Method Article

تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التطور السليم لدماغ الثدييات على توازن دقيق بين انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. يتم التحكم في هذا التوازن بإحكام من خلال التعبير الجيني الذي يتم ضبطه على مستويات متعددة ، بما في ذلك النسخ وما بعد النسخ والترجمة. وفي هذا الصدد، تبرز مجموعة متزايدة من الأدلة دورا حاسما للتنظيم التحويلي في تنسيق قرارات مصير الخلايا الجذعية العصبية. الكسر المتعدد هو أداة قوية لتقييم حالة الحمض النووي الريبي الترجمي على المستويين الجيني العالمي والفردي. هنا، نقدم خط أنابيب متعدد السمات في المنزل لتقييم الكفاءة التحويلية في الخلايا من قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نصف بروتوكولات إعداد تدرج السكروز وتحلل الأنسجة والطرد الفائق والتحليل القائم على الكسر للحالة الترجمية ل mRNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تطور دماغ الثدييات ، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية وتفرق لتوليد الخلايا العصبية وجليا1،2 . اضطراب هذه العملية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في بنية الدماغ ووظيفة, كما رأينا في العديد من اضطرابات النمو العصبي3,4. السلوك السليم للخلايا الجذعية العصبية يتطلب التعبير المنظم لجينات محددة5. في حين تمت دراسة التحكم اللاجيني والنسخي لهذه الجينات بشكل مكثف ، تشير النتائج الأخيرة إلى أن تنظيم الجينات على مستويات أخرى يساهم أيضا في تنسيق انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز6و7....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأشرفت لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كالغاري على جميع استخدام الحيوانات. تم شراء فئران CD1 المستخدمة في التجربة من بائع تجاري.

1. إعداد الحلول

ملاحظة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، رش منضدة العمل وجميع المعدات مع محلول إزالة التلوث RNase. يتم استخدام نصائح خالية من RNase للتجربة. يتم إعداد جميع الحلول في المياه الخالية من RNase.

  1. إعداد محلول مخزون سيكلوهيكسميد (100 ملغم/مل) في DMSO وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  2. إعداد 2.2 M حل مخزون السكروز بإضافة 75.3 غرام من السكروز إلى المياه الخالية من RNase وتتصدر حجم إلى 100 مل (لإعداد ~ 16 التدرج). يمكن الاحتفاظ بالمحلول عند -20 درجة مئوية للتخزين على المد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمظاهرة، تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (مجمعة من 8 أجنة) عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا. قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر حددت الكسور التي تحتوي على وحدة فرعية 40S، وحدة فرعية 60S، 80S أحادية والبوليسومات(الشكل 4A). تحليل الكسور من قبل لطخة الغربية للوحدات الفرعية الريبوسومية الكبيرة، Rpl10 أظهرت وجودها في وحدة فرعية 60S (كسر 3)، أحادية (كسر 4) والبوليسومات (كسور 5-12)(الشكل 4B). في المقابل، لم تكن مرتب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنميط المتعدد هو تقنية شائعة الاستخدام وقوية لتقييم الحالة الترجمية في كل من الجينات الفردية ومستويات الجينوم على نطاق14. في هذا التقرير، نقدم بروتوكولا للتنميط المتعدد باستخدام منصة تجميعها في المنزل وتطبيقها لتحليل قشرة الماوس النامية. هذه المنصة الفعالة من حيث التكلفة سهلة التجميع وتوليد تدرجات السكروز القوية القابلة للاستنساخ والتنميط المتعدد مع حساسية عالية.

ومن الجدير بالذكر أن إعداد تدرجات السكروز متسقة وجيدة النوعية أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج التنميط مت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من منحة اكتشاف NSERC (RGPIN/04246-2018 إلى G.Y.). G.Y. هو كرسي البحوث الكندية. تم تمويل S.K. من قبل زمالة Mitacs Globalink للدراسات العليا ومنحة طلاب الدراسات العليا في ACHRI.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب دقيقة خالية من الحمض النووي الريبيAxygenMCT-150-C
طبق 10 سمGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G إبرةBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 مل حقنةBD302832
نهاية حادة إبرةVWR20068-781
اللوحThorlabsMB2530 / M
بروموفينول الأزرقسيجما115-39-9
ماوسمختبر
ملقط طرف منحنيسيجما#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
برنامج الحصول على البيانات TracerDAQMeasurement Computing
محولقياس الحوسبةUSB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 ملقطسيجما#F6521
جامع الكسورBio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
مشغل المرحلة الخطيةRattmmotorCBX1605-100A
Luciferase التحكم في الحمض النووي الريبيPromegaL4561
Maxima أول حبلا (كدنا) طقم التوليفThemo FisherM1681
مصغر V-clampThorlabsVH1 / M
سلسلة صغيرة اللوحThorlabsMSB7515 / M
سلسلة مصغرة من السلسلة البصريةوظيفة ThorlabsMS2R / M
قاعدة حامل آخر القاعدة المصغرةThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
الوسائط العصبيةGibco21103-049
& Oslash; 12.7 مم من الألومنيوم آخرThorlabsTRA150 / M
ParafilmBemisPM992
PerfeCTa SYBR أخضر fastmixQuanta BioCA101414-274
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
مشبك الزاوية اليمنىThorlabsRA90 / M
الزاوية اليمنى Ø 1/2 "إلى & أوسلاش; 6 مم آخر المشبكThorlabsRA90TR / M
Rnase AWAYالمنتجات الحيوية الجزيئية7002
RNase نصائح مجانيةFrogga BioFT10 ، FT200 ، FT1000
RNase المياه الخاليةمن Wisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
قوس الزاوية اليمنى النحيفThorlabsAB90B / M
صغير V-clampThorlabsVC1 / M
الصوديوم deoxycholateSigma302-95-4
سائق محرك متدرجSongHeTB6600
السكروزBioshop57501
SW 41 Ti الدواربيكمان كولتر331362
مضخة حقنةهارفارد70-4500
مضخة حقنةهارفارد70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
أنبوب ثقببراندلBR-184
جهاز طردفائق بيكمان كولترL8-70M
أنابيب الطرد المركزي الفائقبيكمانكولتر 331372
UltraPure 1M Tris-HCl درجة الحموضة 7.5Invitrogen15567-027
مجموعة كاتب مشروع UNO فائقةElegooEL-KIT-003
شاشة الأشعة فوق البنفسجيةBio-RadEM-1 Econo
قوس عموديThorlabsVB01A / M
CD1 نهر تشارلز رقمي جهاز مركزي الجودة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles