إن المقايسة الفلورية للتسرب هي طريقة بسيطة تمكن من التحقيق في تفاعلات الببتيد / الغشاء من أجل فهم مشاركتها في العديد من العمليات البيولوجية وخاصة قدرة الببتيدات المخترقة للخلايا على إزعاج الطبقات الثنائية الفوسفوليبيدات أثناء عملية نقل خلوية مباشرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعرف الببتيدات المخترقة للخلايا بأنها حاملات قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا. واحدة من السمات المشتركة الرئيسية المطلوبة لهذا النشاط نتج عن تفاعلات CPPs مع غشاء البلازما (الدهون) وبشكل خاص مع مكونات المصفوفة خارج الخلية من الغشاء نفسه (كبريتات الهيبران). في الواقع ، بغض النظر عن النقل المباشر أو الاستيعاب المعتمد على الإندوسيتوسيس ، تشارك الطبقات ثنائية الدهون في عملية الاستيعاب على مستوى غشاء البلازما وعلى مستوى حركة المرور داخل الخلايا (الحويصلات الداخلية). في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل يصف الخطوات المختلفة لصياغة الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) ، وتنقية ، وتوصيف ، وتطبيق في مطهر التسرب الفلوري من أجل الكشف عن احتمال CPP - غشاء زعزعة الاستقرار / التفاعل ومعالجة دورها في آلية الاستيعاب. يتم إنشاء LUVs مع تكوين الدهون التي تعكس محتوى غشاء البلازما من أجل تغليف كل من صبغة الفلورسنت وquencher. إضافة الببتيدات في الوسط خارج الخصية وتحريض التفاعلات الببتيد الغشاء على LUVs وبالتالي قد تحفز بطريقة تعتمد على الجرعة زيادة كبيرة في الفلورسينس الكشف عن تسرب. وترد أمثلة هنا مع التربتوفان (W) التي تم تطويرها مؤخرا- وأرجينين (R) الغنية الببتيدات Amphipathic (WRAPs)، والتي أظهرت تسليم سيرنا سريعة وفعالة في خطوط الخلايا المختلفة. وأخيرا، تتم مناقشة طبيعة هذه التفاعلات وتقارب الدهون لفهم وتحسين نقل الغشاء و / أو الهروب الاندوسومالي.
المقدمة
بعد اكتشافها في التسعينات ، تم تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتعزيز التسليم الخلوي الفعال للشحنات من خلال غشاء البلازما1،2. CPPs عادة ما تكون الببتيدات قصيرة، عموما 8 إلى 30 الأحماض الأمينية، وجود مجموعة واسعة من الأصول. وقد تم تعريفها لأول مرة على أنها حاملات "مباشرة النقل"، مما يعني أنها كانت قادرة على عبور غشاء البلازما ونقل شحنة إلى خلايا بشكل مستقل عن أي مسار داخليا لا متطلبات الطاقة ولا مشاركة المستقبلات. ومع ذلك، كشفت تحقيقات أخرى أن هذه الملاحظات الأولى جاءت أساسا من المبالغة في تقدير الفلورية بسبب القطع الأثرية التجريبية و / أو بروتوكولات التثبيت باستخدام الميثانول3. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد كبيرة يونيلاميلار فيسيكلس (LUVs)
- إعداد LUVs لاستخدامها كغشاء الخلية يحاكي لالقساء تسرب مضان.
- مزيج مع حقنة الزجاج هاملتون فوسفاتيديلكولين (DOPC, 786.11 غرام / مول), sphingomyelin (SM, 760.22 غرام / مول) والكوليسترول (تشول, 386.65 غرام / مول) في نسبة الضرس 4:4:2. يتم الحصول على محلول الدهون من محلول مخزون لكل سلوبيليد دهون في الميثانول / الكلوروفورم (3/1؛ الحجم / الحجم) المذيبات في 25 ملغ / مل في قارورة 25 مل الزجاج الجولة القاع. استنادا إلى 4 ميكرومول من DOPC ، 4 ميكرومول من SM ، و 2 ميكرومول من تشول ، يتم الحصول على محلول الدهون من محلول المخزون عن طريق خلط 126 ميكرولتر ، 117 ميكرولتر ، و 31 ميكرولتر ، على التوالي.
تنبيه: الميثانول مذيب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر مبدأ م المقايسة التسرب الفلوري في الشكل 1. بالتفصيل ، يتم التعامل مع الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) تغليف صبغة الفلورسنت وquencher (لا إشارة مضان) مع الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام. بسبب تفاعل الببتيد مع الأغشية الدهنية ، والتي يمكن أن تعني نفاذية الغشاء ، أو إعادة التنظيم أو حتى التمزق ، يتم إطلاق صبغة الفلورسينس وquencher من LUVs. التخفيفات اللاحقة في العازلة يؤدي إلى زيادة إشارة مضان.
على.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن المقايسة المقدمة لتسرب الفلورسينس هي طريقة بسيطة وسريعة لمعالجة زعزعة استقرار الأغشية عن طريق الببتيد المخترق للخلايا. من السهل القيام به ، كما أنه يتيح مقارنة غير مباشرة بين الببتيدات المختلفة التي تتفاعل مع الأغشية أو الجزيئات الأخرى المتفاعلة مع الأغشية. وفيما يتعلق بالخطوات الحاسمة للبروتوكول، حيث يوفر هذا المقايسة قيما نسبية بين خط الأساس (LUVs وحده) وإطلاق الفلورية القصوى (حالة تريتون)، فإننا عادة ما نقيم تركيز LUVs باستخدام مجموعة التكميم الفوسفولبيد، والتي تقدر فقط مساهمة الكولين في LUVs. ومع ذلك، فمن الممكن أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون أن يشكروا إيميلي جوس على المراجعة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل مؤسسة "La Ligue contre le Cancer"، و"مؤسسة ARC من أجل إعادة التشبيه في السرطان"، و"المركز الوطني للبحوث العلمي".
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 25 مل قارورة زجاجية مستديرة القاع | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1 ، 3 ، 6-حمض ثلاثي السلفونيك ، ملح ثنائي الصوديوم (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| الكلوروفورم | سيجما ألدريتش | 288306 | |
| الكوليسترول | سيجما ألدريتش | C8667 | |
| DOPC (ديولويل فوسفاتيديل كولين) | أفانتي بولار | 850375P | حماية من الهواء |
| الطارد | أفانتي بولبولر | 610000 | |
| مقياس الفلور | PTI Serlabo | ||
| 50 & micro ؛ L حقنة زجاجية | هاميلتون | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Labفحص الفوسفوليبيد | WAKO | 296-63801 | |
| عمود الكروماتوغرافيا السائلة | سيجما ألدريتش | ||
| الميثانول | كارلو إربا | 414902 | |
| غشاء بولي كربونات النوكليبور (0.1 & micro; م حجم المسام ، قطر 25 مم) | كوفيت 800309 | ||
| البوليسترين Whatman ، 10 × 10 × 45 مم | Grener Bio-One | 614101 | |
| البوليسترين شبه الميكرو كوفيت ، DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light ؛ |
| كوفيت كوفيت مضان | الكوارتز Hellma | 109.004F-QS | |
| نظام البخار الدوار | هايدولف | Z334898 | |
| سيفادكس G-50 راتنج | أميرشام | 17-0042-01 | |
| أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>) | سيجما ألدريتش | S2002 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | سيجما ألدريتش | S5886 | |
| USC300T حمام سونيكاتور | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | حماية من الهواء |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | مالفيرن | ZEN3500 |
المراجع
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005). ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
