تمكن الطريقة المقدمة من تصور البروتينات الخلوية المسماة بالفلورسنت مع المجهر التوسعي مما يؤدي إلى دقة 70 نانومتر على المجهر التقليدي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير البروتينات بودوسيتيك نيفرين، أكتين، وبودوسين مع المجهر التوسع
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعطيل مرشح الكبيبي تتألف من بطانة الرحم الكبيبية، غشاء الطابق السفلي الكبيبي وpodocytes، والنتائج في الزلال. تحتوي عمليات القدم Podocyte على حزم أكتين ترتبط ببروتينات محول الهيكل الخلوي مثل بودوسين. تلك البروتينات محول، مثل بودوسين، ربط العمود الفقري للحجاب الحاجز شق الكبيبي، مثل الكليفرين، إلى الهيكل الخلوي أكتين. دراسة توطين ووظيفة هذه وغيرها من البروتينات podocytic أمر ضروري لفهم دور مرشح الكبيبي في الصحة والمرض. البروتوكول المقدم يمكن المستخدم من تصور أكتين، بودوسين، والنيفرين في الخلايا مع التصوير فائقة الدقة على المجهر التقليدي. أولا، الخلايا ملطخة بتقنية الفلورة المناعية التقليدية. ثم يتم تثبيت جميع البروتينات داخل العينة بشكل متناقض على هيدروجيل قابل للانتفاخ. من خلال الهضم مع البروتين K ، يتم شق البروتينات الهيكلية مما يسمح بتورم إيزوتروبي من الجل في الخطوة الأخيرة. يؤدي غسيل الكلى للعينة في الماء إلى توسيع العينة بمقدار 4-4.5 أضعاف ويمكن تصوير العينة عبر مجهر مضان تقليدي ، مما يجعل الدقة المحتملة 70 نانومتر.
المقدمة
الزلال هو معلمة بديلة من مخاطر القلب والأوعية الدموية والنتائج من تعطيل مرشح الكبيبي1. يتكون الفلتر الكبيبي من البطانة الفينيستة، وغشاء الطابق السفلي الكبيبي والحجاب الحاجز الشقي الذي تشكله الخلايا الحبيبية. عمليات القدم الأولية والثانوية من podocytes التفاف حول جدار الشعيرات الدموية من الكبيبة2. يتم الحفاظ على الهيكل الدقيق لعمليات القدم من خلال حزم أكتين القشرية التي تعمل أيضا كمرساة لبروتينات الحجاب الحاجز متعددة الشق وغيرها من البروتينات محول2. ويسمى البروتين العمود الفقري للشق الحاجز الكليرين ويتفاعل بطريقة متجانسة مع جزيئات الكليفرين من podocytes معارضة. عن طريق البروتينات محول متنوعة, ويرتب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تقسيم وبذر الخلايا
- الاحماء المعقمة Dulbecco النسر المعدل المتوسط (DMEM) بما في ذلك 10٪ مصل العجل الجنيني (FCS)، الفوسفات المعقم العازلة المالحة (PBS) والريبسين العقيم إلى 37 درجة مئوية. تفعيل مقاعد البدلاء نظيفة.
- إعداد لوحة 6-جيدا بإضافة زلة غطاء زجاجي معقم واحد (10 ملم) إلى كل بئر باستخدام ملقط معقم.
- وضع طبق ثقافة الخلية 10 سم مع خلايا Cos7 تحت مقاعد البدلاء نظيفة. تحت مقاعد البدلاء نظيفة، يستنشق المتوسطة الخلايا باستخدام جهاز فراغ.
- عقد طبق ثقافة الخلية المقشورة في يد واحدة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى جانب طبق ثقافة الخلية لتجنب الشطف قبالة الخلايا. وضع طبق ثقافة الخلية أسفل بحيث PBS يشطف طبق ثقافة الخلية كاملة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تصوير مفهوم وتوقيت هذا البروتوكول proExM في الشكل 1. في اليوم 5، يتم إصلاح الخلايا المصابة وملطخة بالأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف البروتين من الفائدة(الشكل 1A،B). في اليوم السادس، يؤدي العلاج ب AcX إلى تكوين مجموعات أمين على جميع البروتينات (بما في ذلك الفلوروفوريس) (الشكل 1A،B)12. عند بلمرة الهيدروجيل ، ترتبط هذه المجموعات الأمينية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تمكن الطريقة المعروضة المحقق من تصور البروتينات الخلوية ، على سبيل المثال ، بودوسين ، نيفرين ، ومكونات الهيكل الخلوي ، على سبيل المثال ، F-actin. ضمن هذا البروتوكول، يتم استخدام خلايا cos7 المصابة كنموذج لدراسة التفاعل بين بروتينات الحجاب الحاجز الشق مع F-actin. لسوء الحظ، خطوط خلايا podocyte الخالدة لا تعبر عن كميات داخلية كافية من بروتينات الحجاب الحاجز الشق19.
مع هذه الطريقة ، يمكن تصور البروتينات الخلوية بدقة نانوية باستخدام مجهر مضان تقليدي. الخطوات الأكثر أهمية في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
ويود صاحبا البلاغ أن يشكرا بلانكا دوفنياك ونيكولا كوهر على مساعدتهما التقنية الممتازة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أكريلاميد >99٪ | سيجما ألدريتش | A3553-100G | |
| 6- ((أكريلويل) أمينو) حمض الهكسانويك ، إستر السكسينيمديل ، أكريلويل X ، SE | invitrogen | A-20770 | تخزين ما يصل إلى 4 أشهر |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgl & auml ؛ ser (غطاء نظارات) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm # 1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | لقطع زلات الغطاء |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M يمكن الاحتفاظ بالمخزون في |
| RT Marten فرشاة رسم الشعر | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgl & auml ؛ ser (غطاء النظارات) | Thermo Fischer | 15654786 | 24 × 24 مم # 1.5 |
| N ، N'-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objekttr & auml ؛ ger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| أكريلات الصوديوم | Sigma-Aldrich | 408220 | تحقق من النقاء |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| تلطيخ | أنتجت في ورشة عمل الجامعة | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well Glass Bottom Plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | غير متوفرة | 1:40 |
| Anti Podocin المنتجة في الأرانب | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| الحمار المضاد لخنزير غينيا CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1: 200 |
| الماعز المضادة للأرانب 488 | Life Technologies | A11034 | 1: 1000 |
| خنزير غينيا المضاد للنفرين | Origene | BP5030 | 1: 100 |
| Software< / strong> | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| < قوي > مجهر < / قوي> | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | غير متوفر |
المراجع
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
