مقالة منهجية

اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic

DOI:

10.3791/62077

⸱

فبراير 3, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada, 2Department of Cell Biology & Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه طريقة فعالة لفحص المكثفات أو محركات الانبثاث السرطاني. يتم حقن الخلايا ، التي يتم تحويلها باستخدام مكتبة التعبير ، في الأوعية الدموية للغشاء المشيمي للدجاج لتشكيل مستعمرات منتشرة. يتم استئصال المستعمرات التي انخفضت أو زادت من الغازية ، وتوسيعها ، وإعادة حقنها لتأكيد النمط الظاهري ، وأخيرا ، تحليلها باستخدام تسلسل الإنتاجية العالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت التطورات الأخيرة في أبحاث السرطان الطبيعة المعقدة للغاية لنبث السرطان. تم العثور على جينات أو شبكات جينات متعددة تشارك في التنظيم التفاضلي لجينات التعاقب النقيلي للسرطان والمنتجات الجينية التي تعتمد على نوع السرطان والأنسجة وخصائص المريض الفردية. وتمثل هذه الأهداف أهدافا هامة محتملة للعلاجات الوراثية ونهج الطب الشخصي. وتطوير منصات الفحص السريع أمر أساسي لتحديد هذه الأهداف الجينية.

الغشاء الفرخ chorioallantoic (CAM) هو غشاء غني بالكولاجين عالي الأوعية الدموية يقع تحت قشر البيض الذي يسمح بتبادل الغاز في الجنين النامي. نظرا لموقع وتدوير الأوعية الدموية للكام، قمنا بتطويره كنموذج الانبثاث السرطاني داخل الجسم البشري الذي يسمح لخلايا سرطان الإنسان القوية xenografting والتصوير في الوقت الحقيقي من التفاعلات الخلية السرطانية مع مصفوفة الكولاجين الغنية وvasculature.

وباستخدام هذا النموذج، تم تصميم منصة فحص كمي لتحديد الدوافع الجديدة أو القامعين لنبث السرطان. قمنا بنقل مجموعة من الخلايا السرطانية HEp3 الرأس والرقبة مع مكتبة الجينات shRNA الجينوم البشري الكامل، ثم حقن الخلايا، في كثافة منخفضة، في الأوعية الدموية CAM. انتشرت الخلايا وشكلت مستعمرات الخلايا أحادية الورم. كانت المستعمرات الفردية التي لم تتمكن من غزو أنسجة CAM مرئية كنموذج فينوتيبي مستعمرة مدمجة وتم استئصالها لتحديد الحمض النووي الريبي المنقول الموجود في الخلايا. تم تقييم صور المستعمرات الفردية لتوغلها. تم إجراء جولات متعددة من التحديدات لتقليل معدل الإيجابيات الزائفة. وقد خضعت استنساخات الخلايا السرطانية الفردية والمعزولة أو المستنسخات المهندسة حديثا التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام إلى فحص تكوين الورم الأولي أو تحليل الخيار المشترك للخلايا السرطانية. باختصار نقدم منصة فحص سريعة تسمح بتحديد الأهداف المضادة للمنبث والتحليل داخل الجسم لسلسلة ديناميكية ومعقدة من الأحداث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانبثاث هو السبب الرئيسي لوفاة مريض السرطان1،2،3. تستخدم الخلايا السرطانية النقيلية مسارات إشارات متميزة ، تعتمد على نوع السرطان ، طوال الخطوات الخمس من السلسلة النقيلية: الغزو المحلي ، والغزو الداخلي ، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية ، والبذخ ، وتوسع المستعمرة في المواقع النقيلية البعيدة. الفهم الحالي لهذه العملية النقيلية يشير إلى أن هناك خطوتين عنق الزجاجة، واحدة هي الغزو الاتجاهي للخلية السرطانية من الورم الأساسي، والثاني هو إنشاء آفة النقيلي موقع بعيد4،5،6. تتطلب كلتا الخطوتين تفاعل الخلايا السرطانية بنشاط مع الكولاجين والشرايين في مواقع الغزو الأولي أو تكوين الآفة النقيلية البعيدة. لذلك، يجب أن تكون الخلايا السرطانية النقيلي قادرة على إرفاق الخلايا، وإعادة تشكيلها ألياف الكولاجين، وغزو اتجاهي على طول جدران الأوعيةالدموية 7. نماذج الفحص التي يمكن أن تحدد بسرعة الأهداف العلاجية في وقت الذروة لمنع الخلايا السرطانية من إكمال هذه الخطوات هي ذات أهمية قصوى. نماذج الفحص المختبري الموجودة لا تحاكي تماما بيئة الأنسجة الحية المعقدة. نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. لذلك، هناك حاجة ملحة لمنصات الفحص داخل الجسم التي توفر بيئات الأنسجة الحية المعقدة والتحديد السريع للأهداف.

خلال العقد الماضي، تم تأسيس جنين الدجاج كنموذج قوي وفعال من حيث التكلفة من الانبثاث سرطان الإنسان8،9،10،11،12. الغشاء الفرخ chorioallantoic (CAM) الأنسجة رقيقة وشفافة مما يجعلها مثالية للتصوير المجهري داخل الجسم من سلوكيات الخلية والمستعمرة في الورم الأساسي و / أو المواقع النقيلي12. يمكن البدء في نمو الورم الأولي من عدة خطوط خلايا سرطان الإنسان ونقائل في غضون عدة أيام فقط بعد microinjection في أنسجة CAM. يمكن إعطاء الخلايا السرطانية في أنسجة CAM بعدة طرق ، بما في ذلك عن طريق الوريد أو داخل CAM أو كنباتات الكولاجين ، تسمح هذه المرونة للباحث بالتركيز على مراحل محددة من تطور السرطان ، على سبيل المثال ، تكوين الآفة النقيلية ، أو غزو الورم الأساسي أو تولد الأوعية.

هنا نصف منصة الفحص الكمي التي يمكن استخدامها لقياس قدرة الخلايا السرطانية على إنشاء الآفات النقيلية الغازية. يتم حقن الخلايا السرطانية التي تم نقلها مع مكتبة التعبير عن طريق الوريد في الأوعية الدموية CAM في كثافة منخفضة. تتشكل المستعمرات النقيلية لمدة 4-5 أيام ، ثم يتم تقييم قدرة الغزو والتفاعل الوعائي للمستعمرات الناتجة. يتم استئصال المستعمرات الفردية التي تفشل في الغزو ونشرها وتأكيد النمط الظاهري لها في CAM عن طريق إعادة الدمج والتحديد الكمي لإحكام المستعمرة واتصالات الخلايا الدموية السرطانية. يتم تحديد مكتبة التعبير يبني المسؤولة عن النمط الظاهري مستعمرة واحدة النقيلي متحولة من الحمض النووي الجينوم مستعمرة معزولة عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. ويمكن استخدام المنصة نفسها كذلك للتحقق من صحة العلاقة السببية بين الجين والنمط الظاهري الملاحظ أو لإجراء دراسات ميكانيكية متعمقة على النمط الظاهري الملاحظ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع التجارب وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ألبرتا. ولا تعتبر العديد من معاهد البحوث أجنة الطيور حية، ولا يلزم وضع بروتوكولات للحيوانات. ومع ذلك، فمن وجهة النظر المقبولة أن أجنة الطيور يمكن أن تشعر بالألم، وبالتالي، يجب أن تعامل بإنسانية قدر الإمكان. يجب الاتصال بهيئة البحوث الحيوانية المحلية قبل البدء في أي عمل بحثي لضمان اتباع اللوائح المناسبة.

1. شل أقل ثقافة البيض

  1. الحصول على بيض الدجاج المخصب من مزود المحلية. هذه التجربة يستخدم الأبيض Leghorn سلالة الدجاج; ومع ذلك، يمكن استخدام سلالات أخرى كذلك.
    ملاحظة: يوصى بالحصول على بويضات أكثر بنسبة 10٪ من الحاجة في حالة تلف بعض الأجنة أثناء التكسير ولا يمكن استخدامها في هذا البروتوكول.
  2. نقل العدد المطلوب من البيض إلى حاضنة هزازة رطبة بنسبة 60٪. يمكن تخزين بقية البيض لمدة تصل إلى أسبوعين عند 12 درجة مئوية دون فقدان الجدوى.
  3. احتضان البيض في حاضنة هزاز الرطوبة لمدة أربعة أيام.
    ملاحظة: اليوم الأول هو عندما يتم نقل البيض إلى حاضنة هزاز.
  4. إعداد أطباق الوزن والأغطية البلاستيكية لثقافة البيض قذيفة أقل. قطع واحدة من زوايا كل من الأطباق وزن للسماح للوصول إلى الهواء كفاءة الجنين(الشكل 1A).
  5. ترتيب إعداد أطباق الوزن في صفوف في غطاء محرك السيارة تدفق. (الشكل 1ب).
  6. في طبق وزن منفصل إعداد الإيثانول 70٪ لشطف البيض.
  7. تراجع لفترة وجيزة البيض في الإيثانول 70٪، ثم استخدام أداة دوارة كهربائية لجعل بعناية أربعة تخفيضات 2-3 ملم موازية لأكبر قطر شعرية من البيضة(الشكل 1C).
  8. نقل البيض قطع في طبق وزن واضغط بلطف البيض ضد أسفل الطبق حتى أشكال الكراك في قشر البيض (الشكل 1D).
  9. سحب نصفين قشر البيض وبصرف النظر السماح للجنين تنزلق إلى طبق الوزن. تجاهل قشر البيض وتغطية طبق وزنها مع غطاء.
  10. نقل الأجنة إلى حاضنة غير هزازة رطبة (الشكل 1E).
    ملاحظة: يتم وضع أطباق وزن تحتوي على الأجنة في حاويات بلاستيكية منفصلة (12 جنينا / حاوية). وهذا يزيد من صلاحية الجنين ويسمح بتنظيم الجنين الخاص بالتجربة.
  11. احتضان الأجنة لمدة 6 أيام أخرى (حتى عمر 10 أيام). تحقق من وجود أجنة ميتة أو ملوثة يوميا وإزالتها من الحاضنة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون ملوثة الأجنة بواسطة جراثيم العفن المحمولة جوا. يظهر تلوث العفن في البداية كبقع بيضاء على سطح CAM الجنين. إزالة الأجنة الملوثة على الفور ومسح الحاضنة مع الإيثانول 70٪ على أساس أسبوعي لمنع التلوث. في تجربتنا مستويات التلوث منخفضة جدا ~ 1-3٪.
  12. استخدم هذه الأجنة لحقن الخلايا السرطانية في صباح اليوم العاشر.

2. إعداد الخلايا السرطانية للحقن

ملاحظة: يستند اختيار المستعمرة النقيلية إلى النمط الظاهري الذي أنشأته الخلايا السرطانية الفلورية، والمستمد من مكتبة التعبير أو المتجه الموسوم ببروتين فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر أو الأحمر (انظر تدفق الشاشة بأكمله في الشكل 2A). لا ينصح باستخدام الخلايا المصابة بشكل عابر مع البروتينات الفلورية أو المسماة بالأصباغ الفلورية نفاذية الخلية بسبب تلاشي سريع للإشارة الناجمة عن انتشار الخلايا السرطانية وتلطيخ متفاوتة.

  1. الخلايا السرطانية الثقافة إلى التقاء 60-70٪ في وقت الحقن. استخدام الخلايا السرطانية في مستويات أعلى من التقاء سوف يقلل من قدرتها على البقاء، مما أدى إلى انخفاض كفاءة تشكيل مستعمرة النقيلي. تأكد من أن الخلايا السرطانية المستخدمة هي الميكوبلازما الحرة منذ تلوث الميكوبلازما قد يؤدي إلى انخفاض صلاحية جنين الدجاج.
  2. شطف الخلايا مرتين مع 1x PBS pH 7.4. إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية، ثم إضافة 0.5٪ تريبسين-EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق حتى يتم رفع جميع الخلايا من سطح طبق الثقافة.
  3. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وخلايا الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  4. Resuspend الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني لأجهزة الطرد المركزي والخلايا مرة أخرى كما هو الحال في الخطوة 2.3، لإزالة التربسين وغيرها من مكونات وسائل الإعلام الثقافة مثل المضادات الحيوية.
    ملاحظة: وجود مكونات التربسين أو زراعة الخلايا مثل المضادات الحيوية في تعليق الخلايا السرطانية قد يؤدي إلى انخفاض قدرة جنين الدجاج على البقاء.
  5. يستنشق بعناية الخلايا الفائقة و resuspend مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
  6. عد عدد الخلايا التي تستخدم مقياس الدم أو أي معدات أخرى لحساب الخلايا المتاحة.
    ملاحظة: يتطلب بروتوكول الفحص هذا أن تبدأ كل مستعمرة النقيلي بواسطة خلية واحدة. عند عد الخلايا تأكد من أن الخلايا هي trypsinized تماما وموجودة كتعليق خلية واحدة (لا توجد كتل الخلية).
  7. لحقن الوريد (IV) الخلايا المركزة إلى 0.5 × 106 إلى 1.0 × 106 خلايا / مل. استخدام الجليد البارد 1x PBS لتخفيف و / أو تركيزات الخلية resuspend. نتوقع أن ما يقرب من 1 مل من تعليق الخلايا ستكون هناك حاجة لكل عشرة أجنة.
    ملاحظة: يتم تحديد تركيز تعليق الخلية الضروري في التعليق بشكل رئيسي من خلال مستوى تجربة المجرب. يرجى الاطلاع على القسم التالي لمزيد من التفاصيل.

3. الحقن الوريدي للخلايا السرطانية لتشكيل مستعمرة النقيلي

ملاحظة: اتباع هذا البروتوكول يمكن حقن ما يصل إلى مائة من الأجنة في غضون يوم واحد. يستغرق الأمر وقتا أطول لعزل المستعمرات النقيلية (الخطوة 5) ثم حقن الخلايا السرطانية ، وبالتالي ، يوصى بإجراء تجربة أولية لتقدير الوقت اللازم لإكمال جميع الخطوات. استخدام العلامات الفلورية الخلايا السرطانية التفاضلية يساعد على تقليل أعداد الحيوانات والوقت اللازم لكل تجربة. على سبيل المثال، يمكن تسمية خلايا التحكم مع RFP (بروتين الفلورسنت الأحمر) في حين يمكن تسمية الخلايا السرطانية المتحولة بدلا من ذلك مع GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر). في هذه الحالة، كل تجربة لديها المدمج في السيطرة التي تصحح للتغير بين الأجنة.

  1. تجميع جهاز الحقن كما هو مبين على الشكل 2B. أولا قم بتركيب إبرة على الحقنة ثم قم بتمديد إبرة الحقنة بقطعة طويلة من الأنابيب طولها 3-5 سم.
  2. كسر غيض من إبرة borosilicate قبالة باستخدام ملقط غرامة (~ 20-60 ميكرولتر واسعة).
  3. تحميل المحاقن مع تعليق الخلية السرطانية (50-200 ميكرولتر) وإدراج إبرة borosilicate في أنابيب(الشكل 2B).
  4. فحص إبرة borosilicate لانسداد الخلايا وفقاعات الهواء. من المهم حقن الخلايا قي تعليق خلية واحدة لضمان أن كل مستعمرة النقيلي هو التي بدأتها خلية واحدة.
    ملاحظة: الخلايا السرطانية تميل إلى تجميع في برنامج تلفزيوني في غضون 1-2 ساعة بعد المحاولة، وبالتالي، ينبغي أن تكون مستعدة مباشرة قبل الحقن. إذا لزم الأمر، يمكن إعادة إنفاق الخلايا بشكل دوري باستخدام حقنة 1 مل المستخدمة للحقن (بدون إبرة البوروسيليكات).
  5. إذا لوحظ انسداد الخلايا داخل الشعرية، قم بإزالة الشعرية، وإعادة تعليق الخلايا، واستبدالها بشعيرات شعرية جديدة. استخدام المكبس لدفع أي فقاعات. إذا لم يتم ملاحظة انسداد الخلية أو فقاعات المضي قدما إلى الخطوة التالية.
  6. قم بإزالة غطاء الغطاء ونقل الجنين تحت المجسم. تحديد الوريد المناسب ليتم حقنه على سطح CAM. الأوردة والشرايين تشكل شبكة معقدة داخل الأنسجة CAM (الشكل 2C). تتميز الأوردة باللون الأحمر الأكثر إشراقا لأنها تحمل الدم الغني بالأوكسجين إلى الجنين.
    ملاحظة: للتلاعب العام بالجنين وحقن الخلايا السرطانية وتكسير المستعمرة النقيلي، استخدم منظارا مجسما فلوريا مجهزا بأهداف 0.8x و1.5x و10x للتصور. كما يمكن استخدام المجهر الأقل تقدما بنجاح لهذه الإجراءات، اعتمادا على مستوى خبرة المستخدمين. يمكن للقراء الاتصال بالمؤلفين للحصول على توصيات أكثر تفصيلا.
  7. العثور على الوريد المثالي لحقن الخلايا التي عادة ما تكون أوسع قليلا فقط (10-20٪) من قطر طرف إبرة borosilicate وتقع في منتصف الطريق بين الجنين وجدار طبق الوزن. من الأسهل عموما الحقن عند النقطة المجاورة مباشرة لتشعب الوريد.
    ملاحظة: قد يبدو الحقن في وريد أكبر أسهل ولكنه سيؤدي إلى نزيف مفرط وانخفاض بقاء الجنين.
  8. اضغط على طرف الإبرة ضد جدار الأوعية الدموية وتطبيق ضغط لطيف في نفس اتجاه تدفق الدم. إذا لزم الأمر، استخدم مسحة قطنية (في يد أخرى) للمساعدة في تثبيت أو تثبيت السفينة التي يتم حقنها.
  9. الاكتئاب بلطف المكبس حقنة. يمكن للمرء تصور حقنة ناجحة من خلال مراقبة "تطهير" الأوعية الدموية عندما يدخل تعليق الخلايا السرطانية مجرى الدم.
  10. مواصلة الاكتئاب المكبس حقنة لمدة 2-10 ق حتى يتم حقن حجم التعليق المطلوب في مجرى الدم في الوريد. قد يتطلب حقن جنين واحد معا 1-10 دقائق اعتمادا على مستوى خبرة المستخدم. إذا ظهر نزيف مفرط أو تراكم سائل واضح في موقع الحقن، فتخلص من الجنين.
    ملاحظة: من السهل "الإفراط في حقن" الجنين. الاعتبار العام الذي ينبغي أن يوضع في الاعتبار هو أن المستعمرات النقيلي لا ينبغي أن تلمس بعضها البعض بعد فترة نمو 4-5 أيام. من الناحية المثالية ~ 5-10٪ من الشعيرات الدموية الوريد CAM المحطة ينبغي أن يكون الخلايا شلت فيها بعد حقن ناجحة (الشكل 2D، ه). كما ذكر في الخطوة 2، يمكن استخدام مجموعة من تركيز الخلايا (0.5 × 106 - 1.0 × 106 خلايا / مل). تركيزات أقل سوف تتطلب وقتا أطول للحقن ولكن سوف يقلل من انسداد الإبرة. تركيزات أعلى سوف تتطلب أقصر أوقات الحقن ولكن سوف تزيد من انسداد الإبرة. فمن المستحسن أن محاولة تركيزات عدة للعثور على واحد هو الأكثر راحة للمشغل. عموما، يفضل تركيز أعلى (1.0 × 106 خلايا / مل) لتقليل وقت الحقن.
  11. إزالة الإبرة من CAM وداب بلطف موقع الحقن مع مسحة القطن لإزالة أي دم أو الخلايا السرطانية الزائدة.
  12. قم بتغطية الجنين في طبق الوزن بغطاء ثم أعد جنين الدجاج المحقون إلى الحاضنة.
  13. كرر العملية مع الجنين التالي حتى يتم حقن جميع الأجنة.

4. صيانة الأجنة خلال نمو المستعمرة النقيلي

  1. فحص بصريا الأجنة. إذا كان هناك أي التي هي ميتة، و / أو ملوثة بالبكتيريا أو العفن إزالتها من الحاضنة، ثم الأوتوكلاف والتخلص منها وفقا لإجراءات التخلص من المختبر.
    ملاحظة: يوصى بفحص الأجنة كل يومين (أيام 1، 3، 5 بعد حقن الخلايا السرطانية) لنمو المستعمرة النقيلية. تجنب تحريك الأجنة المحقونة دون داع لأنها قد تسبب تلف الجنين و / أو الوفاة.
  2. إذا كانت الخلايا عرض فرط النمو (تتداخل المستعمرات النقيلية مع بعضها البعض) أو توزيع غير متساو داخل أنسجة CAM (المستعمرات النقيلية الموجودة في منطقة فرعية صغيرة من سطح CAM) إزالة هذا الجنين من التجربة. قتل الأجنة المهملة عن طريق التجميد عند -20 درجة مئوية (أو طريقة أخرى معتمدة) مباشرة بعد إزالتها من التجربة. سينخفض عدد الخلايا النقيلية القابلة للحياة داخل أنسجة CAM في البداية (أيام 1-2) ثم يزيد (أيام 2-5).
    ملاحظة: قد "ترفض" بعض الأجنة الخلايا السرطانية، أي أن جميع الخلايا السرطانية ستختفي من أنسجة كام. يجب إزالة هذه الأجنة من التجربة. عادة، يمكن رؤية مستعمرات الخلايا السرطانية من خلال الغطاء الشفاف تحت المجهر ستيريو الفلورسنت دون فتح طبق الوزن.
  3. تأكد من ظهور المستعمرات النقيلية موحدة الشكل (أول 1-3 أيام بعد الحقن). تحديد المستعمرات النقيلية الغازية أو غير الغازية في الأيام 4-5 بعد الحقن (انظر القسم 5 لمزيد من التفاصيل).

5. عزل المستعمرات النقيلية

  1. في اليوم 5 بعد الحقن إزالة الأجنة من الحاضنة وفحص CAMs الجنين لتوزيع مستعمرة النقيلي. تحديد الأجنة مع توزيع مستعمرة موحدة في المستعمرات المدمجة (أو الغازية بشكل مفرط) موجودة.
    ملاحظة: عملية زراعة أجنة الدجاج ليست عقيمة، لذلك، يجب أن يتم إجراء جميع خطوات الفحص في ظل ظروف نظيفة للغاية لتجنب تلوث زراعة الأنسجة في المستقبل. التلوث هو نادر جدا ويمكن تجنبها بسهولة عن طريق ارتداء قفازات وقناع واستخدام أدوات معقمة فقط أثناء حقن الخلايا وإجراءات عزل المستعمرة. يوصى بفحص الأجنة واحدا تلو الآخر لتقليل تعرضها لدرجة حرارة المختبر المحيطة ومنع التلوث.
  2. حدد موقع المستعمرة النقيلية ذات الاهتمام. يمكن وصف المستعمرة المدمجة بأنها مستعمرة تحتوي على معظم الخلايا السرطانية الموجودة داخل منطقة محدودة في أنسجة CAM (تظهر الخلايا "متجمعة معا"). ويمكن وصف مستعمرة الغازية بأنها مستعمرة حيث الخلايا السرطانية "مبعثر" في الأنسجة CAM (الشكل 3A, ب).
    ملاحظة: يمكن تفسير "ضغط" المستعمرة النقيلية إما عن طريق تثبيط غزو الخلايا السرطانية ، أو تثبيط انتشار الخلايا السرطانية ، أو كليهما. وينبغي إيلاء الاهتمام لجميع السيناريوهات وينبغي عزل مستعمرات الاتصال (الشكل 3A، باء). يمكن استخدام منظار مجسم فلوري بسيط للتمييز بين الأنماط الظاهرية للمستعمرة النقيلية المدمجة والغازية.
  3. تحت المجهر تشريح بلطف سحب الأنسجة CAM التي تحتوي على مستعمرة النقيلي من الفائدة صعودا باستخدام ملقط ناعم(الشكل 3C).
  4. قطع الأنسجة CAM التي تحتوي على مستعمرة النقيلي باستخدام مقص الجراحية.
  5. نقل الأنسجة CAM التي تحتوي على مستعمرة النقيلي في فارغة، معقمة 1.5 مل أنبوب (على الجليد) وإغلاق غطاء أنبوب.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المستعمرات المعزولة على الجليد لمدة تصل إلى 3 ساعة دون فقدان الجدوى.
  6. كرر إجراء ختان حتى يتم جمع جميع المستعمرات ذات الاهتمام في أنابيب منفصلة. لتجنب معاناة الحيوانات، لا تستأصل أكثر من 2-3 مستعمرات من جنين واحد. قتل الأجنة عن طريق تجميد في -20 درجة مئوية (أو طريقة أخرى معتمدة) مباشرة بعد استئصال المستعمرة.
  7. فرم بلطف الأنسجة CAM في أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام إبرة قياس 18 معقمة. استخدام إبرة منفصلة لكل مستعمرة.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1x واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  9. تدور أسفل الخلايا والأنسجة CAM في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
  10. يستنشق محلول الكولاجينيز والخلايا ريسوبيند في وسائل الإعلام الكاملة المستخدمة لخط الخلية من الفائدة.
    ملاحظة: عادة لا يتم فصل أنسجة CAM تماما بعد علاج الكولاجينيز والخلايا السرطانية سوف تتكاثر أولا داخل قطع من أنسجة CAM وتهاجر فقط في وقت لاحق على طبق زراعة الأنسجة.
  11. تدور الخلايا والأنسجة CAM مرة أخرى في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
  12. Resuspend الخلايا وقطع الأنسجة CAM في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة بالإضافة إلى عامل الاختيار (إن وجدت)، ثم نقل إلى واحد 12 طبق زراعة الأنسجة جيدا.
    ملاحظة: قد تستمر الخلايا الليفية كام الدجاج في زراعة الأنسجة لمقاطع متعددة تمنع التوسع اللاستنساخي. القدرة على توسيع المستعمرات النقيلية في وجود عامل الاختيار (أي إذا كان الناقل الذي استخدم لجعل الخلايا السرطانية الفلورسنت أيضا ترميز جين مقاومة المضادات الحيوية الثدييات) قد تسرع كثيرا التوسع اللاستنساخي. يجب إجراء تجربة منحنى القتل قبل الفحص لضمان استخدام التركيز السليم للمضادات الحيوية.
  13. للأسابيع القادمة 1-3 رصد الخلايا السرطانية يوميا للنمو والتلوث.
  14. عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من خلايا نقل الالتقاء إلى طبق ثقافة حجم أكبر.
    ملاحظة: من المستحسن توسيع الخلايا حتى يمكن تجميد قنينتين على الأقل من كل استنساخ. الحفاظ على كميات كبيرة من زراعة الأنسجة يمكن أن تكون شاقة وغير ضرورية.
  15. انتقل إلى التسلسل أو الجولة التالية من الاختيار بمجرد الوصول إلى عدد كاف من الخلايا السرطانية. عموما، 1 × 106 من الخلايا السرطانية كافية لتقنيات التسلسل الحديثة عالية الإنتاجية.
  16. المضي قدما في استنساخ reinjection والتصوير وتكميم ضغط مستعمرة أو اتصال الخلايا الدموية السرطانية(الشكل 2A). بدلا من ذلك انتقل إلى تسلسل الإنتاجية العالية أو تكرار اختيار المستعمرة.
    ملاحظة: لتقليل عدد الإيجابيات false يوصى جولتين على الأقل من التحديد. وقد تم استخدام نهجين بنجاح. 1) توسيع كل استنساخ وإعادة حقن بشكل فردي لتأكيد النمط الظاهري مستعمرة. 2) مزيج جميع المستنسخين الموسعة في نسبة 1:1 لكل منهما، وإعادة الصف كخليط وتكرار دورة الاختيار.

6. حقن الليكتينات الموسومة بالفلورسنت في الأوعية الدموية CAM.

  1. تحديد الوريد الذي سيتم حقنه. فمن الأسهل استخدام نفس موقع الحقن لليكتين التي كانت تستخدم لحقن الخلايا السرطانية.
  2. تمييع محلول الأسهم الليكتين الفلورسنت (5 ملغم / مل) 50-100x مع برنامج تلفزيوني 1x وتحميله في نفس جهاز الحقن كما هو مستخدم لحقن الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: تعتمد كمية الليكتين التي تحتاج إلى حقن (عادة 20-100 ميكرولتر) لتصور الأوعية الدموية على حساسية المجهر ويجب تحديدها تجريبيا قبل الفحص.
  3. حقن الليكتين باستخدام نفس التقنية لحقن الخلايا السرطانية (انظر الخطوات 3.6.-3.10.).
  4. بعد حقن الليكتين، ضع الجنين في الحاضنة للتعافي لمدة 5 دقائق. حقن جنين واحد فقط في وقت واحد وعلى الفور قبل تصوير الجنين.
    ملاحظه. الأجنة التي هي 12 يوما أو أكثر عموما يتعافى بشكل جيد من حقن الليكتين ويمكن إعادة حقن مع الليكتين مرة أخرى في اليوم التالي للتصوير المتتابع. الأجنة الأصغر سنا هي أكثر حساسية وقد تظهر تخثر الدم.

7. تصور الاتصالات الخلايا الدموية السرطانية

  1. تعيين العلبة المجهر منظم درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية تقريبا 6 ساعة قبل التصوير. وهذا من شأنه تثبيت درجة حرارة المجهر والمساعدة في تقليل الانجراف XYZ أثناء التصوير.
    ملاحظه. تم استخدام غرفة تصوير جنين الدجاج المتخصصة9و10و11و12و13 لهذه التجربة. ويمكن استخدام المجهر تشريح الفلورسنت بسيطة لجميع الخطوات بدءا من حقن الخلايا السرطانية لاستنساخ اختيار واستنساخ reinjection، وتقييم ضغط مستعمرة. المجهر confocal التي تم تجهيزها مع غرفة التصوير ضروري للتصوير وتكميم الاتصالات الخلايا الدموية السرطانية. لا حاجة للتدفئة لمدة تصل إلى ساعة واحدة، وعموما الأجنة البقاء على قيد الحياة ما لا يقل عن جلستين التصوير المتتابعة مع أي تأثير على قدرتها على البقاء.
  2. تأكد من تركيب العدسة الموضوعية الضرورية (يوصى باستخدام عدسة الهدف من غمر الماء 20x أو 25x).
  3. تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم فراغ إلى الجانب السفلي من غطاء غرفة التصوير لإنشاء ختم آمن مع غطاء.
  4. وضع بلطف غطاء في الغطاء ومسح أي الشحوم فراغ الزائدة.
  5. أخرج الجنين المحقون من الحاضنة واقطع حواف طبق الوزن إذا لزم الأمر.
  6. ضع الجنين في غرفة التصوير مع خفض الغطاء إلى أسفل مباشرة على منطقة CAM حيث تقع المستعمرات النقيلية ذات الاهتمام. خفض الغطاء ببطء على الجنين حتى coverlip يتصل فقط CAM. قم بشد البراغي لتأمين الغطاء في مكانه، وتأكد من تسوية الغطاء وأن الغطاء لا يضع أي ضغط نزولي على CAM.
  7. الحصول على صور لمستعمرات متعددة وعشوائية من مجموعات التحكم والتجريبية (10-20) من عدة أجنة (5-10).
    ملاحظه. يوصى بالحصول على مداخن ثلاثية الأبعاد عشوائية (1-5um Z-steps؛ نطاق 50-100um؛ 25x) من كل حقل.
  8. استخدم خيار خياطة الحقل في برنامج اكتساب المجهر إذا كان متوفرا. وبما أن الصور المستخدمة للقياس الكمي لن تكون جودة المنشور، فاستخدم أوضاع الامتلاك السريع مثل المسح الرنان إذا توفرت. استخدام الهدف 25x و 3 × 3 خياطة مع 5-10 ميكرومتر Z-الخطوة، 100 ميكرومتر النطاق الإجمالي. صورة ما لا يقل عن 100 خلية (~ 20 مستعمرة) لكل حالة.

8. تحديد كمي من المخالطين الأوعية الدموية الخلايا السرطانية

  1. افتح الملف ثلاثي الأبعاد ككدسة Z باستخدام البرنامج الضروري.
    ملاحظه. يجب استخدام برامج متخصصة للحصول على وتحليل الصور عالية الدقة من أجل تحديد مدى اتصال الخلايا السرطانية والأوعية الدموية. تتوفر عدة حزم برامج قادرة على تحليل الصور ثلاثية الأبعاد. يرجى الاطلاع على جدول المواد لمزيد من التفاصيل.
  2. إذا حدث حركة XY هامة أثناء الحصول على الصورة، قم بمحاذاة المكدس Z باستخدام المكون الإضافي ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
  3. حدد موقع الخلية (الخلايا) ذات الاهتمام.
  4. انتقل من خلال صورة XYZ في اتجاه Z وحدد القسم البصري الذي يحتوي على أقصى طول اتصال الأوعية الدموية للخلية السرطانية للخلية ذات الاهتمام (الشكل 2E).
  5. قياس اتصال الخلايا السرطانية والأوعية الدموية باستخدام "وظيفة قياس الطول اليدوي".
  6. أدخل القياسات في حزمة برامج البيانات المستخدمة للتحليل الإحصائي.
    ملاحظة: يمكن قياس قدرة الخلايا السرطانية على الالتصاق بالأوعية الدموية إما على أنها طول مخالطي الخلايا الدموية السرطانية أو النسبة المئوية للخلية التي تتلامس مع الأوعية الدموية لاستنساخ خلايا سرطانية معينة (أو كليهما).
  7. انتقل إلى الخلية التالية من الاهتمام.
  8. تحليل البيانات للأهمية الإحصائية مقارنة استنساخ متحولة (ق) ومجموعات البيانات التحكم.

9. مستعمرة ضغط الكمي

  1. إعادة حقن الخلايا من استنساخ الموسعة باستخدام نفس الأسلوب كما هو الحال في الخطوة 2.
  2. خمسة أيام بعد الحقن الحصول على صور من 10-50 مستعمرات النقيلي عشوائي لكل استنساخ.
    ملاحظة: لا توجد صور عالية الجودة ضرورية للقياس الكمي لمدمج المستعمرة النقيلي. صور أحادية اللون، مجهر ستيريو (تكبير 10x) كافية. يجب الانتباه إلى سطوع الصورة (يجب رؤية معظم الخلايا داخل المستعمرة) والتباين (الفرق بين خلية واحدة أو اثنتين).
  3. عزل رقميا صورة مستعمرة (انظر الشكل 2C, D) والمضي قدما في القياس الكمي ضغط مستعمرة باستخدام وحدة القياس الكمي المدمجة مستعمرة مستقلة أو أعمى تسجيل13.
  4. انتقل إلى المستعمرة التالية ذات الاهتمام.
  5. تحليل البيانات للأهمية الإحصائية مقارنة استنساخ متحولة (ق) والتحكم (أي التدافع shRNA) مجموعات البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتبر حقن الخلايا السرطانية ناجحا إذا كانت غالبية الخلايا التي استقرت في الشعيرات الدموية واحدة وتقع في اختلاف كبير عن بعضها البعض (~ 0.05-0.1 سم) وبالتالي فإن المستعمرات لن تتداخل بعد 5-6 أيام من فترة الحضانة(الشكل 3A). لم تكن الحقنة ناجحة إذا كان يمكن رؤية تراكم الخلايا السرطانية في معظم الشعيرات الدموية ، وينبغي التخلص من الأجنة التي تعرض هذا(الشكل 2E). وهناك عدد كبير من الخلايا السرطانية المحقونة يهلك في غضون 24 ساعة من الحقن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نحن نصف المجهر الفلوري السريع القائم على بروتوكول الفحص داخل الحتمية التي يمكن استخدامها لتطبيقات هامة مثل الشاشات الوراثية أو المخدرات المرشحة. يمكن فحص الخلايا السرطانية التي تم تحويلها مع مكتبة وراثية ذات أهمية أو متحولة مع بنيات التعبير الفردية بسرعة وقياسها كميا فيما يتعلق بالنمط الظاهري للاهتمام باستخدام نموذج CAM الفرخ هذا. وبما أن بروتوكولات النقل أو العدوى تختلف اختلافا كبيرا، تبعا لنوع المكتبة، فإنها غير مشمولة في هذا الإجراء. يتم استئصال المستعمرات النقيلية ذات الصلة Phenotypically من CAM ، وتوسيعها ، وعزل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شيء للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل معهد أبحاث جمعية السرطان الكندية منحة #702849 إلى JDL وKS. الدكتور لويس يحمل كرسي فرانك وكارلا سوجونكي في أبحاث سرطان البروستاتا بدعم من مؤسسة ألبرتا للسرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل محاقن يمكن التخلص منهاBDBD309659
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية الشكل.CorningCLS430791-500EA
مقياس 18 × 1 1/2   ؛ إبرة BD الدقيقةBDBD305196نستخدم 1.2 مم × 40 مم ، فمن الممكن استخدام إبر أقصر إذا كان مفضلا
2.5٪ محلول التربسينمتوفرة
4T1 سرطان الثدي الفأرATCC CRL-2539
B16F10 الفأر خط خلايا الورم الميلانينيATCCCRL-6475
طرد مركزي منضدة.تتوفر العديد من المصادرأي جهاز طرد مركزي متوافق مع TC يمكن استخدامه لتدوير الخلايا مناسب
أغطية دائرية ، 22 مم.فيشر ساينتفيك12-545-101
كولاجينازسيجماC0130-100MG
مجهرنيكون A1r
،يجب تعقيم العديد من المصادرالمتاحة قبل الاستخدام
، تتوفر العديد من المصادر ، وتتوفرالعديد من المصادر، ونحن نزرع خطوط خلايا HT1080 و HEp3 و b16 في DMEM ، 10٪ FBS وسائل
الإعلام حاضنة البيضالعديد من المصادريعتمد النموذج الدقيق الضروري على حجم الشاشة. المصادر المتاحة هي شركة MGF Company Inc. ، Savannah ، GA ، أو  . شركة ليون إلكتريك ، تشولا فيستا ، كاليفورنيا
أنابيب eppendor ، 1.5 ملSigmaT4816-250EA
بيض White Leghorn المخصبللمورد
تتوفر العديد من المصادريجب تعقيمها قبل استخدام
مقياس الدم   ؛Millipore-SigmaMDH-4N1-50PK
HT1080 خط خلايا الساركوما الليفية البشريةATCCCCL-121
برنامجنحن نستخدم Nikon Elements
Lectin Lens Culinary< / em> Agglutinin (LCA) مترافق مع الفلوريسين أو الرودامين & nbsp ؛مختبرات ناقلاتRL-1042 ، FL-1041مخفف (5 مجم / مل) 50-100x اعتمادا على حساسية المجهر. يجب أن يكون لون مختلف عن لون خط الخلايا المستخدم لفحص
MDA-MB-468 سرطان الثدي البشريATCCHTB-132
PBS (1x)تتوفر العديد من المصادر
أطباق الترجيح البلاستيكية  SimportCA11006-614هي 78x78x25mm ؛ تتوفر العديد من المصادر الأخرى
مقص جراحي صغير   ؛العديد من المصادر المتاحةيجب تعقيمها قبل استخدام
أنابيب شعرية زجاجية من بورسليكات الصوديوم ، القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.58 مم ، طول 10 سم ؛أداة سوترBF100-58-10
أطباق بتري مربعة (تستخدم كأغطية لأطباق الترجيح).  VWR CA25378-115 الأبعاد 100 × 100 × 15 مم ؛ تتوفر العديد من المصادر الأخرى
مجهر فلورسنت ستيريو نحن نستخدم Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 أنابيب مختبريةCole-ParmerAAC000011/32 في القطر الداخلي ، 3/32 بوصة القطر الخارجي ، 1/32 بوصة سمك الجدار
U-118 MG الورم الأرومي الدبقي البشريATCCHTB-15
U-87 MG الورم الأرومي الدبقي البشريATCCHTB-14
مجتذب الماصة العمودي   ؛تتوفر العديد من المصادر، نستخدم David Kopf Instruments ، Tujunga ، CA ؛ نموذج 720
العديد من المصادر جهاز متحد البؤر نستخدم مسحات قطنية تتوفر أي ملقط ناعم المحلي تحليل الصور مخزون أبعاد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
  3. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
  4. Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
  5. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  6. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  7. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  8. Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
  9. Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
  10. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
  11. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
  12. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815(2011).
  13. Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343(2018).
  14. Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
  15. Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cancer Metastasis ModelIntravital ImagingCancer Cell XenograftingshRNA Gene LibraryTumor Colony PhenotypePrimary Tumor FormationVasculature Co OptionRapid Screening Platform

مقالات ذات صلة