Method Article

نهج التصور والتحليل ثلاثي ورباعي الأبعاد لدراسة الاستطالة المحورية الفقارية وتجزئتها

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف الأدوات والأساليب الحسابية التي تسمح بتصور وتحليل بيانات الصور ثلاثية ورباعية الأبعاد لأجنة الفئران في سياق الاستطالة المحورية والتقسيم ، والتي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي بالإسقاط البصري ، وعن طريق التصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل باستخدام المجهر متعدد الفوتونات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somitogenesis هو السمة المميزة للتطور الجنيني الفقاري. لسنوات ، كان الباحثون يدرسون هذه العملية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية باستخدام مجموعة واسعة من التقنيات التي تشمل النهج خارج الجسم الحي وفي المختبر. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات تعتمد على تحليل بيانات التصوير ثنائية الأبعاد (2D) ، مما يحد من التقييم السليم لعملية تنموية مثل الامتداد المحوري وتكوين السوميتوجينيسيس التي تنطوي على تفاعلات ديناميكية للغاية في مساحة 3D معقدة. هنا نصف التقنيات التي تسمح للفأر بالحصول على التصوير الحي ، ومعالجة مجموعة البيانات ، والتصور والتحليل في 3D و 4D لدراسة الخلايا (على سبيل المثال ، أسلاف الجلد المتوسط العصبي) المشاركة في هذه العمليات التنموية. كما نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري والمجهر المناعي الكامل في أجنة الفئران (من إعداد العينات إلى الحصول على الصور) ونظهر خط أنابيب قمنا بتطويره لمعالجة وتصور بيانات صورة 3D. نحن نوسع نطاق استخدام بعض هذه التقنيات ونسلط الضوء على ميزات محددة لمختلف البرامج المتاحة (على سبيل المثال ، فيجي / ImageJ ، Drishti ، Amira و Imaris) التي يمكن استخدامها لتحسين فهمنا الحالي للامتداد المحوري وتشكيل somite (على سبيل المثال ، إعادة بناء 3D). بشكل عام ، تؤكد التقنيات الموصوفة هنا على أهمية تصور وتحليل البيانات ثلاثية الأبعاد في البيولوجيا التنموية ، وقد تساعد الباحثين الآخرين على معالجة بيانات الصور ثلاثية الأبعاد و 4D بشكل أفضل في سياق الامتداد المحوري للفقاريات وتجزئتها. وأخيرا، يستخدم العمل أيضا أدوات جديدة لتسهيل تعليم التطور الجنيني للفقاريات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكيل محور جسم الفقاريات هو عملية معقدة للغاية وديناميكية تحدث أثناء التطور الجنيني. في نهاية عملية المعدة [في الفأر ، حول اليوم الجنيني (E) 8.0] ، تصبح مجموعة من الخلايا السلفية الفوقية المعروفة باسم أسلاف الجلد المتوسط العصبي (NMPs) محركا رئيسيا للامتداد المحوري في تسلسل الرأس إلى الذيل ، مما يولد الأنبوب العصبي وأنسجة الجلد المتوسط الباراكسي أثناء تكوين الرقبة والجذع والذيل1،2،3،4 . ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن الموقع الذي تشغله هذه NMPs في الأرومة الذيلية يلعب دورا رئيسيا في قرار التمايز إلى الأديم المتوسط أو الأديم العصبي

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتبعت التجارب التي شملت الحيوانات التشريعات البرتغالية (Portaria 1005/92) والأوروبية (التوجيه 2010/63/EU) المتعلقة بالإسكان والتربية والرعاية الاجتماعية. وقد استعرضت المشروع ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات التابعة ل "معهد غولبنكيان دي سينسيا" والكيان الوطني البرتغالي "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (مرجع الترخيص: 014308).

1. إعداد عينة للتصوير 3D و 4D

ملاحظة: نقدم هنا وصفا مفصلا حول كيفية تشريح وإعداد أجنة الفئران E8.25 إلى E10.5 للتصوير الحي (1.1) ، والأجنة E7.5 إلى E11.5 للفحص المجهري المناعي الكامل (1.2) والأجنة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري (1.3).

  1. إعداد العينات للتصوير الحي
    1. تشريح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على النتائج التمثيلية الموضحة في هذه الورقة لكل من التصوير الحي والتألق المناعي ، باستخدام نظام ثنائي الفوتون ، مع هدف مائي 20 × 1.0 NA ، وليزر الإثارة مضبوط إلى 960 نانومتر ، وأجهزة الكشف الضوئي GaAsP (كما هو موضح في Dias et al. (2020)43. تم إجراء التصوير المقطعي بالإسقاط البصري باستخدام ماسح ضوئي OPenT مصمم خصيصا (كما هو موضح في Gualda et al. (2013)28.

التصوير الحي (تحليل 4D)
تحليل تمثيلي لنشاط مراسل LuVeLu في أجنة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستطالة المحورية والتقسيم هما من أكثر العمليات تعقيدا وديناميكية التي تحدث أثناء التطور الجنيني للفقاريات. تم تطبيق استخدام التصوير ثلاثي الأبعاد و 4D مع تتبع خلية واحدة ، لبعض الوقت ، لدراسة هذه العمليات في كل من أجنة الزرد والدجاج ، والتي تسهل ظروف الوصول إليها واستزراعها التصوير المعقد 19,44,45,46,47,48,49

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أوليفييه بوركييه وألكسندر أوليهلا على سلالة مراسل LuVeLu ، ومختبر SunJin لعينة اختبار RapiClear ، وهوغو بيريرا على المساعدة في استخدام BigStitcher ، ونونو غرانجيرو للمساعدة في إعداد جهاز التصوير الحي ، ومرفق الحيوانات التابع للجنة الحكومية الدولية والأعضاء السابقين والحاليين في مختبر Mallo للحصول على تعليقات ودعم مفيدين خلال هذا العمل.

ونشكر الدعم التقني المقدم من مرفق التصوير المتقدم التابع للجنة الحكومية الدولية، والذي يدعمه التمويل البرتغالي المرجع #PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 والمرجع رقم PTDC/BII-BTI/32375/2017، الذي يشترك في تمويله برنامج لشبونة التشغيلي الإقليمي (لشبونة 2020)، بموجب اتفاق الشراكة البرتغالي لعام 2020، من....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

درجة أداة Life أداة أداة التجارية

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حرارة التبلور المنخفضة من AgaroseSigmaA9414تستخدم لتركيب الأجنة (على سبيل المثال للأرض الفلسطينية المحتلة)
برنامج Amiraبرمجيات Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (Poly Clonal Goat Polynonal)R and D SystemsAF2085 RRID: AB_2200235للتألق المناعي
Anti-Sox2 (أحادي النسيلة للأرانب)Abcamab92494 RRID: AB_10585428ل التألق المناعي
المضاد ل Tbx6 (الماعز متعدد النسيرة)أنظمة R و DAF4744 RRID: AB_2200834للتألق المناعي
المضاد لللامينين 111 (متعدد النسيلة للأرانب)SigmaL9393 RRID: AB_477163للتألق المناعي
مضاد للماعز 488 (حمار متعدد النسيلة ) المجساتالجزيئيةA11055 RRID: AB_2534102للتألق المناعي
مضاد للأرانب 568 (حمار متعدد النسيلةThermoFisher   ScientificA10042 RRID: AB_2534017للتألق المناعي
كحول البنزيل (99 +٪)(أي)-يستخدم لإزالة الأجنة (مكون من BABB) بنزوات
البنزيل (99 +٪)(أي)-يستخدم لتنظيف الأجنة (مكون من BABB)
ألبومين مصل الأبقارBiowestP6154للغطاء المناعي
الفلوري 20x20 مم # 0(أي)-غطاء زجاجي بسمك 100 ميكرومتر
20 × 20 مم # 1(أي)-170 ميكرومتر غطاء زجاجي
سميك 20 × 60 مم # 1.5(أي)-للاستخدام ك " الشرائح"
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2- Phenylindole ثنائي هيدروكلوريد)TechnologiesD3571لبرنامج Drishti
المناعي (مفتوح المصدر)-أداة برمجية مجانية
EDTASigmaED2SSلإزالة المعادن
فيجي / برنامج ImageJ(مفتوح المصدر)-أداة برمجية
مجانية GlycineNZYtechMB01401بالنسبة لبرنامج التألق المناعي
Huygensبرنامج Scientific Volume Imaging-Commerialبرنامج
HyClone المحدد مصل بقري الجنينGE Healthcare#HYCLSH30070.03للتصوير الحي
محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪Milipore1085971000لمسح
برنامج ImarisBitplane / Oxford Instruments-أداة البرمجيات التجارية
iSpacersSunJin Lab(يختلف)استخدامالفواصل للمستحضرات
L-glutamineGibco# 25030 &ndash ؛ 024للتصوير الحي المتوسط
منخفض الجلوكوز DMEMGibco11054020للتصوير الحي المتوسط
M2 متوسطسيجماM7167لتشريح الأجنة
الميثانولVWRVWRC20847.307لخطوات الجفاف والجفاف
ميثيل ساليسيلاتسيجماM6752يستخدم لتنظيف الأجنة
بارافورمالديهايدسيجماP6148يستخدم في محلول لإصلاح الأجنة
البنسلين الستربتومايسينسيجما#P0781لوسيط التصوير الحي
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52يستخدم لإزالة الأجنة
غرف التهجين البحري الآمنSigmaC5474استخدم كفواصل ل الاستعدادات
simLab البرمجياتSimLab أداةالبرمجيات
الناعمة الشريحة ، زجاج مقعر الاكتئاب - 75 × 25 مم(أي)-لتركيب أجنة سميكة.
تريتون X-100سيجماT8787للتألق المناعي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles