مقالة منهجية

نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة متعدد الأعمدة

DOI:

10.3791/62075

⸱

مايو 21, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح محول لوحة متعددة الأعمدة الأعمدة الكروماتوغرافية لتكون واجهة مع لوحات جمع متعددة الآبار لتقارب مواز أو تنقية تبادل الأيونات توفير طريقة تنقية البروتين عالية الإنتاجية اقتصادية. ويمكن استخدامه تحت الجاذبية أو فراغ تسفر عن كميات ملليغرام من البروتين عن طريق الأجهزة بأسعار معقولة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية البروتين أمر حتمي لدراسة بنية البروتين ووظيفته وعادة ما يستخدم في تركيبة مع التقنيات الفيزيائية الحيوية. كما أنها عنصر رئيسي في تطوير علاجات جديدة. العصر المتطور من البروتيوميات الوظيفية يغذي الطلب على تنقية البروتين عالية الإنتاجية والتقنيات المحسنة لتسهيل ذلك. افترض أن محول لوحة الأعمدة المتعددة (MCPA) يمكنه ربط أعمدة لونية متعددة من راتنجات مختلفة بلوحات متعددة الآبار لتنقية متوازية. تقدم هذه الطريقة طريقة اقتصادية ومتعددة الاستخدامات لتنقية البروتين التي يمكن استخدامها تحت الجاذبية أو الفراغ ، مما ينافس سرعة النظام الآلي. يمكن استخدام MCPA لاسترداد غلة ملليغرام من البروتين عن طريق طريقة معقولة وفعالة من حيث الوقت لتوصيف وتحليل لاحقة. تم استخدام MCPA لتنقية تقارب عالي الإنتاجية من مجالات SH3. كما تم إثبات تبادل الأيونات عبر MCPA لتنقية البروتين بعد الكروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA، مما يشير إلى كيفية هذا النظام يمكن تكييفها لأنواع تنقية أخرى. نظرا لإعداده مع أعمدة متعددة ، يمكن إجراء التخصيص الفردي للمعلمات في نفس التنقية ، غير قابل للتحقيق من خلال الأساليب الحالية المستندة إلى اللوحة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات تنقية البروتين لتحقيق كميات ملليغرام من البروتينات النقية أمر حتمي لتوصيفها وتحليلها، وخاصة بالنسبة للطرق الفيزيائية الحيوية مثل NMR. تنقية البروتين هو أيضا مركزية عبر مجالات أخرى من الدراسة مثل عمليات اكتشاف المخدرات ودراسات التفاعل البروتين البروتين; ومع ذلك، تحقيق مثل هذه الكميات من البروتين النقي يمكن أن تصبح عنق الزجاجة لهذه التقنيات1،2،3. الطريقة الرئيسية لتنقية البروتين هي الكروماتوغرافيا ، والتي تشمل مجموعة متنوعة من الطرق التي تعتمد على الخصائص الفردية للبروتينات وعلاماتها. في الكروماتوغرافيا تقارب، والبروتينات لديها بروتين إضافي أو الببتيد عزر الذي يعمل كعلام....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ونياتورينج ني-NTA

  1. إعداد المخازن المؤقتة
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على تفاصيل كافة المخازن المؤقتة.
    1. تشكل 500 مل من 0.5 M NaOH، مع التأكد من إضافة المياه ميلي كيو أولا ومن ثم إضافة NaOH ببطء في حين أن الكأس على stirrer. تصفية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    2. إعداد 100 مل من كبريتات النيكل 0.1 M ومرشح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    3. إعداد 50 مل من 2 إميدازول ومرشح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    4. إعداد و0.22 ميكرومتر مرشح 1.5 لتر من العازلة الإزالة في درجة الحموضة 8.0 تتكون من 5.3 mM تريس-HCl، 4.7 mM تريس قاعدة (تريس (هيدروكسي ميثيل)ميثيلامين), 13.7 mM NaH2PO4, 86.3 m....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على سبيل المثال، نجحت MCPA في تنقية 14 متحولة AbpSH3 في ظروف الإزالة عبر Ni-NTA(الشكل 2A). ويمكن رؤية ملوث صغير ~ 25 كيلودا، ولكن البروتين لا يزال نقيا إلى حد كبير. ويعتقد أن هذا الملوث هو يودا، وهو بروتين مشترك مشترك النقاء موجود في الإشريكية القولونية11. يوضح الشكل 2B تنقية 11 نطاق SH3 مختلفة في ظل الظروف الأصلية. تتم إزالة الملوثات الصغيرة التي شوهدت في ظروف الإزالة في الظروف الأصلية. وهذا يدل على أنه يمكن استخدام MCP.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلوب قوي وبسيط للاستخدام لعلماء الكيمياء الحيوية البروتين عديم الخبرة نسبيا، ولكن هناك بعض الاعتبارات أن نأخذ في الاعتبار.

تحذير بشأن ملء لوحات التجميع

لوحة جمع 48 جيدا نفسها يحمل فقط 5 مل لكل بئر في حين أن كل 96 جيدا يحمل فقط 2 مل. هذا يحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار عند إضافة المخزن المؤقت وتشغيل العينة من خلال العمود كما أن هناك خطر ملء الآبار. وعلى وجه الخصوص، يجب توخي الحذر عند نقل العينات الأكبر إلى العمود الكروماتوغرافي لتنقية. في الحالات ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM103451 ومنحة بحثية داخلية من جامعة ليفربول.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 مل / لوحة جمع البئرتقنيات Agilent201240-100
5 مل / لوحة جمع الآبارتقنيات Agilent201238-100
أعمدة كروماتوغرافيا 12 ملBio-Rad7311550
96 لوحة تنقيط طويلةجيدا تقنيات Agilent200919-100تأتي مع مرشحات 0.25 ميكرومتر التي سيتم إزالتها.
96 ختم / حصيرة للوحة البئرتقنيات Agilent201158-100يجب أن تكون قابلة للإعجاب
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP عمود تبادل الأنيونGE Healthcare (Cytiva)17115301
قارئ لوحة LvisBMG LABTECHمتوافق مع قارئ لوحة FLUOstar Omega
سدادات Leur الذكورCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 جيدا مجموعة بدء تشغيل مشعب الفراغSigma-Aldrich575650-U
لوحة جمع الخزانتقنيات Agilent201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020مع محاقن 5 مل و 50 مل فراغ
VACUSAFEINTEGRA158 320تحتوي المكنسة الكهربائية الآمنة على نطاق فراغ من 300 ملي بار إلى 600 ملي بار وزجاجة جمع نفايات سعة 4 لتر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
  2. Renaud, J. P., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NTA SH3

مقالات ذات صلة