توليد فعال وقابل للتطوير من الخلايا النجمية البطنية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Lucy  A. Crompton; Sarah F. McComish; Petros Stathakos; Oscar Cordero-Llana; Jon D. Lane; Maeve A. Caldwell

doi:10.3791/62095

Method Article

توليد فعال وقابل للتطوير من الخلايا النجمية البطنية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

Lucy A. Crompton¹ , Sarah F. McComish² , Petros Stathakos¹ , Oscar Cordero-Llana³ , Jon D. Lane^*¹ , Maeve A. Caldwell^*²

¹Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, ²Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, ³Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة للتوليد القابل للتكرار من الخلايا النجمية المزخرفة في الدماغ المتوسط البطني من hiPSCs والبروتوكولات لتوصيفها لتقييم النمط الظاهري والوظيفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مرض باركنسون ، يتسبب الخلل الوظيفي التدريجي وتنكس الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ الأوسط البطني في أعراض تغير الحياة. التنكس العصبي له أسباب متنوعة في مرض باركنسون ، بما في ذلك الآليات المستقلة غير الخلوية بوساطة الخلايا النجمية. في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، تعتبر الخلايا النجمية ضرورية لبقاء الخلايا العصبية ووظيفتها ، لأنها تحافظ على التوازن الأيضي في البيئة العصبية. تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، لتعديل الالتهاب العصبي ، والذي لوحظ منذ المراحل الأولى من مرض باركنسون ، وله تأثير مباشر على تطور أمراضه. في الأمراض ذات العنصر الالتهابي العصبي المزمن ، بما في ذلك مرض باركنسون ، تكتسب الخلايا النجمية نمطا ظاهريا ساما للأعصاب ، وبالتالي تعزز التنكس العصبي. وبالتالي ، فإن الخلايا النجمية هي هدف علاجي محتمل لإبطاء أو إيقاف المرض ، لكن هذا سيتطلب فهما أعمق لخصائصها وأدوارها في مرض باركنسون. لذلك هناك حاجة ماسة إلى نماذج دقيقة للخلايا النجمية البطنية البشرية للدراسة في المختبر.

لقد طورنا بروتوكولا لتوليد ثقافات عالية النقاء للخلايا النجمية الخاصة بالدماغ الأوسط البطني (vmAstros) من hiPSCs التي يمكن استخدامها لأبحاث مرض باركنسون. يمكن إنتاج vmAstros بشكل روتيني من خطوط hiPSC متعددة ، والتعبير عن علامات محددة للدماغ المتوسط النجمي والبطني. هذا البروتوكول قابل للتطوير ، وبالتالي فهو مناسب للتطبيقات عالية الإنتاجية ، بما في ذلك فحص الأدوية. بشكل حاسم ، تظهر hiPSC المشتقة من vmAstros خصائص مناعية نموذجية لنظرائها في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء دراسات ميكانيكية للإشارات الالتهابية العصبية في مرض باركنسون.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصيب مرض باركنسون 2٪ -3٪ من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما ، مما يجعله أكثر اضطرابات الحركة التنكسية العصبية^{انتشارا 1}. وهو ناتج عن تنكس الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ المتوسط البطني داخل المادة السوداء ، مما يؤدي إلى أعراض حركية منهكة ، فضلا عن المشكلات المعرفية والنفسية^{المتكررة 2}. يتمثل مرض باركنسون في مجاميع البروتين ، α-synuclein ، وهي سامة للخلايا العصبية وتؤدي إلى اختلالها الوظيفي وموتها¹^،²^،³. نظرا لأن الخلايا العصبية الدوبامين هي السكان المتدهورين في مرض باركنسون ، فقد كانت تاريخيا محور البحث. ومع ذلك ، فمن الواضح أن نوعا آخر من الخلايا في الدماغ ، وهو الخلايا النجمية ، يظهر أيضا تشوهات في مرض باركنسون ، ويعتقد أنه يساهم في التنكس في نماذج مرض باركنسون⁴^،⁵^،⁶^،⁷.

الخلايا النجمية هي مجموعة خلايا غير متجانسة يمكنها التحول جسديا ووظيفيا حسب الحاجة. إنها تدعم وظيفة الخلايا العصبية وصحتها عبر عدد كبير من الآليات ، بما في ذلك تعديل الإشارات العصبية ، وتشكيل الهندسة المشبكية ، والدعم الغذائي لمجموعات الخلايا العصبية عن طريق إفراز عوامل محددة⁶^،⁸^،⁹^،¹⁰. ومع ذلك ، فإن الخلايا النجمية لها أيضا دور مناعي كبير ، وهو جزء لا يتجزأ من تطور وانتشار الالتهاب العصبي¹⁰^،¹¹. لوحظ الالتهاب العصبي في أدمغة مرضى باركنسون ، وقد ثبت مؤخرا أنه يستبق ظهور أعراض باركنسون¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵ ، وبالتالي يحتل مركز الصدارة في أبحاث باركنسون.

على المستوى الخلوي ، يقال إن الخلايا النجمية تصبح متفاعلة استجابة للإصابة أو العدوى أو المرض ، كمحاولة لتسهيل الحماية العصبية⁹^،⁶^،¹⁰^،¹⁶. يصف التفاعل تحولا في النمط الظاهري للخلايا النجمية يتميز بالتغيرات في التعبير الجيني ، والإفرازات ، والتشكل ، وآليات إزالة بقايا الخلايا والمنتجات الثانوية السامة⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹⁷. يحدث هذا التحول التفاعلي استجابة للإشارات الاستقرائية من الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي والمستجيبين الأوائل للإصابة والمرض⁹. تستجيب كل من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة للإشارات الالتهابية عن طريق تخفيف وظيفتها الخاصة ويمكن أن تنقل الإشارات الالتهابية وبالتالي تؤثر بشكل مباشر على الالتهاب العصبي⁹^،¹⁰. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المزمنة لمرض باركنسون تؤدي إلى انتقال حيث تصبح الخلايا النجمية التفاعلية سامة للخلايا العصبية ، وتعزز نفسها التنكس وأمراض^{الأمراض 6}^،⁹^،¹⁰^،¹⁸^،¹⁹. بشكل ملحوظ ، ثبت مؤخرا أن منع تحول الخلايا النجمية إلى النمط الظاهري العصبي التفاعلي يمنع تطور مرض باركنسون في النماذج الحيوانية¹¹. لذلك أصبح تفاعل الخلايا النجمية في نموذج الالتهاب العصبي محورا رئيسيا لأبحاث باركنسون ، ويرتبط بالمثل بمجموعة واسعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي. تبني هذه النتائج معا صورة لمشاركة الخلايا الفلكية الكبيرة في مسببات مرض باركنسون ، مع التأكيد على الحاجة إلى نماذج بحثية دقيقة تلخص النمط الظاهري لمجموعات الخلايا النجمية البشرية المتورطة في مرض باركنسون.

في الدماغ الجنيني ، تظهر الخلايا العصبية أولا ، مع النسب الفلكي ، وهي الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، التي تظهر لاحقا في التطور⁶. سلطت الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر الضوء على عدد من مسارات الإشارات التي يبدو أنها تتحكم في فاعلية الخلايا السلفية العصبية من الخلايا العصبية إلى المشتقات الفلكية. على وجه الخصوص ، تلعب إشارات JAK / STAT و EGF و BMP أدوارا في انتشار وتمايز ونضج astroglia²⁰^،²¹. كانت هذه المسارات محور بروتوكولات المختبر لتوليد الخلايا النجمية من الخلايا متعددة القدرات ، بما في ذلك hiPSC⁶^،²²^،²³. كانت هناك العديد من الأمثلة الناجحة لتوليد الخلايا النجمية من hiPSCs⁶^،²⁴^،²⁵. ومع ذلك ، فمن الواضح أن الخلايا النجمية في الجسم الحي في الجهاز العصبي المركزي تمتلك هويات إقليمية محددة ، والتي تتعلق مباشرة بوظيفتها ، وفقا للمتطلبات المحددة لتلك الخلايا النجمية فيما يتعلق بجيرانها العصبيين المتخصصين¹⁷^،²⁴^،²⁵^،²⁶. على سبيل المثال ، فيما يتعلق على وجه التحديد بالدماغ المتوسط البطني ، فقد ثبت أن الخلايا النجمية في هذه المنطقة تعبر عن مجموعات محددة من البروتينات ، بما في ذلك مستقبلات الدوبامين التي تمكن من التواصل مع السكان المحليين للخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ^{المتوسط 26}. علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا النجمية في الدماغ المتوسط البطني خصائص إشارات فريدة²⁶. لذلك ، لدراسة دور الخلايا النجمية في الدماغ المتوسط البطني في مرض باركنسون ، نحتاج إلى نموذج في المختبر يعكس مجموعة خصائصها الفريدة.

لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتطوير بروتوكول لتوليد الخلايا النجمية البطنية في الدماغ المتوسط (vmAstros) من hiPSCs. تظهر vmAstros الناتجة خصائص نظيراتها في الجسم الحي في الدماغ الأوسط البطني مثل التعبير عن بروتينات معينة ، بالإضافة إلى وظائف المناعة. النتائج المقدمة مأخوذة من تمايز خطوط NAS2 و AST23 hiPSC ، والتي تم اشتقاقها وإهداها لنا من قبل الدكتور تيلو كوناث²⁷. تم إنشاء NAS2 من موضوع تحكم صحي بينما يشتق AST23 من مريض باركنسون يحمل ثلاث مرات في موضع ترميز α-Synuclein (SNCA). تم تمييز خطوط hiPSC هذه سابقا واستخدامها في عدد من الأوراق البحثية المنشورة ، بما في ذلك توليد أنواع مختلفة من الخلايا^{العصبية 27}^،²⁸^،²⁹^،³⁰^،³¹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ذوبان خط hiPSC البشري وصيانته وحفظه بالتبريد

لطلاء ألواح ثقافة hiPSC ، قم بتخفيف vitronectin إلى 5 ميكروغرام / مل (1: 100) في PBS عند 1 مل لكل مساحة سطح لوحة زراعة خلية 10 سم². اتركيه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة الفيترونكتين وانتقل على الفور إلى إضافة hiPSCs / الوسائط إلى لوحة الاستزراع.
ملاحظة عند إزالة الفيترونكتين من اللوحة ، من الأهمية بمكان عدم السماح لسطح المزرعة بالجفاف.
لإذابة hiPSCs ، قم بإزالة المبردات التي تحتوي على hiPSCs من النيتروجين السائل وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب المحتويات تماما.
تحضير 9 مل من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا (على سبيل المثال ، E8 أو E8 Flex) الذي يحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell). أضف 1 مل بالتنقيط إلى محتويات cryovial. ضع الوسائط المتبقية سعة 8 مل في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأضف إلى ذلك المحتويات المخففة من التبريد.
تنبيه: لا تقم بتحليل المحتويات.
جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق. استنشق السائل دون إزعاج حبيبات الخلية وإعادة تعليقه في حجم مناسب من وسط زراعة الخلية (على سبيل المثال ، E8 أو E8 Flex) يحتوي على مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell). على سبيل المثال ، 2 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار.
أضف hiPSCs المعلقة إلى الأطباق المغلفة بالفيترونكتين وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂ .
ملاحظة: يجب أن تبدأ hiPSCs في التعلق بالأواني البلاستيكية المطلية ب vitronectin في غضون 30 دقيقة - 2 ساعة بعد الذوبان.
الحفاظ على hiPSCs في وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، E8 أو E8 Flex). تغذية الخلايا يوميا عن طريق تبادل الوسائط. قم دائما بتسخين وسائط الثقافة مسبقا لمدة 30 دقيقة قبل الرضاعة.
ملاحظة في حالة استخدام E8 Flex، لا تتطلب hiPSCs تغييرات في الوسائط كل 24 ساعة ويمكن تمديد زيادات التغذية إلى 48 ساعة، إذا لزم الأمر. تنتج وسائط E8 Flex أو E8 ثقافات عالية الجودة بنفس القدر. يجب استزراع HiPSCs لمدة 14 يوما على الأقل بعد الذوبان ، وقبل بدء خطوات التمايز. يبدو أن فترات الاستزراع التي تقل عن 14 يوما تؤثر سلبا على بقاء hiPSCs خلال فترة التمايز الأولية. مرور hiPSCs عند التقاء 80٪ تقريبا (الشكل 1 أ: فاصل مرور 3-4 أيام).
قبل ساعة واحدة من البدء ، أضف مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) إلى مزرعة hiPSC.
اغسل hiPSCs مرة واحدة باستخدام PBS (بدون كالسيوم أو مغنيسيوم) وأضف 0.5 ملي مولار EDTA (مخفف من المخزون في PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم).
احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة, أو حتى تبدأ hiPSCs في الانفصال عن بعضها البعض وتأخذ مظهرا أكثر تقريبا, مع حدود كل iPSC تظهر أكثر إشراقا تحت مجهر المجال الساطع.
أضف 200 ميكرولتر من EDTA إلى منطقة مركزة من hiPSCs باستخدام ماصة. إذا انفصلوا بسهولة ، مما يجعلهم مساحة واضحة في طبقة الخلية ، فإنهم جاهزون للحصاد. إذا لم يتم فصلها بسهولة ، اتركها في EDTA وكرر ذلك بعد 1 دقيقة.
عندما تكون جاهزا للمتابعة، قم بإزالة EDTA برفق، وباستخدام ماصة، اغسل hiPSCs برفق مرتين باستخدام وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال، E8 أو E8 Flex).
ملاحظة: لتحقيق ذلك دون فصل hiPSCs ، قم بإمالة اللوحة وإضافة الوسائط المتدلية أسفل جانب لوحة الثقافة.
لحصاد hiPSCs ، استخدم 1 مل وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، E8 أو E8 Flex) يحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell). حرر الوسائط مباشرة على طبقة hiPSC ويجب أن تنفصل الخلايا. إذا لزم الأمر ، كرر العملية باستخدام وسائط أخرى سعة 1 مل.
عرض hiPSCs تحت المجهر. من الناحية المثالية ، يجب أن تظهر hiPSCs في مجموعات موحدة نسبيا كما هو موضح في الشكل 1 ب. إذا كانت مجموعات hiPSC أكبر بكثير، أو متغيرة جدا في الحجم، فاستخدم الماصة لتفكيك مجموعات hiPSC الأكبر (الشكل 1 ب).
ملاحظة: لا تفرط في triturate hiPSCs. على الرغم من أن الملحق يزيد من بقاء الخلية بشكل عام ، إلا أن التجربة الزائدة تؤثر سلبا على بقاء ثقافة HIPSC. يوصى باستخدام 1-4 تمريرات مع ماصة.
باستخدام ماصة مصلية، انقل معلق hiPSC إلى صفيحة مغلفة بفيتامين الاحتياء كما هو موضح في الخطوة 1.1. أعد ثقافة hiPSC إلى حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .
ملاحظة: حفظ hiPSCs بالتبريد عند التقاء 80٪ تقريبا.
قبل ساعة واحدة من البدء ، أضف مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) إلى مزرعة hiPSC.
افصل hiPSCs عن ألواح الاستزراع باستخدام 0.5 ملي مولار EDTA كما هو موضح في الخطوة 1.4 ، وجمع الخلايا في وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، E8 أو E8 Flex) الذي يحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell). جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق.
قم بتعليق hiPSCs المحببة في وسائط تجميد الخلايا (انظر جدول المواد). استخدم 700 ميكرولتر لكل 10 سم² منطقة استزراع ، أي ما يعادل 1 خلية مبردة لكل بئر من صفيحة 6 آبار.
نقل المبردات إلى وعاء تجميد خلوي مناسب (لمزيد من التفاصيل انظر جدول المواد).
انقل وعاء التجميد إلى فريزر -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، يمكن نقل المبردات إلى النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

2. بروتوكول التمايز الفلكي vmAstro

ملاحظة: يظهر ملخص تخطيطي لبروتوكول التمايز vmAstros في الشكل 1 أ. وترد في الجدول 1 قائمة مفصلة بالكواشف المطلوبة للبروتوكول وإعدادها.

تحريض vmNPCs
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول ليبدأ بحد أدنى ببئر 1x من صفيحة 6 آبار (10 سم²) من hiPSCs 70٪ -80٪ التقاء ، أي ما يقرب من 4-5 × 10⁴ خلايا / سم² (الشكل 1 ب) ³⁰. يجب تحسين عدد خلايا البداية وكثافتها لكل خط hiPSC لأنه يؤثر بشكل كبير على كفاءة البقاء والتمايز.
1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من hiPSCs واغسله 3x في DMEM / F12 + glutamax. استبدل الوسائط بوسائط تحريضية vmNPC سعة 2 مل (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH (C24ii) + LDN193189. انظر الجدول 1 للحصول على تفاصيل إعداد الوسائط والكواشف).
2. تغذي على أيام بديلة مع تغيير نصف الوسائط بعد 24 ساعة، وتغيير كامل للوسائط عند 48 ساعة.
  ملاحظة: بعد 3-4 أيام ، ستتطلب ثقافة vmNPC المرور. يوصى بنسبة مرور قياسية تبلغ 1: 3 أو 1: 4 - يجب تحسين ذلك لكل خط hiPSC مستخدم.
3. قبل ساعة واحدة من المرور ، أضف مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) إلى vmNPCs ، وقم بإعداد مصفوفة غشاء القاعدية 1x (على سبيل المثال ، Geltrex) بلاستيك زراعة الأنسجة المطلي (القسم 2.2 تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلاستيك ثقافة الإصدار).
4. قم بإزالة الوسائط من vmNPCs واغسلها 2x باستخدام D-PBS. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئ مسبقا (على سبيل المثال ، Accutase) لكل 10 سم² مساحة زراعة (1 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار).
5. ضعها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ثم افحص vmNPCs باستخدام مجهر تباين الطور.
  ملاحظة: ستبدأ vmNPCs في التقريب ، وستعيد عملياتها السحب ، وستظهر فجوات في طبقة الخلية. يمكن أن يستغرق ذلك من 1-3 دقائق حسب كثافة الخلية.
6. عندما تأخذ vmNPCs هذا المظهر ، أضف 100 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا (على سبيل المثال ، Accutase) إلى طبقة vmNPCs.
  ملاحظة: إذا كانت vmNPCs جاهزة للفصل ، فسيظهر ثقب في طبقة الخلية. إذا لم يحدث هذا ، فإن vmNPCs تتطلب مزيدا من الحضانة باستخدام محلول انفصال الخلية.
7. إذا انفصلت vmNPCs بسهولة ، فقم بإزالة محلول انفصال الخلية برفق واغسل vmNPCs 2x باستخدام وسائط N2B27. أضف وسائط N2B27 برفق أسفل جانب البئر أو وعاء الاستزراع ولفها برفق لغسلها ، مع التأكد من عدم انفصال vmNPCs.
  ملاحظة: يجب إكمال هذه الخطوة بسرعة لضمان عدم إعادة توصيل vmNPCs بسطح الخلية. إذا بدأت vmNPCs في الانفصال في خطوات الغسيل ، فقم بتجميعها عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق.
8. أخيرا ، قم بإزالة vmNPCs باستخدام ماصة ، عن طريق إخراج وسائط الحث vmNPC بقوة التي تحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) مباشرة إلى طبقة الخلية. يجب أن يؤدي ذلك إلى إزالة vmNPCs ، والتي يمكن بعد ذلك نقلها مباشرة إلى أوعية الزراعة المطلية بالمصفوفة الجديدة.
  ملاحظة: لا تقم بإعادة استخدام الوسائط التي تحتوي بالفعل على vmNPCs المعلقة لإزالة المزيد من الخلايا لأن هذا سيؤدي إلى الإفراط في التخلي ، مما يقلل من بقائها على قيد الحياة.
9. يستبدل في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ . يجب أن تبدأ vmNPCs في الالتصاق بالسطح المطلي بالمصفوفة بعد 20-30 دقيقة. استبدل نصف الوسائط بوسائط تحريضية vmNPC جديدة (بدون مكمل خلية) بعد 24 ساعة واستمر في جدول التغذية كما كان سابقا.
10. استمر في نظام التغذية والمرور لمدة 10 أيام.
تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء زراعة الأنسجة البلاستيكية
ملاحظة: للحفاظ على vmNPCs ، يتم استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي 1x (على سبيل المثال ، Geltrex) لطلاء الأواني البلاستيكية. للحفاظ على vmAPCs أو vmAstros ، يمكن استخدام مصفوفة الغشاء القاعدي 0.25x.
1. قم بإزالة مخزون مصفوفة الغشاء القاعدي من الفريزر -80 درجة مئوية وضعه في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل حتى يذوب.
2. خفف 1:10 مع DMEM / F12 + glutamax المثلج ، وتخزينه في -80 درجة مئوية كمخزون 10x.
3. عند طلاء الأواني البلاستيكية ، قم بتخفيف هذا المخزون 10x إلى 1x (ل vmNPCs) أو 0.25x (ل vmAPCs أو vmAstros) باستخدام DMEM / F12 + glutamax المثلج.
4. أضف على الفور إلى بلاستيك زراعة الأنسجة بمعدل 1 مل لكل 10 سم² ، على سبيل المثال ، 1 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار.
5. ضع في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. لا ينبغي إزالة محلول مصفوفة الغشاء القاعدي من الأواني البلاستيكية حتى يصبح جاهزا لإضافة الوسائط / الخلايا لضمان عدم جفاف الأواني البلاستيكية المطلية. لا تتطلب الألواح المطلية بالمصفوفة الغسيل قبل إضافة الخلايا.
توسيع vmNPCs
1. في اليوم 10 من البروتوكول ، استبدل وسائط الحث بوسائط توسيع vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + حمض الأسكوربيك. انظر الجدول 1 للحصول على تفاصيل إعداد الوسائط والكواشف).
  ملاحظة: لا تتطلب vmNPCs إضافة ميتوجينات للحث على الانتشار. يدعم BDNF و GDNF وحمض الأسكوربيك بقاء وصيانة vmNPCs³⁰.
2. تغذي على أيام بديلة مع تغيير نصف الوسائط بعد 24 ساعة، وتغيير كامل للوسائط عند 48 ساعة.
  ملاحظة: بعد 3-4 أيام ، ستتطلب ثقافة vmNPC المرور. بالنسبة للمرور ، يوصى بنسبة مرور قياسية تبلغ 1: 3 أو 1: 4 (يجب تحسين ذلك لكل خط hiPSC مستخدم. حدد النسبة التي تعطي أفضل بقاء وانتشار وتوليد من vmNPCs).
3. قبل ساعة واحدة من المرور ، أضف مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) إلى vmNPCs ، وقم بإعداد ألواح / قوارير مطلية بمصفوفة 1x مسبقا (القسم 2.2 تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلاستيك ثقافة الإصدار). قم بتسخين محلول انفصال الخلية (على سبيل المثال ، Accutase) إلى 37 درجة مئوية. وسائط توسيع vmNPC الطازجة التي تحتوي على مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell).
4. قم بإزالة الوسائط من vmNPCs واغسلها 2x باستخدام D-PBS. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا (على سبيل المثال ، Accutase) لكل 10 سم² مساحة زراعة (1 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار). ضعها في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ثم افحص vmNPCs باستخدام مجهر تباين الطور.
  ملاحظة: ستبدأ vmNPCs في التقريب ، وستعيد عملياتها السحب ، وستظهر فجوات في طبقة الخلية. يمكن أن يستغرق ذلك من 1-3 دقائق حسب كثافة الخلية.
5. عندما تأخذ vmNPCs مظهرا مستديرا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية (على سبيل المثال ، Accutase) إلى طبقة vmNPCs.
  ملاحظة: إذا كانت vmNPCs جاهزة للفصل ، فسيظهر ثقب في طبقة الخلية. إذا لم يحدث هذا ، فإن vmNPCs تتطلب مزيدا من الحضانة باستخدام محلول انفصال الخلية.
6. إذا انفصلت vmNPCs بسهولة ، فقم بإزالة محلول انفصال الخلية برفق واغسل vmNPCs 2x باستخدام وسائط N2B27. أضف وسائط N2B27 برفق أسفل جانب البئر أو وعاء الاستزراع ولفها برفق لغسلها ، مع التأكد من عدم انفصال vmNPCs.
  ملاحظة: إذا بدأت vmNPCs في الانفصال بأعداد كبيرة في خطوات الغسيل ، فقم بتجميعها عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق. يجب إكمال هذه الخطوة بسرعة لضمان عدم إعادة توصيل vmNPCs بسطح الخلية.
7. قم بإزالة vmNPCs باستخدام ماصة ، وقم بإخراج وسائط توسيع vmNPC بقوة التي تحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) مباشرة إلى طبقة الخلية. يجب أن يؤدي ذلك إلى إزالة vmNPCs ، والتي يمكن بعد ذلك نقلها مباشرة إلى الألواح / القوارير المطلية بالمصفوفة المعدة مسبقا (انظر القسم 2.2 "تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلاستيك زراعة الأنسجة").
  ملاحظة: لا تقم بإعادة استخدام الوسائط التي تحتوي بالفعل على vmNPCs المعلقة لإزالة المزيد من الخلايا لأن هذا سيؤدي إلى الإفراط في التخلي ، مما يقلل من بقائها على قيد الحياة.
8. يستبدل في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ . يجب أن تبدأ vmNPCs في الالتصاق بالسطح المطلي بالمصفوفة بعد 20-30 دقيقة. بعد 24 ساعة ، استبدل نصف وسائط الاستزراع بوسائط توسيع vmNPC جديدة (بدون مكمل خلية) واستمر في جدول التغذية السابق.
9. استمر في نظام التغذية والمرور هذا لمدة 10 أيام. يمكن توسيع vmNPCs حتى اليوم 50.
تمايز وتوسيع vmAPCs
ملاحظة: يمكن إستخدام vmNPCs بنجاح لإنشاء vmAPCs/vmAstros في أي مكان بين 30 و 50 يوما من مرحلة hiPSC الأولية (الشكل 1 أ).
1. خذ ثقافة vmNPC متجمعة واغسل vmNPCs 3x في DMEM / F12 المتقدم لإزالة آثار مكونات وسائط توسيع vmNPC. استبدل الوسائط بوسائط توسيع vmAPC (وسائط ASTRO + EGF + LIF. انظر الجدول 1 للحصول على تفاصيل إعداد الوسائط والكواشف).
2. بعد مرور 72 ساعة ، تكون ثقافة vmNPC بنسبة عالية (1: 7.5). على سبيل المثال ، بافتراض أن vmNPCs قد تم الاحتفاظ بها في بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار ، يجب الآن تمريرها إلى قارورة مطلية ب 1x مصفوفة مقاس 75 سم² (مطلية كما هو موضح في القسم 2.2 "تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلاستيك زراعة الأنسجة"). المرور باستخدام محلول انفصال الخلية ، كما هو موضح ل vmNPCs في القسم 2.3 "توسيع vmNPCs".
3. قم بإعادة تعليق vmNPCs في حجم مناسب من وسائط توسيع vmAPC (7.5-15 مل من الوسائط لكل قارورة^{75 سم 2} . تغييرات كاملة للوسائط كل 3 أيام ، أو حسب ما تقتضيه الخلايا.
  ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يشار إلى vmNPCs باسم vmAPCs ويجب تمريرها كخلايا مفردة بدلا من مجموعات الخلايا. يجب تمرير VMApcs كل 3-7 أيام أو عندما تصبح ملتقية لتجنب التقاء أكثر من اللازم. من هذه النقطة فصاعدا ، يجب استخدام التركيز المنخفض لمصفوفة 0.25x لطلاء الأواني البلاستيكية (كما هو موضح في القسم 2.2 تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء البلاستيك لزراعة الأنسجة).
4. قم بتوسيع vmAPCs حتى تصل إلى اليوم 90 (من مرحلة hiPSC) ، مع الحفاظ على vmAPCs بالتبريد في نقاط مختلفة من توسعها.
توليد vmAstros الناضجة من vmAPCs
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن زراعة vmAPCs في قوارير زراعة الأنسجة 175 سم² . يمكن توسيع هذا لتوليد أعداد كبيرة من vmAstros الناضجة.
1. عندما تصل vmAPCs إلى التقاء 80٪ ، اغسل 3x باستخدام وسائط ASTRO واستبدلها بوسائط نضج vmAstros (وسائط ASTRO + BMP4 + LIF. انظر الجدول 1 للحصول على تفاصيل إعداد الوسائط والكواشف).
2. قم بإجراء تغيير كامل للوسائط كل 3 أيام ، أو حسب ما تتطلب الخلايا ، لمدة 10 أيام.
  ملاحظة: أ) في هذه المرحلة ، يشير التوصيف إلى أن vmAstros ناضجة ، كما أكدته كيمياء الخلايا المناعية (الشكل 2G - I) وتحليل التعبير الجيني (مخطوطة قيد التحضير). ب) يجب إعادة طلاء vmAstros المستخدمة مباشرة بعد النضج على سطح مطلي بمصفوفة معد حديثا. قد يؤدي الحفاظ على vmAPCs أو vmAstros على نفس سطح الثقافة لأكثر من 14 يوما إلى ثقافات دون المستوى الأمثل ، حيث تبدأ الخلايا في الانكماش في الحجم وحتى الانفصال. ج) بالنسبة للتطبيقات التي تفحص تعديل الالتهاب العصبي ، تتم إزالة BMP و LIF قبل 72 ساعة من التحفيز الالتهابي العصبي. هذا لتجنب أي تفاعل محتمل بين إشارات BMP / LIF والإشارات الالتهابية العصبية المستحثة.
3. يمكن الآن إعادة طلاء vmAstros للمقايسات التجريبية ، على سبيل المثال ، على أغطية لكيمياء الخلايا المناعية أو المحفوظة بالتبريد للتطبيقات المستقبلية (الأقسام 3 ، 4).
  ملاحظة: لا ينبغي أن يكون التمرير ضروريا في هذه المرحلة من البروتوكول لأن الانتشار يجب أن يحدث فقط بمعدل منخفض جدا. تحافظ vmAPCs المطلية بكثافة كبيرة في هذه المرحلة على مستويات أعلى من الانتشار. إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بتمرير الخلايا وتقسيمها لتحقيق كثافة كما هو موضح في الشكل 1F.

3. الحفظ بالتبريد ل vmNPCs و vmAPCs و vmAstros

ملاحظة: حفظ التبريد vmNPCs / vmAPCs / vmAstros عند التقاء كامل.

قبل ساعة واحدة من البدء ، أضف مكمل خلوي 1x (على سبيل المثال ، Revitacell) إلى المزرعة. املأ وعاء التخزين بالتبريد (انظر جدول المواد) بالأيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة.
افصل الخلايا عن ألواح الثقافة باستخدام محلول انفصال الخلية كما هو موضح سابقا ، وجمع الخلايا في وسائط مناسبة (وسائط N2B27 أو ASTRO) تحتوي على مكمل خلية 1x (على سبيل المثال ، Revitacell). جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق.
أعد تعليق أحجام vmNPCs/vmAPCs/vmAstros المحببة في وسائط تجميد الخلايا (انظر جدول المواد) على النحو التالي (الخطوات 3.3.1. - 3.3.3.)
1. بالنسبة إلى vmNPCs: استخدم 700 ميكرولتر لكل 10 سم² منطقة استزراع ، في 1 cryovial.
2. بالنسبة إلى vmAPCs: استخدم 700 ميكرولتر لكل 60 سم² منطقة استزراع ، في 1 cryovial (حوالي 1/3 من قارورة ثقافة T175).
3. بالنسبة إلى vmAstros: قم بإعادة التعليق في 2 مل من الوسائط واحسب عدد vmAstros. إعادة الطرد المركزي وإعادة التعليق في وسائط تجميد الخلايا (انظر جدول المواد) برقم لكل تبريد مناسب للتطبيقات المستقبلية. بافتراض فقدان خلية تقريبي بنسبة 15٪ بسبب التجميد والذوبان ، يتم حساب vmAstros المذابة حديثا وطلاءها بعدد خلية زائد بنسبة 15٪ للتعويض عن موت الخلايا في عملية التجميد والذوبان. هذا ، إذن ، يعادل 74,750 vmAstros لكل سم². يتم الحفاظ على vmAstros الذائبة لمدة 72 ساعة في وسائط ASTRO قبل الفحص.
انقل المبردات إلى وعاء تجميد خلوي (لمزيد من التفاصيل انظر جدول المواد) وانقل وعاء التجميد إلى فريزر -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، يمكن نقل المبردات إلى النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) للتخزين طويل الأجل.

4. توصيف النمط الظاهري vmAstro

الكيمياء المناعية
1. ضع أغطية زجاجية مقاس 100-200 مقاس 13 مم في أطباق بتري زجاجية على طبقة من ورق الترشيح وقم بتعقيمها في الأوتوكلاف الجاف.
2. انقل الغطاء إلى آبار من ألواح 4 أو 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. أضف محلول مصفوفة 1x (على سبيل المثال ، Geltrex) على الغطاء كقطرات 50 ميكرولتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. قم بتمرير أو إذابة vmAstros ، وإعادة التعليق في وسائط ASTRO وإجراء العد. لوحة vmAstros في 25-100,000 خلية لكل غطاء في قطرة 50 ميكرولتر.
4. قم بإزالة المصفوفة من قسيمة الغطاء وأضف vmAstros على الفور في قطرة من الوسائط. ضعها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم أغمر الآبار بوسائط ASTRO إضافية سعة 250 ميكرولتر.
  ملاحظة: في حالة إجراء الكيمياء الخلوية المناعية للتحقق ببساطة من وجود الخلايا النجمية وتعبير علامة الدماغ المتوسط ، يمكن إصلاح vmAstros بعد 24 ساعة من الطلاء.
5. تحضير محلول فورمالديهايد 4٪ عن طريق تخفيف محلول الفورمالديهايد بنسبة 36٪ 1: 9 في D-PBS.
6. اغسل vmAstros 1x باستخدام D-PBS. أضف 4٪ فورمالديهايد على الفور إلى الآبار واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
7. قم بإزالة الفورمالديهايد واستبدله ب D-PBS. إما تخزينها في 4 درجات مئوية أو الانتقال إلى كيمياء الخلايا المناعية.
8. اغسل أغطية الآبار 3x باستخدام D-PBS. تخلل وكتلة في مصل الماعز بنسبة 10٪ ، و 1٪ BSA في 0.1٪ PBTx (D-PBS + 1: 1000 Triton-X) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
9. أضف الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) في مصل الماعز بنسبة 1٪ ، و 0.1٪ BSA في 0.1٪ PBTx (D-PBS + 1: 1000 Triton-X) واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على هزاز.
10. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل الأغطية 3 مرات باستخدام D-PBS.
11. أضف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (جدول المواد) في مصل الماعز بنسبة 1٪ ، و 0.1٪ BSA في 0.1٪ PBTx ، واحتضن لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وحمايته من الضوء على الهزاز. اغسل أغطية 3x باستخدام D-PBS.
12. أضف محلول DAPI (0.1 ميكروغرام / مل DAPI في D-PBS) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل أغطية 3x باستخدام D-PBS.
13. لتركيب الغطاء ، أضف قطرة 5 ميكرولتر من وسائط تركيب Mowiol / DABCO [12٪ Mowiol (وزن / حجم) ، 12٪ جلسرين (وزن / حجم) مذاب طوال الليل مع التحريك في 0.2 M Tris (درجة الحموضة 8.5) مع 25 مجم / مل 1،4-diazabicylo [2.2.2] أوكتان (DABCO)] إلى شريحة مجهر زجاجي. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الغطاء بعناية من البئر ؛ ربت على حافة الغطاء على المنديل لإزالة السائل الزائد وضع جانب vmAstros لأسفل على قطرة Mowiol / DABCO.
14. كرر ذلك مع كل غطاء واتركه حتى يجف لمدة 8 ساعات قبل الفحص المجهري.
قياس ELISA لإفراز vmAstros ل IL-6 استجابة لعلاج السيتوكين
ملاحظة: بعد النضج لمدة 10 أيام باستخدام BMP4 و LIF ، يجب تمرير vmAstros وحسابها وطلاءها على الأواني البلاستيكية لزراعة الأنسجة المطلية بالمصفوفة 0.25x (كما هو مفصل في القسم 2-2تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء زراعة الأنسجة البلاستيكية) بكثافة 65,000 vmAstros لكل سم² في وسائط ASTRO. يجب إزالة BMP4 و LIF من vmAstros قبل 72 ساعة من علاج السيتوكين لأن الإشارات النشطة من هذه العوامل يمكن أن تتداخل مع فعالية علاج السيتوكين. بدلا من ذلك ، يمكن إذابة vmAstros المحفوظة بالتبريد واستخدامها في المقايسات.
1. في يوم الفحص ، اغسل vmAstros 3x برفق في وسائط غير أكسدة واختزال (DMEM / F-12 + glutamax + N2).
2. استخدم ضابطا غير معالج ومعالجا جيدا بالسيتوكين للمقارنة. أضف السيتوكين المختار بتركيز محسن. تم إنشاء البيانات الواردة في الشكل 2J - L باستخدام IL-1α عند 3 نانوغرام / مل⁹ في وسائط غير الأكسدة والاختزال عند 1 مل لكل 10 سم² منطقة زراعة الخلايا.
3. استبدل vmAstros في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، اجمع وسائط الثقافة في أنابيب ميكروفوج معقمة.
4. إذا لم يتم تنفيذ ELISA على الفور ، فقم بتقطيع عينات وسائط التجميد عن طريق غمر أنابيب الطرد الدقيق في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي.
  ملاحظة: تم تحسين البروتوكول التالي خصيصا للاستخدام مع مجموعة IL-6 ELISA المفصلة في جدول المواد. يجب إعادة تشكيل الأجسام المضادة والمعايير التي يتم تسليمها كمسحوق مجفف بالتجميد في مجموعة ELISA جديدة قبل الاستخدام الأول ، ونقلها للاستخدام في المستقبل. توضح ورقة البيانات المقدمة مع المجموعة تفاصيل الكواشف والأحجام المطلوبة لإعادة التكوين. يجب إعادة تكوين الجسم المضاد الملتقط في PBS (بدون بروتين ناقل).
5. قم بإجراء ELISA بتنسيق لوحة 96 بئرا واحسب أحجام الكواشف وفقا للآبار المستخدمة. في يوم ELISA ، قم بإعداد الجسم المضاد عن طريق تخفيف المخزون 1: 120 في PBS. قم بتغطية اللوحة عن طريق تحميل 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للالتقاط لكل بئر. قم بتغطية الطبق بشريط لاصق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
6. في اليوم التالي ، اغسل الطبق 3x باستخدام D-PBS-Tween (D-PBS مع 0.05٪ Tween-20) ، 100 ميكرولتر لكل بئر. جفف.
7. قم بسد اللوحة عن طريق تحميل 150 ميكرولتر D-PBS / 1٪ BSA لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل. اغسل الطبق كما هو موضح.
8. قم بإذابة العينات على الجليد (قد يستغرق ذلك 1-2 ساعة). خفف العينات 1: 5 عن طريق تحميل عينة 10 ميكرولتر و 40 ميكرولتر D-PBS / 1٪ BSA. دوامة كل عينة قبل التحميل.
  ملاحظة: من الضروري تخفيف العينات عند إجراء IL-6 ELISA ، ويجب تحسين التخفيفات.
9. قم بإعداد المعيار الأعلى (1,000 ميكروغرام / مل) عن طريق تخفيف المخزون 1: 180 في D-PBS / 1٪ BSA. قم بإعداد 7 معايير من خلال إجراء تخفيف تسلسلي للمعايير العليا. دوامة بين كل تخفيف.
10. أضف 50 ميكرولتر من المعايير / العينات إلى الآبار. استخدم D-PBS / 1٪ BSA كفارغ. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على شاكر مداري لخلط العينات المخففة بشكل صحيح. اغسل الطبق كما هو موضح.
11. تحضير الجسم المضاد للكشف عن طريق تخفيف المخزون 1:60 في D-PBS / 1٪ BSA. قم بتحميل 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف لكل بئر. غطي الطبق واحتضنه في RT لمدة 2 ساعة. اغسل الطبق كما هو موضح.
12. تحضير الستربتافيدين المترافق مع بيروكسيداز الفجل الحار (Strep-HRP) عن طريق تخفيف المخزون 1:40 في D-PBS / 1٪ BSA. قم بتحميل 50 ميكرولتر من Strep-HRP لكل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. اغسل الطبق كما هو موضح.
13. ابدأ تفاعل اللون عن طريق تحميل محلول ركيزة TMB سعة 50 ميكرولتر لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة (أو حتى تتطور المعايير والعينات إلى اللون الأزرق).
  ملاحظة: يتم تخزين TMB عند 4 درجات مئوية ولكن يجب استخدامه في درجة حرارة الغرفة.
14. أوقف التفاعل بإضافة محلول توقف 25 ميكرولتر (1 م H₂SO₄) لكل بئر ولاحظ تغير اللون من الأزرق إلى الأصفر.
15. اقرأ اللوحة عند امتصاص 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. اضبط تصحيح الطول الموجي على امتصاص 540 نانومتر لزيادة الدقة. احسب تركيزات البروتين في العينات من المنحنى القياسي المنتج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منهجية التمايز والتقدم
نقدم هنا تفاصيل كل من الطرق المستخدمة لتوليد vmAstros والبروتوكولات المستخدمة لتوصيفها الظاهري اللاحق. تتكون طريقة توليد vmAstros من عدة مراحل تمايز متميزة ، والتي يمكن مراقبتها عن طريق الفحص المجهري وتحديد الخصائص المورفولوجية المميزة (الشكل 1A-F). تتعرض ثقافة hiPSC الخالية من المغذيات (الشكل 1 ب) لعوامل محددة للحث على تمايزها نحو سلالة عصبية (LDN193189 ، SB431542) ، وتحديدا الدماغ الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الطريقة لتوليد vmAstros من hiPSCs عالية الكفاءة ، حيث تولد ثقافات نقية من vmAstros ، ويمكن تكرارها لتوليد vmAstros من خطوط hiPSC المختلفة. تم تطوير هذا البروتوكول حول تلخيص الأحداث التنموية المطلوبة في الجنين لنمط الدماغ المتوسط النامي بشكل صحيح وتوليد الخلايا النجمية ويتألف من ثلاث مراحل محددة: 1) تحريض الدماغ المتوسط البطني العصبي لتوليد vmNPCs ، 2) توليد وتوسيع vmAPCs ، وأخيرا 3) نضوج vmAstros.

في عملنا السابق المنشور ، سلطنا الضوء على أهمية تحسين تركيز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة مشروع باركنسون في المملكة المتحدة (G-1402) وطلاب. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمرفق وولفسون للتصوير الحيوي لدعمهم ومساعدتهم في هذا العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي > كواشف < / قوي >
0.2 م تريس كلو (درجة الحموضة 8.5)	ن / أ	غير / أ	يتكون من قاعدة تريس وبالإضافة إلى حمض الهيدروكلوريك
0.5 متر EDTA ، درجة الحموضة 8	ThermoFisher	؛ 15575-020	1: 1000 في D-PBS إلى 0.5 mM النهائي ؛
1،4-diazabicylo [2.2.2] أوكتان (DABCO)	سيجما	D27802-	25 مجم / مل في محلول تركيب Mowiol
13 مم أغطية	VWR	631-0149
2-Mercaptoethanol (50 ملم)	ThermoFisher	31350010
Accutase	ThermoFisher	13151014
Advanced DMEM / F12	ThermoFisher	12634010	يحتوي على 1x NEAA لكننا نضيف إلى التركيز النهائي 2x (0.2 ملم)
حمض الأسكوربيك	Sigma	A5960	200 ملي متر مخزون ، 1: 1000 إلى 200 ميكرو ؛ M النهائي
B27 الملحق	ThermoFisher	17504-044	50x مخزون
BSA	Sigma	5470
وسائط تجميد الخلايا	Sigma	C2874	Cryostor CS10
وعاء تجميد الخلايا	Nalgene	5100-0001
CHIR99021	Axon Medchem	1386	0.8 mM مخزون ، 1: 1000 تخفيف إلى 0.8 & micro ؛ M final
Cryovials	سيجما	CLS430487
DAPI	سيجما	D9542	1 مجم / مل ، 1: 10،000 إلى 100 نانوغرام / مل نهائي (في PBS) DMEM
/ F12 + Glutamax	ThermoFisher	10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS بدون Mg أو Ca) ThermoFisher		<قوي >14190144< / قوي >	< قوي > درجة الحموضة 7.2< / قوي >
E8 طقم متوسط فليكس	ThermoFisher	A2858501
الفورمالديهايد (محلول 36٪) سيجما		47608
Geltrex	ThermoFisher	A1413302	1:100 أو 1:400 في مخزون DMEM / F12
Glutamax	ThermoFisher	35050038	2 ملي متر (1: 200 في N2B27 ، 1: 100 في وسائط ASTRO إلى 20 & micro ؛ M final)
الجلسرين	سيجما	G5516
BDNF البشري	Peprotech	450-02	20 & micro; جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 20 نانوغرام / مل نهائي
بشري BMP4	Peprotech	120-05	20 & micro ؛ جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 20 نانوغرام / مل نهائي
إنساني EGF	Peprotech	AF-100-15	20 & مايكرو ؛ جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 20 نانوغرام / مل نهائي
GDNF البشري	Peprotech	450-10	20 & جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 20 نانوغرام / مل
محلول الأنسولين البشري	النهائي سيجما ؛	I9278	10 ملغ/مل مخزون, 1:2000 إلى 5 & جم / مل نهائي
الإنسان LIF	Peprotech	300-05	20 & micro ؛ جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 20 نانوغرام / مل نهائي
IL-6 ELISA kit	Biotechne	DY206
Isopropanol	Sigma	؛ I9516-4L	لملء وعاء التخزين بالتبريد Mr Frosty
LDN193189	Sigma	SML0559	100 & micro ؛ مخزون M ، 1: 10،000 تخفيف إلى 10 نانومتر نهائي
Mowiol 40-88	Sigma	324590
N2	Supplement ThermoFisher	17502048	100x
مخزون NEAA	ThermoFisher	11140035	10 ملي متر مخزون ، 1: 100 إلى 0.1 ملي متر نهائي ؛
الوسائط العصبية	القاعدية ThermoFisher	21103049
مختبرات ناقلات مصل الماعز العادي		S-1000-20
Revitacell	ThermoFisher	A2644501	مخزون 100x ، 1: 100 إلى 1x نهائي
SB431542	Tocris	1614	10 ملي مخزون ، 1: 1000 تخفيف إلى 10 & micro ؛ M النهائي
SHH-C24ii	Biotechne	1845-SH-025	200 & micro; جم / مل مخزون ، 1: 1000 إلى 200 نانوغرام / مل نهائي
Tris-HCl	Sigma ؛	PHG0002
Triton-X	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P7949
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	1:50 في D-PBS
antibodies لكيمياء الخلايا المناعية < / قوي >	< قوي > شركة < / قوي >	< قوي > رقم الكتالوج < / قوي >	< قوي > الأنواع المضيفة < / قوي >
جسم مضاد ضد S100b	Sigma	SAB4200671	Mouse ؛ 1: 200
جسم مضاد ضد FOXA2	SCBT	NB600501	Mouse ؛ 1:50
جسم مضاد ضد LMX1A	ProSci	7087	Rabbit ؛ 1: 300
الجسم المضاد ضد LMX1A	Millipore	AB10533	Rabbit ؛ 1: 2000
الجسم المضاد ضد LMX1B	Proteintech	18278-1-AP	Rabbit ؛ 1: 300
جسم مضاد ضد GLAST	Proteintech	20785-1-AP	Rabbit ؛ 1: 300
جسم مضاد ضد GFAP	Dako	Z0334	Rabbit ؛ 1: 400
جسم مضاد ضد CD49f	Proteintech	27189-1-AP	Rabbit ؛ 1: 100
جسم مضاد ضد MSI1	Abcam	ab52865	Rabbit ؛ 1: 400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ؛	ThermoFisher	A32731	الماعز ؛ 1:500
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر	ThermoFisher	A32723	الماعز ؛ 1:500
Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للأرانب	ThermoFisher	A11036	الماعز ؛ 1:500
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر	ThermoFisher	A11031	الماعز ؛ 1:500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

توليد فعال وقابل للتطوير من الخلايا النجمية البطنية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles