: وقت التدفئة يعتمد على حجم الشعيرات الدموية الزجاجية. لا تمتد مباشرة الشعرية الزجاجية على النار من الموقد الكحول. سوف يكسر الشعيرات الدموية الزجاجية.
    4. قطع الشعرية الزجاجية مع قطع أمبولة وكسر الشعرية الزجاجية مع ملقط للحصول على شق سلس.
      ملاحظة: فتحة حادة أو مكسورة من الشعرية الزجاجية من شأنه أن يضر بصيلات.
    5. باستخدام أنبوب بلاستيكي طوله 30 سم ، أدخل طرف ماصة 1 مل مع عنصر فلتر في نهاية واحدة ، وأدخل الشعرية الزجاجية المنسحبة في نهاية المصصة ، وربط طرف ماصة 200 ميكرولتر في نهاية أخرى.

2. فصل البويضات حمار وحشي والخلايا الجريبية في مراحل مختلفة

  1. تشريح المبيض حمار وحشي
    1. ملء دلو الثلج إلى 4/5 كاملة مع الجليد الطين وإضافة ما يكفي من ماء السمك للسماح الجليد الطين تطفو. الانتظار 2-5 دقائق، والتحقق من درجة حرارة المياه، وتأكد من درجة الحرارة بين 2-4 درجة مئوية.
    2. تخدير الإناث البالغات عن طريق وضع الأسماك في الماء المثلج لمدة 2-5 دقائق على الأقل، حتى توقف الأسماك حركة الخيشوم. قطع رأس السمكة عن طريق قطع الحبل الشوكي باستخدام مقص حاد لضمان الموت.
    3. وضع السمك على لوحة تشريح مع ملقط.
    4. استخدام مقص تشريح لقطع على النحو التالي. تشريح من كلوكا إلى الخياشيم على طول خط الوسط من البطن. قطع من الجزء الخلفي من كلوكا. قطع من الطرف الأمامي إلى الجانب الظهري. إزالة الجلد والعضلات بلطف على جانب واحد من الجسم. فضح الأعضاء الداخلية والخروج من المبيض بأكمله مع ملقط.
    5. على الفور، ضع المبيضين برفق في طبق ثقافة 100 مم يحتوي على 60٪ من متوسط L-15 (L-15) من Leibovitz.
  2. عزل بصيلات المبيض
    ملاحظة: يستند نظام التدريج الذي اعتمدناه إلى التعريف الأصلي ل Selman et al.4.
    1. عزل بصيلات يدويا من مراحل مختلفة باستخدام زوج من ملقط ناعم كما هو موضح سابقا8.
    2. تجميع بصيلات المبيض في المراحل التالية: PV، EV، MV، LV و FG مراحل.
  3. فصل الخلايا الجريبية والبويضات عن بصيلات المبيض
    1. وضع بصيلات المبيض في مراحل مختلفة في طبق بيتري نظيفة تحتوي على 60٪ L-15 المتوسطة.
    2. باستخدام الشعرية الزجاجية المنسحبة من الخطوة 1.2 ، تمتص بصيلات في الشعيرات الدموية الزجاجية 2-3 سم وتفجيرها.
      ملاحظة: عندما يكون القطر الافتتاحي للشعيرات الدموية الزجاجية مناسبا ، يمكن فصل الجريب عن البويضات عن طريق الاستنشاق مرة واحدة.
      1. إذا تم إرفاق طبقة الخلية الجريبية بالبويضات بقوة ، كرر 2-3 مرات لإنجاز فصل كامل. تجنب محاولات متعددة لإجبار بصيلات من خلال أصغر الشعرية، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الجريب.
        ملاحظة: في عملية الاستنشاق والنفخ ، تسقط الطبقة الجريبية وتنفصل عن البويضات ، وأخيرا ، يتم فصل الخلايا الجريبية والبويضات الdenuded(الشكل 1).
    3. تجمع البويضات الناضحة ولكن سليمة وجمع البويضات النضحة على قيد الحياة لمزيد من المقايسات.
    4. للتحقيق فيما إذا كانت الخلايا الجريبية قد فصلت عن الجريبات السليمة، قم بتلطيخ بصيلات سليمة وفصل البويضات ب 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      1. إصلاح العينات في 4٪ paraformaldehyde المخزنة مؤقتا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة. غسل عدة مرات من قبل برنامج تلفزيوني.
      2. وصمة عار من قبل DAPI في RT لمدة 30 دقيقة. غسلها عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. عرض وتصوير مع المجهر مضان (على سبيل المثال، لايكا DFC7000 T).
    5. لتأكيد الفصل المكتمل ، قم بإصلاح الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة في 4٪ paraformaldehyde المخزنة مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، وتضمين وسيط تجميد intissue (على سبيل المثال ، لايكا) عند -25 درجة مئوية.
      1. قطع الأنسجة الثابتة على microtome، وجبل على الشرائح الزجاجية.
      2. غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وتصور نواة الخلية مع DAPI. عرض وتصوير على المجهر مضان.

3. النضج في المختبر (IVM) والإخصاب في المختبر (IVF)

ملاحظة: تم اتباع إجراء IVM من التلقيح الاصطناعي كما هو موضح سابقا مع تعديل طفيف 11،12،13.

  1. إعداد متوسطة نضوج جديدة (+DHP المتوسطة) قبل تشريح المبيض من أنثى حمار وحشي الكبار. لإعداد وسيط النضج الطازج، أضف 9 مل من متوسط L-15 من Leibovitz، درجة الحموضة 9.0، إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل. أضف 10 ميكرولتر من 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 ملغم/مل)، و490 ميكرولتر من dH2O، و500 ميكرولتر من ألبوم مصل البقر 10٪ (BSA).
  2. إعداد حل هانك والحل E3 مقدما. إعداد حل هانكس كما وصفها Baarsوآخرون. إعداد E3 المتوسطة: 5 MM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, و 1-5٪ الميثيلين الأزرق.
  3. إجراء تشريح المبيض حمار وحشي وعزل بصيلات المبيض كما هو الحال في الخطوة 2.
  4. جمع بصيلات مرحلة كاملة نمت واستخدام البويضات غير ناضجة. لكل أنثى حمار وحشي بالغة ، يمكن عزل ما لا يقل عن 150-200 بصيلات المرحلة الكاملة. حدد بصيلات سليمة وصحية لIVM.
  5. احتضان بصيلات المرحلة كاملة النمو في +DHP المتوسطة في لوحات 12 بئرا، والتحقق بشكل دوري لضمان أن البويضات لا تزال سليمة. إزالة أي البويضات lysing مع ماصة باستور.
    ملاحظة: خلال نضوج البويضات ، ستصبح البويضات شفافة تدريجيا. غالبية البويضات تصبح شفافة بعد علاج DHP لمدة 2 ساعة. ويمكن ملاحظة ذلك تحت المجهر تشريح مع البصريات الضوئية المنقولة.
  6. قم بإزالة الخلايا الجريبية الخارجية من كل بويضة ناضجة كما هو موضح في الخطوة 2.3.
  7. نقل البويضات دنود إلى طبق بيتري مع بضع قطرات من الثقافة المتوسطة والمضي قدما في الإخصاب.
  8. إعداد محلول الحيوانات المنوية الطازجة باستخدام الخصيتين تشريحها من ثلاثة ذكور على الأقل في 500 ميكرولتر من محلول هانكس. ضع محلول الحيوانات المنوية على الجليد ، حيث يمكنه الحفاظ على فعاليته من الإخصاب لمدة تصل إلى 2-3 ساعة.
  9. أضف 100 ميكرولتر من محلول الحيوانات المنوية إلى البويضات الناضحة والمنضجة على طبق بيتري. إضافة بلطف محلول الحيوانات المنوية بين البيض، ودوامة الحيوانات المنوية والبيض معا باستخدام طرف ماصة.
  10. أضف على الفور 1 مل من محلول E3 المتوسط لتنشيط البيض ومرة أخرى دوامة بلطف البيض والحيوانات المنوية باستخدام طرف ماصة.
  11. بعد حوالي دقيقة واحدة بعد الإخصاب (mpf) ، أغرق اللوحة بمحلول متوسط E3. ويمكن ملاحظة توسع chorion الكامل في غضون 10-15 mpf.
  12. بين 35-45 mpf ، حدد الأجنة التي تمر بانشقاق متناظر في مرحلة الخلية 2 ، والتي يتم تخصيبها بالتالي. إزالة الأجنة التي لا تخضع لانشقاق الخلايا.
  13. السماح للأجنة بالتطور في طبق بيتري عند 28 درجة مئوية، بحد أقصى 80 جنينا لكل طبق طوله 10 سم. عرض وتصوير تطور الجنين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام هذه الطريقة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في مراحل مختلفة من تطور بصيلات المبيض في سمك الحمار الوحشي. الشكل 1 يظهر فصل البويضات حمار وحشي والخلايا الجريبية من بصيلات المبيض باستخدام أنبوب زجاجي شعري(الشكل 1). وللتحقيق فيما إذا كانت الخلايا الجريبية قد فصلت عن الجريبات السليمة، كانت الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة عن مراحل مختلفة من الجريبات من مرحلة الكهروضوئية إلى مرحلة FG ملطخة ب DAPI (50 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يمكن أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن نصف هنا طريقة جديدة للفصل البسيط والسريع للخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المبيض حمار وحشي. هذا الأسلوب له العديد من المزايا على الطريقة التقليدية. ومن بين هذه العوامل الرئيسية زيادة سهولة الفصل بدرجة كبيرة مع كفاءة وفعالية عالية، حيث لا يلزم سوى معالجة واحدة وخارجية. هذه النقطة تزيد من إمكانية التطبيق على الباحثين الذين ليسوا جيدين في التشريح المجهري. وفقا لخبرتنا، يمكن للمرء أن يفصل بنجاح الخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المرحلة نمت بالكامل في غضون 5-10 ق باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية. ومع ذلك، هناك حا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [32060170 و 31601205 و 31560334] ، وهو مشروع باحث زائر يدعمه مجلس المنح الدراسية الصيني وصندوق مختبر الدولة الرئيسي لإيكولوجيا المياه العذبة والتكنولوجيا الحيوية [2020FB05].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
17 & alpha ؛ 20 & -DHPكايمان16146-5 (5 مجم)
24 بئر صفيحةكورنينج3524
قاطع أمبولةAS ONE5-124-22 1 كيس (100 قطعة) لا
مائي Na 2< / sub >HPO4< / sub>Kaixin Chemical500 جرام
روبيان محلول ملحيHongjie250 جم
CaCl2< / sub>Beichen Fangzheng500 جم
طبق ثقافةBiosharpBS-90-D (10 قطعة / PK) DAPI
SolarbioS2110 (25 مل)
مجهر تشريحZEISSStemi 305
ملقط التشريحVETUSHRC30
مقصتشريح كيفو160 مم 
المجهر المجسم الفلوري LeicaM205C
زجاج شعريIWAKIIK-PAS-5P (200 قطعة / عبوة)
Hoechst 33342SolarbioC0031 (1 مجم) KCl
Beichen Fangzheng500 جم
KH2< / sub>PO4< / sub>Kaixin Chemical500 g
Leibovitz' s L-15 متوسطGibco41300-039 (10 & مرات ؛ 1L)
MgSO4< / sub>& bull; 7H2< / sub>OBeichen Fangzheng500 g
أطراف ماصة دقيقةAxygenMCT-150-C
NaClBeichen Fangzheng500 g
NaHCO3< / sub>Beichen Fangzheng500 g
Penicilia-StreptomyciaGibco# 15140122 (100 مل)
مجهر مجسمZEISSاكتشف.v20

المراجع

  1. Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
  2. Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
  3. Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
  4. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
  5. Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
  6. Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
  7. Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
  8. Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
  9. Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
  10. Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
  11. Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).
  12. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
  13. Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
  14. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).
  15. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555(2016).
  16. Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

جريبات مبيض سمكة الزيبرافصل الخلايا الجريبيةعزل البويضاتالشعيرية الزجاجية المسحوبةتقنية المجهر الستيريويإنضاج البويضاتالإخصاب في المختبرالبويضات المجردةزراعة الخلايا الجريبيةمراحل الجريبات المبيضية
فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.