هنا ، نصف إعداد الطبقات الأحادية الظهارية المعوية المشتقة من الأعضاء البشرية لدراسة وظيفة الحاجز المعوي والنفاذية والنقل. نظرا لأن المواد العضوية تمثل استجابة الأنسجة الظهارية الأصلية للمحفزات الخارجية ، فإن هذه النماذج تجمع بين مزايا قابلية تمدد خطوط الخلايا وأهمية الأنسجة الأولية وتعقيدها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الطبقة الظهارية الأحادية المشتقة من المواد العضوية: نموذج ذو صلة سريريا في المختبر لوظيفة الحاجز المعوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الماضي ، كانت أنظمة النماذج الظهارية المعوية تقتصر على خطوط الخلايا المتحولة والأنسجة الأولية. هذه الأنظمة النموذجية لها قيود متأصلة لأن الأولى لا تمثل بأمانة فسيولوجيا الأنسجة الأصلية ، وتوافر الأخير محدود. وبالتالي ، فإن تطبيقها يعيق البحوث الأساسية وتطوير الأدوية. المواد العضوية القائمة على الخلايا الجذعية البالغة (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم المواد العضوية) هي منمنمات من الأنسجة الظهارية الطبيعية أو المريضة التي تشتق منها. يمكن إنشاؤها بكفاءة عالية من مناطق الجهاز الهضمي المختلفة (GI) ، ولها قابلية للتوسع على المدى الطويل ، وتحاكي الاستجابات الخاصة بالأنسجة والمريض للعلاجات في المختبر. هنا ، تم إثبات إنشاء طبقات أحادية ظهارية مشتقة من الأمعاء العضوية جنبا إلى جنب مع طرق لقياس سلامة الحاجز الظهاري ، والنفاذية والنقل ، وإفراز البروتين المضاد للميكروبات ، وكذلك علم الأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن إثراء الطبقات الأحادية المشتقة من المواد العضوية المعوية بالخلايا الجذعية المنتشرة والخلايا المضخمة العابرة وكذلك بالخلايا الظهارية الرئيسية المتباينة. لذلك ، فهي تمثل نظاما نموذجيا يمكن تصميمه لدراسة آثار المركبات على الخلايا المستهدفة وطريقة عملها. على الرغم من أن الثقافات العضوية أكثر تطلبا من الناحية الفنية من خطوط الخلايا ، إلا أنها بمجرد إنشائها ، يمكنها تقليل الفشل في المراحل اللاحقة من تطوير الدواء لأنها تمثل حقا تعقيد ظهارة الجسم الحي وعدم التجانس بين المرضى.
المقدمة
تعمل الظهارة المعوية كحاجز مادي بين المحتوى اللمعاني للأمعاء والأنسجة الكامنة. يتكون هذا الحاجز من طبقة ظهارية واحدة من الخلايا المعوية الاستيعابية بشكل رئيسي والتي ترتبط بتقاطعات ضيقة ، والتي تنشئ روابط قوية بين الخلايا بين الخلايا المتجاورة. تشكل هذه الخلايا بطانة ظهارية مستقطبة تفصل بين الجانبين القمي (التجويف) والقاعدي الجانبي للأمعاء ، بينما تنظم في نفس الوقت النقل شبه الخلوي للمغذيات والأيضات المهضومة. بالإضافة إلى الخلايا المعوية ، تساهم الخلايا الظهارية المهمة الأخرى مثل الكأس والبانيث والخلايا المعوية الصماوية أيضا في التوازن المعوي عن طريق إنتاج المخاط والببتيدات المضادة للميكروبات والهرمونات ، على التوالي. يتم تجديد الظهارة المعوية باستمرار عن طريق تقسيم ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد كواشف للثقافة
ملاحظة: نفذ جميع الخطوات داخل خزانة السلامة الأحيائية واتبع الإرشادات القياسية للعمل مع مزارع الخلايا. يتم استخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق قبل بدء تشغيل خزانة السلامة الأحيائية. قبل وبعد الاستخدام ، يتم تنظيف سطح خزانة السلامة البيولوجية باستخدام ورق مناديل مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪. لتسهيل تكوين قطرات ثلاثية الأبعاد من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، احتفظ بمخزون مسخن مسبقا من لوحات 96 و 24 و 6 بئر جاهزة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- إعداد الوسط القاعدي
- قم بتحضير الوسط القاعدي (BM) في وسط النسر المعدل من دولبيكو المتقدم سعة 500 مل مع زجاجة متوسطة من خليط المغذيات F-12 (Ad-DF) من لحم الخنزير ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1A صورة سطعة تمثيلية للعضويات المعوية بعد إذابتها من التبريد. من المهم إذابة المواد العضوية بكثافة عالية لضمان الشفاء الأمثل. يتم طلاء المواد العضوية في لوحات 24 أو 6 آبار في قباب ECM تبلغ حوالي 10 ميكرولتر (الشكل 1B). معظم المواد العضوية المعوية الطبيعية لها مورفولوجيا كيسية. بعد التعافي من عملية الذوبان ، تنمو المواد العضوية إلى حجم أكبر وتكون جاهزة للمرور بعد 3-7 أيام اعتمادا على الثقافة العضوية (الشكل 1C). بعد حصاد ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول التلاعب العام وصيانة المواد العضوية المعوية بالإضافة إلى التحضير والتطبيقات المحتملة للطبقات الأحادية الظهارية المشتقة من هذه المواد العضوية. حتى الآن ، تم إعداد الطبقات الأحادية بنجاح من الاثني عشر والدقاق ومناطق مختلفة من عضويات القولون المشتقة من الأنسجة المعوية الطبيعية وكذلك الملتهبة سابقا وبنشاط (بيانات غير منشورة). يسهل تطبيق الطبقات الأحادية العضوية المشتقة من المريض دراسة وظيفة الحاجز بطريقة خاصة بالمرض والمريض بالإضافة إلى دراسة الاستجابات الخاصة بالمريض لمجموعة متنوعة من العلاجات الدوائية. ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يتم دعم هذا العمل من قبل Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI ) للشراكات بين القطاعين العام والخاص (PPP) بدل قطاع LSH الهولندي مع رقم المشروع LSHM16021 Organoids كأداة جديدة لنمذجة علم السموم لتكنولوجيا Hubrecht Organoid Technology (HUB) والتمويل الداخلي HUB لقسم نمذجة الأمراض والسموم. نشكر مختبرات سابين ميدندورب (قسم أمراض الجهاز الهضمي لدى الأطفال ، مستشفى فيلهلمينا للأطفال ، UMC ، أوتريخت) وهوغو ر. دي جونغ ومارسيل جي سي بيجلدز (قسم أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، Erasmus MC ، روتردام) على تقديم الدعم الفني الأولي لإعداد طبقات أحادية على إدراج الغشاء.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100٪ إيثانول | فيشر إيمرجو | 10644795 | |
| 1250 و 300 و 20 & L نصائح مرشح منخفضة الاحتفاظ | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24 بئر لوحات زراعة الخلايا | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell لوحة (محكمة الضوء) | Corning | 351156 | |
| ألواح HTS Transwell 24 بئرا (الجدول 1) | Corning | 3378 | |
| صفيحة 24 بئر مع إدراج Transwell | Corning | 3470 | |
| 40 & micro ؛ مصفاة الخلايا m | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96 جيدا لوحات الدراجات الحرارية السريعة Life | Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96 بئر HTS Fluoroblok Transwell لوحة | Corning | 351162 | |
| 96 بئر HTS Transwell ألواح (الجدول 1) | Corning | 7369 | |
| 96 بئر لوحة ثقافة | شفافة Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell كاشف التفكك 2 |
| Advanced DMEM / F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| مجهر ثقافة الخلايا (مجهر ضوئي / ضوئي) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| طرد مركزي | Eppendorf | ||
| حاضنة CO2< / sub> | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC معالجة H2< / sub>O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS ، مسحوق ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter مع قطب STX | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| ماصات زجاجية | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies أوروبا BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS / CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 الجسم المضاد الأساسي | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 الجسم المضاد الثانوي | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide مع شبكات العد | Fisher Emergo | 10298483 | |
| غطاء التدفق | الصفحي الحراري العلمي | ||
| لوسيفر الأصفر CH ملح ثنائي الليثيوم | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel ، عامل النمو المخفض ( GFR) | مصفوفة | Corning 356231 | خارج الخلية (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip ، 0.1 مل | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp البصرية 8 كاب | شرائط Life Technologies أوروبا BV | 4323032 | |
| أنابيب الطرد المركزي | الدقيقة Eppendorf | 0030 120 086 | |
| ماصات دقيقة (1000 و 200 و 20 & micro ؛ L) | جيلسون | ||
| ميكروتوم | لايكا | ||
| MUC2 الجسم المضاد الأساسي | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-15334 | |
| MUC2 الجسم المضاد الثانوي | VWR | VWRKS / DPVR-HRP | |
| ماصة متعددة القنوات (200 وميكرو ؛ L) | جيلسون | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| نيكوتيناميد | سيجما-ألدريتش | N0636 | |
| قليل النوكليوتيد ALPI1 / إلى الأمام | حسب الطلب | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| قليل النوكليوتيد ALPI1 / عكس | حسب الطلب | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| قليل النوكليوتيد LGR5 / إلى الأمام | حسب الطلب | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| قليل النوكليوتيد LGR5 / عكس | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | ||
| قليل النوكليوتيد حسب الطلب MUC2 / إلى الأمام | الطلب | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| قليل النوكليوتيد MUC2 / عكس | الطلب | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| قليل النوكليوتيد TBP / إلى الأمام | مخصص | ACGCCGAATATCCCAAGCG | |
| قليل النوكليوتيد TBP / عكس | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | ||
| بصري يغطي | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell | Technologies 72184 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | تقنيات الحياة أوروبا BV | 15140122 | |
| لوحة شاكر | باناسونيك | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | تركيبة مضادة للميكروبات للخلايا الأولية |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| خزان كاشف لأنبوب متعدد القنوات | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler مع 24-probe أو 96C-probe | WTI | ||
| ريتشارد آلان Scientific Alcian Blue / PAS Special Stain | Kit Thermo Scientific | 87023 | |
| RNase Free DNase | Set Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| الماصات المصلية | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 | |
| الماصة المصلية (Pipet-Aid) | شفرة | ||
| GEM Scientific | |||
| Superscript 1st نظام حبلا ل RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M قارئ لوحة | Tecan | ||
| تريبان الأزرق ، 0.4٪ | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Technologies Europe BV | 12605-010 | كاشف تفكك الخلايا 1 |
| منحة | حمام مائي | ||
| Y27632 (مثبط ROCK) | AbMole | M1817 |
المراجع
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permea....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
