يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا

6.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62028

⸱

ديسمبر 19, 2020

 ,  ,  ,  , 
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

في هذه المقالة

ملخص

إن المقايسة الفلورية للتسرب هي طريقة بسيطة تمكن من التحقيق في تفاعلات الببتيد / الغشاء من أجل فهم مشاركتها في العديد من العمليات البيولوجية وخاصة قدرة الببتيدات المخترقة للخلايا على إزعاج الطبقات الثنائية الفوسفوليبيدات أثناء عملية نقل خلوية مباشرة.

الملخص

تعرف الببتيدات المخترقة للخلايا بأنها حاملات قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا. واحدة من السمات المشتركة الرئيسية المطلوبة لهذا النشاط نتج عن تفاعلات CPPs مع غشاء البلازما (الدهون) وبشكل خاص مع مكونات المصفوفة خارج الخلية من الغشاء نفسه (كبريتات الهيبران). في الواقع ، بغض النظر عن النقل المباشر أو الاستيعاب المعتمد على الإندوسيتوسيس ، تشارك الطبقات ثنائية الدهون في عملية الاستيعاب على مستوى غشاء البلازما وعلى مستوى حركة المرور داخل الخلايا (الحويصلات الداخلية). في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل يصف الخطوات المختلفة لصياغة الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) ، وتنقية ، وتوصيف ، وتطبيق في مطهر التسرب الفلوري من أجل الكشف عن احتمال CPP - غشاء زعزعة الاستقرار / التفاعل ومعالجة دورها في آلية الاستيعاب. يتم إنشاء LUVs مع تكوين الدهون التي تعكس محتوى غشاء البلازما من أجل تغليف كل من صبغة الفلورسنت وquencher. إضافة الببتيدات في الوسط خارج الخصية وتحريض التفاعلات الببتيد الغشاء على LUVs وبالتالي قد تحفز بطريقة تعتمد على الجرعة زيادة كبيرة في الفلورسينس الكشف عن تسرب. وترد أمثلة هنا مع التربتوفان (W) التي تم تطويرها مؤخرا- وأرجينين (R) الغنية الببتيدات Amphipathic (WRAPs)، والتي أظهرت تسليم سيرنا سريعة وفعالة في خطوط الخلايا المختلفة. وأخيرا، تتم مناقشة طبيعة هذه التفاعلات وتقارب الدهون لفهم وتحسين نقل الغشاء و / أو الهروب الاندوسومالي.

المقدمة

بعد اكتشافها في التسعينات ، تم تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتعزيز التسليم الخلوي الفعال للشحنات من خلال غشاء البلازما1،2. CPPs عادة ما تكون الببتيدات قصيرة، عموما 8 إلى 30 الأحماض الأمينية، وجود مجموعة واسعة من الأصول. وقد تم تعريفها لأول مرة على أنها حاملات "مباشرة النقل"، مما يعني أنها كانت قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا بشكل مستقل عن أي مسار داخليا لا متطلبات الطاقة ولا مشاركة المستقبلات. ومع ذلك، كشفت تحقيقات أخرى أن هذه الملاحظات الأولى جاءت أساسا من المبالغة في تقدير الفلورية بسبب القطع الأثرية التجريبية و / أو بروتوكولات التثبيت باستخدام الميثانول3. في الوقت الحاضر ، من المقبول على نطاق واسع أن امتصاص CPP يحدث عن طريق كل من الاندوكيتوسيس ونقل الطاقةالمستقلة 4و5و6و7 اعتمادا على معلمات مختلفة مثلطبيعة الشحنة ، والصلة المستخدمة بين CPP والبضائع ، وخط الخلية المدروس ، وما إلى ذلك.

يمكن استخدام CPPs كعوامل العدوى وفقا لاستراتيجيتين ، إما تنطوي على وصلة كيميائية (استراتيجية التكافؤ) أو التفاعلات الكهربائية / الكارهة للماء (استراتيجية غير التكافؤ) بين CPP وحمولتها8و9و10و11. على الرغم من أن كلا الاستراتيجيتين أظهرتا كفاءتهما في نقل الخلايا لعدة شحنات ، إلا أن فهم آلية الاستيعاب من قبل CPPs لا يزال موضع جدل ولا يزال من الصعب قياس التوازن بين مسارات الغدد الصماء أو الاختراق المباشر12،13. على الرغم من توفر مجموعة من الأدوات والاستراتيجيات التجريبية لمعالجة مشاركة العمليات الاندوستيكية بوضوح ، إلا أن النقل المباشر يبدو أكثر صعوبة في توصيفه لأنه ينطوي على تفاعلات أكثر تميزا مع مكونات غشاء البلازما. تتكون الأغشية البيولوجية عادة من مكونات عديدة ، من الفوسفوليبيدات إلى بروتينات الأغشية ، والتي قد تختلف وفقا لنوع الخلية و / أو البيئة (ظروف الإجهاد ، انقسام الخلايا ، وما إلى ذلك). هذا التنوع في التركيب ، وبالتالي عدم وجود نموذج عالمي للغشاء الخلوي لا يمكن من إجراء الدراسات بطريقة واحدة. ومع ذلك ، للتحايل على هذه القيود تم تطوير نهج خطوة بخطوة مع الغشاء الاصطناعي أو مقتطفات الغشاء. من الحويصلات unilamellar الصغيرة لنهج أحادية الطبقة، وكان كل نموذج ذات الصلة بوضوح للإجابة على أسئلة محددة14،15. من بينها ، تشكل الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) نموذجا مناسبا لمحاكاة الأغشية لدراسة تفاعلات الببتيد / الغشاء كنقطة رئيسية في عملية الاستيعاب.

وفي هذا السياق، يصف البروتوكول التالي التحقيق في آثار الببتيدات وتفاعلات الببتيد/الغشاء على سلامة المركبات من خلال رصد كل من صبغة فلورية أنيونية وما يقابلها من كمية من الكوينشر متعدد cationic مغلفة في الليبوسومات. تستخدم هذه الأداة لدراسة تفاعلات CPP/Membrane من أجل فهم ما إذا كانت قادرة على إجراء نقل مباشر للغشاء. على الرغم من تطبيقها عادة لمقارنة الببتيدات المختلفة المتفاعلة مع الأغشية ، يمكن أيضا استخدام هذا المقايسة التسرب الفلوري LUV للتحقيق في كل من المواكب CPPs-cargo (الاستراتيجية التساهمية) وCPP: مجمعات الشحن (استراتيجية غير التكافؤ).

ومن ثم فإن البروتوكول الحالي سيكون أول مثال مع التربتوفان (W) التي تم تطويرها مؤخرا - وأرجينين (R) الغنية الببتيدات Amphipathic (WRAP)16. WRAP قادرة على تشكيل الجسيمات النانوية القائمة على الببتيد لتقديم بسرعة وكفاءة الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) في عدة خطوط الخلية16. تم رصد خصائص تسرب الفلورية من الببتيد WRAP وحدها أو الجسيمات النانوية المستندة إلى التفاف محملة siRNA لتوصيف آلية الاستيعاب الخلوية الخاصة بهم. أظهرنا أن آلية الاستيعاب الخاصة بهم تنطوي بشكل رئيسي على النقل المباشر7. في مثال ثان، تم اقتران الببتيد WRAP بشكل متناقض مع البروتين / البروتين التدخل الببتيد iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 وقورنت قدرته على زعزعة استقرار الأغشية في مقايسة تسرب مضان إلى iCAL36 إلى جانب Penetratin18 (Penetratin-iCAL36)، وهو CPP آخر.

وأخيرا، ستناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها من وجهة نظر تكنولوجية وفيما يتعلق بالأهمية البيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد كبيرة يونيلاميلار فيسيكلس (LUVs)

  1. إعداد LUVs لاستخدامها كغشاء الخلية يحاكي لالقساء تسرب مضان.
  2. مزيج مع حقنة الزجاج هاملتون فوسفاتيديلكولين (DOPC, 786.11 غرام / مول), sphingomyelin (SM, 760.22 غرام / مول) والكوليسترول (تشول, 386.65 غرام / مول) في نسبة الضرس 4:4:2. يتم الحصول على محلول الدهون من محلول مخزون لكل سلوبيليد دهون في الميثانول / الكلوروفورم (3/1؛ الحجم / الحجم) المذيبات في 25 ملغ / مل في قارورة 25 مل الزجاج الجولة القاع. استنادا إلى 4 ميكرومول من DOPC ، 4 ميكرومول من SM ، و 2 ميكرومول من تشول ، يتم الحصول على محلول الدهون من محلول المخزون عن طريق خلط 126 ميكرولتر ، 117 ميكرولتر ، و 31 ميكرولتر ، على التوالي.
    تنبيه: الميثانول مذيب سام وقابل للاشتعال والكلوروفورم سام ومسرطن. وينبغي التعامل مع كل من مع الحماية المناسبة تحت غطاء محرك السيارة.
  3. تبخر الميثانول / الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوار تحت الفراغ خلال 45-60 دقيقة في 60 درجة مئوية حتى تشكيل فيلم الدهون المجففة.
  4. إعداد اثنين من الحلول المخزن المؤقت HEPES الأسهم. إعداد HEPES العازلة 1 عن طريق خلط 20 م م HEPES (238.3 غرام / مول) و 75 م م NaCl (58.44 غرام / مول) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. إعداد HEPES العازلة 2 عن طريق خلط 20 م م HEPES و 145 mM NaCl وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. يمكن تخزين المخازن المؤقتة HEPES عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
    ملاحظة: من المستحسن التحقق من osmolarity المخازن المؤقتة باستخدام مقياس التناضح.
  5. إعداد محلول ترطيب الدهون عن طريق حل غشاء غير منفذة الفلورسنت صبغ quencher زوجين، 8-aminonaphthalene-1، 3، 6-حمض ثلاثي الكبريتيك، ملح الصوديوم في 12.5 mM (ANTS، 427.33 غرام / مول) وP-xylene-bispyridinium بروميد في 45 mM (DPX، 422.16 غرام / مول) في محلول العازلة HEPES. خلط ANTS مع DPX يؤدي إلى حل أصفر اللون. لتحقيق تركيزات 12.5 mM من ANTS و 45 mM من DPX، حل 21.4 ملغ و 76 ملغ، على التوالي في 4 مل من العازلة HEPES 1.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول ترطيب الدهون لمدة أسبوعين عند درجة حرارة 4 درجات مئوية عن طريق لف الأنبوب بورق الألومنيوم.
  6. إعادة تشكيل الحويصلات متعددة المصابيح (MLV) عن طريق إعادة تعليق فيلم الدهون المجففة مع 1 مل من محلول ترطيب الدهون ودوامة حتى حل فيلم الدهون المجففة. تأكد من أن الحل هو solubilized تماما كما المجاميع الدهون الصغيرة سوف تؤثر سلبا على الخطوات السابقة. أيضا، تحقق من جدار الزجاج قارورة مستديرة القاع لضمان عدم وجود فيلم الدهون المتبقية.
    ملاحظة: سوف يظهر الحل أوباليسينت والأصفر الفاتح بعد solubilization.
  7. تخضع الحويصلات لخمس دورات تجميد / ذوبان للحصول على الحويصلات unilamellar. أداء كل دورة عن طريق وضع الزجاج قارورة مستديرة القاع لمدة 30 ثانية في النيتروجين السائل لتجميد الخطوة، ثم تركها في حمام مائي لمدة 2 دقيقة لخطوة ذوبان الجليد.
    ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة ماء الحمام أعلى من درجة حرارة ذوبان الدهون من 5-10 درجة مئوية.
  8. إعداد مقذوف الدهون عن طريق إدخال اثنين من مرشح يدعم الرطوبة الأولية مع العازلة HEPES في كل قطعة البثق البوليتيترافلوروإيثيلين (PTFE) وضعت في عبوة البثق المعدنية.
  9. وضع غشاء البولي الرطوبة HEPES (0.1 ميكرومتر حجم المسام، قطر 25 ملم) على الجزء العلوي من دعم مرشح واحد.
  10. تجميع اثنين من عبوات الطارد المعدنية والمسمار لهم.
  11. ضع الطارد المجمع في الحامل وادخل حقنة 1 مل في الحفرة المناسبة في أقصى كل قطعة من قطعة البثق البوليتيترافلوروإيثيلين. البثق يتوافق مع مرور السائل اختبارها من حقنة واحدة إلى أخرى من خلال غشاء البولي.
  12. اختبار البثق مع 1 مل من العازلة HEPES تحميلها في واحدة من حقنة 1 مل للتأكد من عدم وجود تسرب أو مشاكل.
  13. استبدال المخزن المؤقت HEPES 1 مل مع نموذج MLV.
  14. قم بالبثق عن طريق تمرير عينة MLV من حقنة إلى أخرى من خلال غشاء البولي 21 مرة على الأقل للحصول على LUVs موحدة من نفس الحجم.
    ملاحظة: يجب إجراء البثق في درجة حرارة أعلى من درجة حرارة ذوبان خليط الدهون.

2. تنقية LUVs

  1. قم بإعداد تنقية عمود لإزالة ANTS غير المغلفة و DPX الزائدة.
  2. أدخل جل dextran (G-50) المرتبط عبر إعادة الإنفاق في وسط مائي مع 0.01٪ NaN3 (65 جم / مول) في عمود لوني سائل (Luer Lock ، غير سترة ، 1.0 سم × 20 سم ، حجم السرير 16 مل) حتى 1 سم تحت الجزء العلوي من العمود عديم اللون.
  3. فتح الصنبور والسماح للتدفق السائل لتسوية هلام dextran عبر المرتبطة.
  4. اغسل العمود عن طريق التملغ مع 20 مل من المخزن المؤقت HEPES 2 وتجاهل تدفق إخراج العمود.
  5. أغلق الصنبور بمجرد تقليل حجم المذيبات الميت فوق العمود (<100 ميكرولتر) ولكنه كاف لتجنب أي تجفيف لهلام dextran المرتبط.
  6. ضع LUVs مقذوف حديثا (أصفر) على العمود والسماح لهم بالدخول في هلام dextran عبر المرتبطة.
  7. إضافة المخزن المؤقت HEPES 2 باستمرار إلى العمود لتنفيذ تنقية LUV.
  8. Elute ما يقرب من 2 مل من العازلة HEPES 2 (لا تنسى أن تملأ بانتظام الجزء العلوي من العمود لتجنب تجفيف هلام dextran عبر المرتبطة): النمل الأصفر الحر والحل DPX يهاجر أبطأ من الليبوسومات.
  9. ابدأ في جمع LUVs المنقى في أنابيب (1.5 مل).
  10. مراقبة قطرات من eluent من العمود وعندما تصبح أوباليسنت، فإنها تحتوي على الليبوسومات. تغيير الأنبوب لاسترداد الكسر الذي يحتوي على LUV.
  11. Elute حتى قطرات لم تعد أوباليسنت (~ 1 مل). بعد ذلك، elute آخر 0.5 مل في كسر منفصل ومن ثم التوقف عن التملز.
    ملاحظة: تتوفر المعايير الآن في مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية، كأطقم أو أوزان جزيئية فردية لمعايرة حجم elution من LUVs.
  12. التفاف الأنابيب مع LUVs في رقائق الألومنيوم لتجنب تبييض صبغة مضان.
  13. اغسل العمود بحاجز HEPES 2 سعة 20 مل.
  14. ويمكن بعد ذلك تخزين LUVs لمدة أسبوع عند 4 °C .
    ملاحظة: بما أن استقرار LUV قد يعتمد على تركيز LUV وتكوينه، وكذلك على القوة الأيونية، يجب التحكم في حجم LUVs باستخدام أداة تشتت الضوء الديناميكي (DLS) (انظر القسم 4). توصيف حجم LUV والتجانس) قبل كل اختبار.

3. تحديد تركيز LUVs

  1. تقدير تركيز LUV بواسطة عدة قياس كمي فوسفولبيد, مما يتيح تقييم تركيز الكولين19. ويمكن تطبيق هذا المقايسة عندما فوسفوليبيدات مع الكولين التي تحتوي على الرأس القطبي كبيرة (>50٪ من LUVs).
  2. إعداد كاشف اللون عن طريق حل 18 ملغ من ركيزة الكروموجين في 3 مل من العازلة المقدمة.
  3. قم بتحميل مادة البوليسترين cuvette، 10 × 10 × 45 مم، مع 3 مل من كاشف الألوان.
  4. استخدم كاشف الألوان النقي كشرط فارغ (فارغ). إضافة 20 ميكرولتر من عينة LUV (اختبار) أو 20 ميكرولتر من الحل القياسي لتركيز الكولين المعروفة (قياسي).
  5. تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية جميع الشروط (فارغة، اختبار، ومعيار).
  6. قياس امتصاص (الكثافة البصرية، OD) من عينة الاختبار والحل القياسي مع حل فارغ كما عنصر التحكم في 600 نانومتر مع مطياف.
  7. تحقق من قيم OD التي تمكن من تقدير تركيز الدهون من LUVs, C [LUV], في مكافئ الكولين مقارنة بمعيار التركيز المعروف.
  8. قم بإجراء الحساب باستخدام المعادلة التالية:
    C[LUV] (مول / لتر) = (OD عينة / OD القياسية) × C [قياسي] (مول / لتر)
    ملاحظة: قدمت مجموعة الكمية الفوسفولبيد كلوريد الكولين (139.6 ملغم / لتر) الحل القياسي في 54 ملغ / ديسيلت المقابلة لتركيز الضرس من C [قياسي] = 3.87 ملليمول / لتر عينة OD ومعيار OD هي الامتصاصات التي تقاس في 600 نانومتر لحلول LUV والكولين، على التوالي.

4. توصيف حجم LUV والتجانس

  1. إجراء قياس باستخدام أداة DLS لتحديد حجم LUV (بالنمتر) ومؤشر تعدد الأضلاع (PdI).
  2. برمجة "إجراء العملية القياسية" (SOP) حسب الملاءمة للمذيب/المخزن المؤقت والكوفيت المستخدم.
  3. ضع 500 ميكرولتر من محلول LUV في مادة كوفيت شبه ميكرو البوليسترين.
  4. إدراج البوليسترين شبه مايكرو cuvette في أداة DLS.
  5. في درجة حرارة الغرفة، قم بقياس توزيع الحجم من حيث متوسط الحجم (متوسط Z) لتوزيع الجسيمات والتجانس (مؤشر تعدد التعرق، PdI).
  6. يتم الحصول على جميع النتائج من قياسين مستقلين يتم إجراؤهما في كل دورة من ثلاث دورات متكررة.
    ملاحظة: القيم القياسية ل LUVs سيكون متوسط حجم 137 ± 7 نانومتر مع PdI من 0.149 ± 0.041.

5. إعداد حلول الببتيد

  1. إعداد حل الأسهم من الببتيد، والتي ينبغي تحليلها لالتساه التسرب.
  2. حل مسحوق الببتيد (>95٪ نقاء) في الماء النقي (على سبيل المثال، 1 ملغ الببتيد في 500 ميكرولتر المياه النقية).
    ملاحظة: يوصى بتخفيف الببتيدات في الماء النقي وتجنب تشحيم ثنائي ميثيل سلفوكسيكسيد (DMSO) ، مما قد يحفز القطع الأثرية (على سبيل المثال ، permeabilization الغشاء20).
  3. دوامة حل الببتيد لمدة 5 ق.
  4. Sonicate الحل الببتيد في حمام سونيكيشن المياه لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12225 x ز. جمع supernatant لتحديد التركيز.
  5. قياس امتصاص في 280 نانومتر من ثلاثة تخفيف الببتيد مستقلة ومن ثم حساب تركيز الببتيد باستخدام معامل انقراض الضرس ε (اعتمادا على محتوى التربتوفان والتيروزين في تسلسل الببتيد) وقاعدة بير لامبرت.
    ملاحظة: إذا كان الببتيد يحتوي على التربتوفان والتيروزين، يتم حساب معامل انقراض الضرس ε على أساس التربتوفان ε = 5690 م-1سم-1 وتيروزين ε = 1280 م-1سم-1. إذا كان تسلسل الببتيد لا يحتوي على التربتوفان أو التيروزين، يمكن إجراء فحص لوني آخر لقياس التركيز (على سبيل المثال، BCA أو برادفورد).
  6. تمييع محلول الببتيد في الماء النقي إلى حل نهائي من 100 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: في المياه النقية، لا يحدث أي تدهور الببتيد أثناء التخزين 4 درجة مئوية. ومع ذلك، ينبغي قياس تركيز الببتيد كل أسبوعين لضمان عدم حدوث تبخر المياه.

6. مضان التسرب المقايسة

  1. يتم قياس مقايسة تسرب الفلورية على مقياس الطيف في درجة حرارة الغرفة. يتم تثبيت الإثارة والطول الموجي للانبعاثات عند Ex = 360 نانومتر ± 3 نانومتر و Em = 530 نانومتر ± 5 نانومتر ، على التوالي.
  2. تمييع LUVs في 1 مل HEPES العازلة 2 إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومتر في كوفيت مضان الكوارتز. إضافة ستيرر المغناطيسي لتجانس الحل أثناء التجربة.
  3. قياس LUVs وحدها خلال أول 100 s، بين ر = 0 ق و t = 99 ق من أجل الوصول إلى مضان الخلفية.
    ملاحظة: يمكن أيضا قياس LUVs وحدها خلال التجربة بأكملها (15 دقيقة) من أجل الوصول إلى مضان الخلفية والتسريبات المحتملة.
  4. بعد ذلك، قياس التسرب كزيادة في كثافة الفلورسينس عند إضافة aliquots من محلول الببتيد ل900 ثانية المقبل (15 دقيقة). يتم تنفيذ هذا البروتوكول لكل تركيز الببتيد اختبارها من 0.1 ميكرومتر إلى 2.5 ميكرومتر.
  5. وأخيرا، تم تحقيق 100٪ مضان عن طريق التشحيم LUVs بإضافة 1 ميكرولتر من تريتون X-100 (0.1٪، v/v)، مما أدى إلى التحقيق unquenched تماما بين ر = 1000 ثانية و t = 1100 ثانية.

7. تحديد كمية التسرب

  1. منع القيم التي تم الحصول عليها بعد t = 1,090 s للاحتفاظ بنفس عدد النقاط لكل شرط تم اختباره.
  2. حساب الحد الأدنى من الفلورسينس، Fدقيقة،من خلال جعل متوسط 50 نقطة بين ر = 0 ق و t = 49 ق (LUVs وحدها).
  3. حساب أقصى مضان، Fماكس،من خلال جعل متوسط 50 نقطة بين ر = 1041 ق و t = 1090 s (LUVs مع تريتون X-100).
  4. حساب نسبة التسرب (٪Leak) في كل نقطة زمنية (t = x)، وفقا للمعادلة التالية:
    ٪Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
  5. حساب متوسط الانحراف المعياري للقيم التي تم الحصول عليها مع إعداد LUV مختلفة (n ≥ 2) لنفس الشرط.
  6. رسم نسبة التسرب، ٪Leak(t=x)، في دالة الوقت (s).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر مبدأ م المقايسة التسرب الفلوري في الشكل 1. بالتفصيل ، يتم التعامل مع الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) تغليف صبغة الفلورسنت وquencher (لا إشارة مضان) مع الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام. بسبب تفاعل الببتيد مع الأغشية الدهنية ، والتي يمكن أن تعني نفاذية الغشاء ، أو إعادة التنظيم أو حتى التمزق ، يتم إطلاق صبغة الفلورسينس وquencher من LUVs. التخفيفات اللاحقة في العازلة يؤدي إلى زيادة إشارة مضان.

على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إن المقايسة المقدمة لتسرب الفلورسينس هي طريقة بسيطة وسريعة لمعالجة زعزعة استقرار الأغشية عن طريق الببتيد المخترق للخلايا. من السهل القيام به ، كما أنه يتيح مقارنة غير مباشرة بين الببتيدات المختلفة التي تتفاعل مع الأغشية أو الجزيئات الأخرى المتفاعلة مع الأغشية. وفيما يتعلق بالخطوات الحاسمة للبروتوكول، حيث يوفر هذا المقايسة قيما نسبية بين خط الأساس (LUVs وحده) وإطلاق الفلورية القصوى (حالة تريتون)، فإننا عادة ما نقيم تركيز LUVs باستخدام مجموعة التكميم الفوسفولبيد، والتي تقدر فقط مساهمة الكولين في LUVs. ومع ذلك، فمن الممكن أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويود المؤلفون أن يشكروا إيميلي جوس على المراجعة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل مؤسسة "La Ligue contre le Cancer"، و"مؤسسة ARC من أجل إعادة التشبيه في السرطان"، و"المركز الوطني للبحوث العلمي".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25 مل قارورة زجاجية مستديرة القاعPyrex
8-aminonaphthalene-1 ، 3 ، 6-حمض ثلاثي السلفونيك ، ملح ثنائي الصوديوم (ANTS)InvitrogenA350Protect from light  
الكلوروفورم سيجما ألدريتش288306
الكوليسترولسيجما ألدريتشC8667
DOPC (ديولويل فوسفاتيديل كولين)أفانتي بولار850375Pحماية من الهواء
الطاردأفانتي بولبولر610000
مقياس الفلورPTI Serlabo
50 & micro ؛ L حقنة زجاجيةهاميلتون705N
HEPESSigma-AldrichH3375
Labفحص الفوسفوليبيد WAKO 296-63801
عمود الكروماتوغرافيا السائلةسيجما ألدريتش
الميثانولكارلو إربا414902
غشاء بولي كربونات النوكليبور (0.1 & micro; م حجم المسام ، قطر 25 مم)كوفيت 800309
البوليسترين Whatman ، 10 × 10 × 45 ممGrener Bio-One614101
البوليسترين شبه الميكرو كوفيت ، DLSFisher ScientificFB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)InvitrogenX1525Protect from light   ؛
كوفيت كوفيت مضانالكوارتز Hellma109.004F-QS
نظام البخار الدوار  هايدولفZ334898
سيفادكس G-50 راتنجأميرشام17-0042-01
أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>)سيجما ألدريتشS2002
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)سيجما ألدريتشS5886
USC300T حمام سونيكاتورVWR142-6001
SphingomyelinAvanti Polar860062Pحماية من الهواء
Triton X-100  Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS مالفيرنZEN3500

المراجع

  1. Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
  3. Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
  4. Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
  5. Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  6. Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
  7. Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).
  8. Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
  9. Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
  10. Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
  11. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  12. Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
  13. Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
  14. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
  15. Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
  16. Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
  17. Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
  18. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
  19. Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
  20. Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
  21. Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
  22. Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).
  23. Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
  24. Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
  25. Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
  26. Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
  27. Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
  28. Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
  29. Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
  30. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).
  31. Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
  32. Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
  33. van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292(2010).
  34. Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
  35. Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).
  36. Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.