يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الزراعة المشتركة الخالية من التلامس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية الفطرية أثناء عدوى فيروس الجهاز التنفسي

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62115

⸱

فبراير 28, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يفصل هذا البروتوكول التحقيق في التفاعلات المبكرة بين الخلايا الظهارية الأنفية المصابة بالفيروس وتنشيط الخلايا الفطرية. يمكن تمييز المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية بناء على تنشيطها استجابة للعدوى الفيروسية. ويمكن بعد ذلك إجراء مزيد من التحقيقات لتحديد آثارها على الاستجابات المبكرة المضادة للفيروسات.

الملخص

لا تزال التفاعلات المبكرة بين الطبقة الظهارية الأنفية والخلايا المناعية الفطرية أثناء الالتهابات الفيروسية منطقة غير مستكشفة. زادت أهمية إشارات المناعة الفطرية في الالتهابات الفيروسية بشكل كبير حيث أظهر المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الذين يظهرون تنشيطا فطريا عاليا للخلايا التائية نتيجة أفضل للمرض. وبالتالي ، فإن تشريح هذه التفاعلات المناعية الفطرية المبكرة يسمح بتوضيح العمليات التي تحكمها وقد يسهل تطوير أهداف واستراتيجيات علاجية محتملة لتثبيط أو حتى منع التقدم المبكر للعدوى الفيروسية. يفصل هذا البروتوكول نموذجا متعدد الاستخدامات يمكن استخدامه لدراسة الأحاديث المتقاطعة المبكرة والتفاعلات وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية من العوامل التي تفرزها الخلايا الظهارية المصابة بمجرى الهواء الفيروسي. باستخدام فيروس الأنفلونزا H3N2 (A/Aichi/2/1968) كنموذج فيروسي تمثيلي، تم تحليل التنشيط الفطري للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المستزرع (PBMCs) باستخدام قياس التدفق الخلوي للتحقيق في المجموعات الفرعية للخلايا التي يتم تنشيطها بواسطة العوامل القابلة للذوبان التي يتم إطلاقها من الظهارة استجابة للعدوى الفيروسية. وتظهر النتائج استراتيجية البوابات للتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا وتكشف عن الاختلافات الواضحة بين المجموعات المنشطة من PBMCs وحديثها المتبادل مع الظهارة الضابطة والمصابة. يمكن بعد ذلك تحليل المجموعات الفرعية المنشطة لتحديد وظائفها وكذلك التغيرات الجزيئية الخاصة بالخلايا. قد تكشف النتائج المستخلصة من مثل هذا التحقيق المتبادل عن عوامل مهمة لتنشيط مجموعات الخلايا الفطرية الحيوية ، والتي تكون مفيدة في السيطرة على تطور العدوى الفيروسية وقمعها. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه العوامل عالميا على الأمراض الفيروسية المختلفة، وخاصة على الفيروسات الناشئة حديثا، لتخفيف تأثير هذه الفيروسات عندما تنتشر لأول مرة في مجموعات بشرية ساذجة.

المقدمة

ربما تكون فيروسات الجهاز التنفسي من بين مسببات الأمراض الأكثر انتشارا التي تسبب الرعاية الصحية الشديدة والعبء الاقتصادي. وتشكل الفيروسات، بدءا من الفاشيات العالمية الدورية للسلالات الوبائية الناشئة (مثل H1N1 وH5N1 وH3N2 وMERS وCOVID-19) إلى السلالات الموسمية للإنفلونزا كل عام، تشكل الفيروسات تهديدا مستمرا للصحة العمومية. وعلى الرغم من أن اللقاحات تشكل الجزء الأكبر من الاستجابة لهذه التحديات العالمية في مجال الصحة العامة، فمن الواقعي أن نلاحظ أن هذه التدابير المضادة تستجيب فقطبنسبة 1,2. وعلاوة على ذلك، فإن التأخير بين ظهور سلالة معدية جديدة والتطوير الناجح للقاحها أمر لا مفر منه3، مما يؤدي إلى فترة تكون فيها التدابير المتاحة للحد من انتشار الفيروس محدودة للغاية.

ومما يزيد من تأكيد هذه التأخيرات التكاليف التي تلحق بالمجتمع اقتصاديا واجتماعيا. الإنفلونزا الموسمية وحدها مسؤولة عن ما يقرب من 8 مليارات دولار من التكاليف غير المباشرة ، و 3.2 مليار دولار من التكاليف الطبية ، و 36.3 ألف حالة وفاة في الولايات المتحدة الأمريكية سنويا4. هذا قبل النظر في تكاليف البحث اللازمة لتمويل تطوير اللقاحات. وللفاشيات الوبائية آثار أشد حدة على المجتمع، يضاعفها تزايد معدل العولمة كل عام، كما يتضح من الاضطرابات العالمية الناجمة عن ظهور الفيروس التاجي 2 (SARS-CoV-2) (SARS-CoV-2) وانتشاره السريع.

أظهرت الدراسات الحديثة أن المرضى المصابين الذين لديهم عدد أكبر من الخلايا التائية الفطرية المنشطة يميلون إلى الحصول على نتيجة أفضل للمرض 8,9,10. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف مجموعة الخلايا التائية الفطرية إلى مجموعات فرعية متعددة: الخلايا التائية الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي (MAIT) ، والخلايا التائية Vδ1 γδ ، والخلايا التائية Vδ2 γδ ، والخلايا التائية القاتلة الطبيعية (NKT). تظهر هذه المجموعات الفرعية من الخلايا التائية الفطرية أيضا عدم تجانس داخل سكانها ، مما يزيد من تعقيد التفاعلات بين مجموعات الخلايا المشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية11. وبالتالي ، فإن الآلية التي تنشط هذه الخلايا التائية الفطرية ومعرفة المجموعات الفرعية المحددة من الخلايا التائية الفطرية قد توفر وسيلة مختلفة للبحث للحد من الآثار المعدية لهذه الفيروسات على المضيف البشري ، خاصة خلال فترة تطوير اللقاح.

تنتج الخلايا الظهارية المصابة بالإنفلونزا عوامل تنشط الخلايا التائية الفطرية بسرعة12،13،14. وبناء على هذه النتيجة، يهدف نموذج الاستزراع المشترك للواجهة السائلة الهوائية (ALI) الخالي من التلامس إلى محاكاة التفاعلات الكيميائية المبكرة (التي تتوسطها العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها الطبقة الظهارية المصابة) بين الطبقة الظهارية الأنفية المصابة و PBMCs أثناء العدوى المبكرة. إن الفصل المادي بين الطبقة الظهارية الأنفية (المستزرعة على إدخالات الغشاء) و PBMCs (في الغرفة الموجودة تحتها) والسلامة الظهارية يمنع العدوى المباشرة ل PBMCs بواسطة الفيروس ، مما يسمح بإجراء دراسة مفصلة لآثار العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة على PBMCs. وبالتالي يمكن إجراء مزيد من التحقيق في العوامل المحددة لإمكاناتها العلاجية في تحفيز مجموعة الخلايا التائية الفطرية المناسبة التي قد تحمي من عدوى الأنفلونزا. لذلك قامت هذه الورقة بتفصيل طرق إنشاء ثقافة مشتركة لدراسة تنشيط الخلايا التائية الفطرية من العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الظهارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: ارجع إلى الجدول 1 للاطلاع على وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: تم العثور على hNECS المزروعة على 12 بئرا ترانسويل تنمو لتصبح سماكة أكثر مثالية للعوامل القابلة للذوبان للوصول إلى الغرفة القاعدية بسهولة عند الإصابة بفيروس الأنفلونزا. ومن ثم يوصى باستخدام 12 بئرا من الترانسويل للثقافة المشتركة.

1. إنشاء طبقة التغذية 3T3

  1. الإنشاء من المخزونات المجمدة
    1. إذابة بالتبريد من الخلايا الليفية NIH / 3T3 من المخزونات المجمدة. أضف محتويات التجميد إلى 2 مل من الوسائط الأساسية الدنيا الكاملة من Dulbecco (DMEM) وأعد تعليق الخلايا.
    2. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ودرجة حرارة / ضغط الغرفة (rtp) ، وقم بإزالة supernatant. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
    3. عد الخلايا باستخدام تلطيخ أزرق تريبان. أضف 10 ميكرولتر من التربان الأزرق إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه. اخلطي جيدا ، وأضيفي 10 ميكرولتر من التعليق إلى مقياس الدم لحساب الخلايا.
    4. خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم2 في طبق استزراع مناسب (على سبيل المثال ، قارورة T75). احتضان قارورة الثقافة الناتجة لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
  2. علاج ميتوميسين سي
    1. في 3 أيام ، تأكد من أن الالتقاء هو 60٪ -80٪ ، وإزالة الوسط ، وغسل الخلايا مع 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: من المهم ألا تصل طبقة التغذية 3T3 إلى الالتقاء الكامل ؛ خلاف ذلك ، فإن علاج الميتومايسين C لن يكون فعالا.
    2. أضف DMEM الكامل المكمل ب mitomycin C إلى القارورة ، واحتضنه لمدة 3.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 . قم بإزالة الوسط المحتوي على الميتوميسين C ، واغسل الخلايا 2x باستخدام 1x PBS.
  3. بذر خلايا 3T3 في لوحات 6 آبار
    1. أضف 3 مل من 1x trypsin-EDTA إلى القارورة لمدة 3-5 دقائق لفصل الخلايا. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي أنبوب 15 مل لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، rtp ؛ تخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
    2. عد الخلايا باستخدام تلطيخ أزرق تريبان. زرع الخلايا في صفيحة من 6 آبار في 7.5 × 10 5-2.5 × 106 خلايا / بئر. احتضن اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2.
      ملاحظة: تعتبر طبقة التغذية 3T3 جاهزة إذا كانت الخلايا سليمة. عند هذه النقطة، زرع الخلايا الجذعية/السلفية الظهارية الأنفية البشرية (hNESPCs) في طبقة التغذية للتوسع.
    3. أضف DMEM الكامل إلى القارورة واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها لخلايا 3T3 للتعافي من علاج الميتومايسين C.

2. إنشاء مزرعة الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (hNEC)

ملاحظة: يجب الحصول على عينات سريرية من المرضى الذين يخلون من أعراض عدوى الجهاز التنفسي العلوي.

  1. معالجة أنسجة الأنف في تعليق أحادي الخلية
    1. اغسل أنسجة الأنف في 1x Dulbecco's PBS (dPBS) (PBS بدون Mg 2+ و Ca2+) التي تحتوي على 100 ميكرولتر / مل من خليط مضاد حيوي مضاد للفطريات. قطع الأنسجة إلى شظايا صغيرة ، وعالج العينة في 10 ملغ / مل من البروتياز المحايد بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع الاهتزاز.
    2. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم ، وإزالة السوبرنات بعد الطرد المركزي. احتضن الكريات في 1-2 مل من 1x trypsin-EDTA (37 درجة مئوية ، 15 دقيقة) ، وقم بإخمادها عن طريق إضافة حجم من مصل البقر الجنيني يساوي 10٪ من الحجم في الأنبوب.
    3. قم بفصل الأنسجة المهضومة ميكانيكيا إلى مجاميع أحادية الخلية عن طريق السحب ، ثم مرر التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. أعد تعليق الخلايا في DMEM كامل.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يكون تعليق الخلية عبارة عن مزيج من الخلايا المتمايزة نهائيا والخلايا الجذعية التي يشار إليها باسم الخلايا الجذعية/السلفية الظهارية الأنفية البشرية (hNESPCs). الهدف من الخطوات اللاحقة هو اختيار وإثراء سكان hNESPC من خليط من مجموعات الخلايا المختلفة.
  2. بذر تعليق أحادي الخلية على طبقة التغذية 3T3 لاختيار hNESPCs
    1. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من الخطوة 2.1.3 (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وقم بإزالة السوبرنات. أعد تعليق الخلايا في 3-5 مل من 3 متوسطة.
      ملاحظة: تمت صياغة Medium 3 لتعزيز النمو الانتقائي ل hNESPCs.
    2. عد الخلايا عن طريق تلطيخ أزرق تريبان. البذور 1 × 10 6 خلايا في 2 مل متوسطة 3 لكل بئر على لوحة 6 بئر تحتوي على طبقة تغذية 3T3 محضرة بعد إزالة الوسائط في لوحة البئر6 . احتضان الزراعة المشتركة الناتجة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
      ملاحظة: بعد البذر ، احرص على عدم تحريك اللوحة لأنها ستؤثر على مرفق hNESPCs.
    3. تغيير الوسط 3 (2 مل) كل 2-4 أيام عن طريق إزالة الوسط القديم بالكامل واستبداله بوسط طازج 3.
      ملاحظة: يتم تغيير الوسط لتجديد العناصر الغذائية ومنع الظروف الحمضية المفرطة من التأثير سلبا على نمو hNESPCs. يعتمد الفاصل الزمني بين كل تغيير في الوسط على مدى حمضية (صفراء) الوسط. يجب تقصير الفواصل الزمنية إذا تحول الوسط إلى حمضي بسرعة.
    4. بعد 7-10 أيام ، لاحظ أن hNESPCs في التقاء مناسب لنقلها إلى إدخالات الغشاء. انظر الشكل 1 للاطلاع على المورفولوجيا التمثيلية ل hNESPCs في 3 نقاط زمنية مختلفة (2 أيام و 5 أيام و 10 أيام).
  3. نقل hNESPCs إلى إدخالات الغشاء
    ملاحظة: بسبب علاج الميتومايسين C ، ستتحلل طبقة التغذية 3T3 ببطء خلال فترة توسع hNESPC. سيؤدي ذلك إلى ضعف الالتصاق بسطح البئر ، مما يسمح بإزاحتها عن طريق التنظيف باستخدام ماصة ، تاركة وراءها فقط hNESPCs الصحية.
    1. قم بإزالة الوسط ، وأضف 500 ميكرولتر من 1x dPBS إلى كل بئر. اغسل الخلايا 3x باستخدام ماصة دقيقة لإزاحة خلايا 3T3 ، وتخلص من 1x dPBS. لاحظ تحت المجهر أن hNESPCs المستديرة تبقى بينما يتم إزاحة طبقة التغذية 3T3 على شكل مغزل.
    2. أضف 500 ميكرولتر من كاشف فصل الخلايا لكل بئر ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 5-10 دقائق ، أو حتى تنفصل hNESPCs عن سطح البئر.
    3. اجمع تعليق hNESPC ، جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وقم بإزالة السوبرناتان.
    4. أعد تعليق الكريات في الوسط 3. عد الخلايا عن طريق تلطيخ أزرق تريبان. البذور 3 × 104 خلايا في 150 ميكرولتر من المتوسط 3 لكل غشاء إدراج (لوحة 24 بئر) أو 1 × 105 خلايا في 300 ميكرولتر من المتوسط 3 لكل غشاء إدراج (لوحة 12 بئر) (الشكل 2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 .
    5. تغيير الوسط (المتوسط 3) من الغرف القمية والقاعدية كل 2 أيام. تنقل طرف ماصة بين الأذرع الداعمة لإدراج الغشاء للوصول إلى الغرفة القاعدية ، وإزالة الوسط القديم ، ثم إعادة إدخال الوسط الطازج بنفس الطريقة. على الرغم من أن الغرفة القمية يمكن الوصول إليها بسهولة ، احرص على عدم إزعاج طبقة hNESPC المتنامية.
      ملاحظة: لا تزعج الوسط في الغرفة القمية لمدة 2 أيام على الأقل بعد البذر لأن الخلايا تحتاج إلى وقت للالتصاق بالغشاء.
  4. تمايز hNESPCs إلى hNECs
    1. عندما تصل hNESPCs إلى التقاء بنسبة 100٪ (حوالي 3-7 أيام من البذر على إدراج الغشاء) ، ابدأ ثقافة ALI. قم بتغيير الوسط القاعدي إلى وسط التمايز ، وقم بإزالة الوسط من الغرفة القمي. أضف فقط الوسط إلى الغرفة القاعدية دون إضافته إلى الغرفة القمية عند تغيير الوسط كل 2-3 أيام ، كما هو موضح في الشكل 3 والخطوة 2.3.5 .
      ملاحظة: يتم تغيير الوسط إلى وسيط التمايز لتعزيز تمايز hNESPCs إلى hNECs في ALI. تستغرق hNESPCs حوالي 3-4 أسابيع للوصول إلى مرحلة النضج الكامل لتصبح hNECs في ALI ، وعند هذه النقطة تكون الخلايا قد نمت لتصبح متعددة الطبقات مع مجموعات مختلفة من الخلايا في كل طبقة. يجب أيضا ملاحظة الأهداب عند تكبير 400x (يمكن تحديد الأهداب من خلال حركة ضربها ، مما يتسبب في ظهور حقل المجهر وكأنه يهتز). في هذه المرحلة ، تكون الخلايا جاهزة للاستخدام في تجارب الزراعة المشتركة. ارجع إلى الشكل 4 للاطلاع على المقطع العرضي لطبقة hNEC متباينة تماما.
    2. بعد الحصول على hNECs ناضجة ، اغسل الخلايا في الغرفة القمية 3x مع 1x dPBS على فترات 2-3 أيام لمدة أسبوع واحد قبل تجربة الزراعة المشتركة. قم بتآزر خطوة الغسيل مع التغييرات المتوسطة القاعدية ، وقم بإجراء عمليات الغسيل على النحو التالي.
      1. أضف 50 ميكرولتر (24 بئرا) / 150 ميكرولتر (12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة dPBS بعد 10 دقائق من الحضانة لإزالة المخاط المتراكم والخلايا الميتة على مدار التمايز.
        ملاحظة: اعتمادا على طبيعة التجربة ، يمكن استخدام محلول بيكربونات الصوديوم لغسل طبقة المخاط بالكامل. ومع ذلك ، بالنسبة للعدوى الفيروسية في تجارب الزراعة المشتركة ، يتم الاحتفاظ بطبقة المخاط ، ويتم إزالة المخاط الزائد فقط باستخدام غسل dPBS. هذا الاحتفاظ هو محاكاة طبقة المخاط الفسيولوجية الموجودة على ظهارة الأنف التي ستتفاعل مع العدوى الفيروسية الواردة.

3. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)

ملاحظة: تأكيد السلامة الظهارية مهم لضمان الحصول على طبقة ظهارية سليمة وصحية. يتم تحديد الطبقة الظهارية السليمة من خلال قياس TEER الذي يتم إجراؤه على 4 آبار عشوائية باستخدام مقياس الفولتوهمتر.

  1. شطف القطب الكهربائي بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وتعقيمه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام لضمان العقم. شطف مع 1x dPBS بعد التعقيم.
  2. أضف 100 ميكرولتر (ل 24 بئرا) أو 300 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ ثم قم بإزالة dPBS.
  3. لكل بئر يتم قياسه ، قم بإعداد بئر غير مستخدم مع 1 مل (ل 24 بئرا) أو 3 مل (ل 12 بئرا) من وسط التمايز المسخن مسبقا (إلى 37 درجة مئوية). ضع إدراج الغشاء في البئر المحضر ، وأضف 200 ميكرولتر (ل 24 بئرا) أو 600 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من وسط التمايز المسخن مسبقا إلى الغرفة القمي. التوازن عند 37 درجة مئوية (رهنا بدرجة حرارة حضانة نوع الفيروس المضاف ، على سبيل المثال ، 35 درجة مئوية للإنفلونزا) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: قم بإعداد فارغ (إدراج غشاء فارغ) بنفس الطريقة لحساب TEER.
  4. قم بموازنة أنبوب سعة 15 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا في نفس درجة الحرارة لمدة 15 دقيقة أيضا. ضع الأقطاب الكهربائية في أنبوب 15 مل ، وقم بتشغيل voltohmmeter.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون القراءة مقاومة 0 ، لأن الأقطاب الكهربائية في نفس الوسط. إذا تم الحصول على أي قراءة أخرى ، فقم بموازنة القطب الكهربائي في أنبوب 15 مل حتى تصبح القراءة 0.
  5. بدءا من الفراغ ، ضع الأقطاب الكهربائية في كل بئر بحيث يتم غمر قطب كهربائي واحد في وسط الغرفة القمية والآخر في وسط الغرفة القاعدية. سجل القراءة فقط عند الحصول على قراءة ثابتة لمدة 5 دقائق على الأقل.
  6. بعد كل قياس ، اغسل القطب باستخدام PBS قبل القياس التالي. لكل بئر تم اختباره ، خذ قياسات لثلاث عينات في مواقع مختلفة من الغشاء. لحساب صافي TEER لكل عينة، اطرح مقاومة الخلفية، التي يعطيها الغشاء الفارغ، من كل قياس.
  7. احسب إجمالي قراءة TEER لبئر باستخدام المعادلة التالية:
    السلامة الظهارية (Ωcm 2) = صافي TEER (أوم) × مساحة الغشاء (سم2)
    ملاحظة: يجب أن تكون قيم TEER ل hNECs لتجارب العدوى الفيروسية >1000 Ωcm213,15,16. 

4. عزل وحيدات الدم المحيطية وخلايا NK

ملاحظة: يجب الحصول على عينات الدم من المتطوعين الأصحاء واستخدامها في نفس يوم العزل.

  1. جمع 30-40 مل من الدم الكامل من كل متبرع في أنابيب جمع الدم 10 مل.
  2. عزل PBMCs باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، والحصول على PBMCs من معطف buffy بعد الخطوات التالية (انظر أيضا جدول المواد).
    1. امزج جيدا ~ 10 مل من الدم من أنبوب جمع الدم في فراغ قبل تخفيفه بحجم متساو من محلول الملح المتوازن (PBS).
    2. أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى قاعدة أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: يجب أن تكون نسبة تدرج الكثافة المتوسطة إلى الدم المخفف 2:3-3.5.
    3. طبقة 35 مل من الدم المخفف على وسط تدرج الكثافة باستخدام مسدس ماصة (مع ضبط إعداد التوزيع على أدنى مستوى ممكن) عن طريق إمالة الأنبوب بمقدار 45 درجة والسماح للدم المخفف بالسقوط قطرة على الجدار الداخلي للأنبوب بحيث لا يتم إزعاج طبقة وسط تدرج الكثافة.
    4. محلل أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم ، 18-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الفرامل: إيقاف). قم بإزالة طبقة البلازما العليا بعناية والتخلص منها دون إزعاج الطبقة السفلية.
    5. انقل المعطف الرقيق إلى أنبوب جديد دون خلط طبقة خلايا الدم الحمراء أو الطبقة المتوسطة ذات الكثافة المتدرجة أو المعطف الناعم. بمجرد جمع المعطف الرقيق في أنبوب جديد سعة 50 مل ، قم بزيادة الحجم إلى 50 مل باستخدام 1x PBS.
    6. محلل أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم ، 18-20 درجة مئوية ، 8 دقائق (الفرامل: إيقاف) ، وإزالة supernatant باستخدام مسدس ماصة. أعد تعليق بيليه الخلية مع 50 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 120 × جم ، 18-20 درجة مئوية ، 10 دقائق لإزالة الصفائح الدموية.
    7. تخلص من السوبرناتانت عن طريق السحب ، دون إزعاج بيليه الخلية.
      ملاحظة: نظرا لأن حبيبات الخلايا قد تكون فضفاضة ، فمن غير المستحسن التخلص من السوبرناتانت عن طريق الصب.
    8. أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام وسيط RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) الكامل. قم بإجراء عدد الخلايا عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من حمض الخليك بنسبة 3٪ مع أزرق الميثيلين إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المعاد تعليقه. اخلطي جيدا ، وأضيفي 10 ميكرولتر من الخليط إلى مقياس الدم لحساب الخلايا.
  3. تمييع PBMCs مع RPMI كاملة متوسطة إلى كثافة 2 × 10 6 / مل (ل 24 بئر) أو 4 × 106 / مل (ل 12 بئر).

5. العدوى الفيروسية hNEC والانتقال إلى hNEC: PBMC الثقافة المشتركة

ملاحظة: يستخدم الفيروس H3N2 (A/Aichi/2/1968) كسلالة تمثيلية للعدوى في هذا البروتوكول. يستخدم تعدد العدوى (MOI) من 0.1 كممثل لوزارة الداخلية في هذا البروتوكول.

  1. اليوم 0 (عدوى hNECs)
    ملاحظة: يتم استخدام بئر واحد من hNECs المزروعة من نفس المتبرع للحصول على عدد خلايا تمثيلي لكل بئر يستخدم في التجربة.
    1. في البئر التمثيلية ، أضف 150 ميكرولتر من 1x trypsin-EDTA إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء و 350 ميكرولتر من 1x trypsin-EDTA إلى الغرفة القاعدية ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، أو حتى تنفصل الخلايا عن الغشاء.
    2. اغسل الخلايا على الغشاء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وجمع التعليق في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. أضف 200 ميكرولتر من DMEM الكامل لإخماد نشاط التربسين. عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق للحصول على عدد الخلايا لكل بئر.
    3. احسب MOI المطلوب للفيروس بناء على عدد الخلايا لكل بئر ، وقم بتخفيف مخزون الفيروس وفقا لذلك مع RPMI الكامل على الجليد.
      ملاحظة: MOI 0.1 من 1.26 × 106 hNECs لكل بئر = 1.26 × 105 جسيمات فيروسية H3N2 لكل بئر في 30 ميكرولتر (ل 24 بئر) / 100 ميكرولتر (ل 12 بئر)
    4. بالنسبة للآبار المتبقية لتجربة العدوى ، أضف 50 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 150 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى الغرف القمية لإدراج الغشاء ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وإزالة 1x dPBS.
    5. قم بتغيير الوسط القاعدي في إدراج الغشاء لإكمال وسط RPMI عن طريق نقل الإدخالات إلى لوحة جديدة مع إضافة RPMI كاملة إلى الآبار (350 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 700 ميكرولتر (ل 12 بئرا)).
      ملاحظة: عندما تكون hNESPCs قد تميزت تماما عن hNECs ، فإنها تكون متسامحة / متساهلة مع وسائط مختلفة لمدة تصل إلى 72 ساعة ، دون أي تغييرات في المورفولوجيا أو التنظيم عند تبديل الوسيط إلى RPMI12. يستخدم RPMI لدعم نمو وصيانة سكان PBMC.
    6. أضف 30 ميكرولتر المحضر (ل 24 بئرا) / 100 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من لقاح الفيروس إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء ، واحتضان عند 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة ، وإزالة التلقيح الفيروسي من الغرفة القمي.
    7. قم بتغيير الوسط القاعدي لإدراج الغشاء إلى وسط RPMI كامل طازج واحتضنه عند 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  2. اليوم 1 (إنشاء مراكز وطنية للكهرباء والنباتات ومراكز بناء القدرات في مجال الثقافة المشتركة)
    1. زرع العدد المطلوب من PBMCs في 150 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 300 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من وسط RPMI الكامل عن طريق إضافة تعليق PBMC مباشرة إلى الغرفة القاعدية لكل بئر من hNECs غير المصابة أو المصابة من اليوم 0 (1.5 × 10 6 للوحات 24 بئرا و 3 × 106 للوحات 12 بئرا). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24/48 ساعة.
      ملاحظة: الحجم النهائي في الغرفة القاعدية بعد إنشاء الاستزراع المشترك هو 500 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 1000 ميكرولتر (ل 12 بئرا).
  3. الأيام 2-3 (حصاد PBMCs 48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
    1. جمع المواد الخارقة القمية (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
      1. أضف 50 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 150 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من 1x dPBS إلى كل غرفة قمية ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اجمع 1x dPBS في أنابيب 1.5 مل. Aliquot 25 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 50 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من supernatant لفحص البلاك في أنبوب جديد 1.5 مل ، وتجميد كل من المخزون و aliquots على الفور عند -80 درجة مئوية.
    2. جمع الحمض النووي الريبي الخلوي من hNECs (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
      1. انقل إدراج الغشاء إلى بئر نظيف ، وأضف 300 ميكرولتر (ل 24 بئرا) / 600 ميكرولتر (ل 12 بئرا) من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي إلى الغرفة القمية ، واحتضنه في rtp لمدة 5 دقائق. جمع supernatant في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي.
    3. حصاد PBMCs (48/72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)
      1. باستخدام القاعدة العريضة لطرف ماصة معقم ، قم بكشط سطح البئر بلطف لإزاحة PBMCs المنشطة التي قد تكون ملتصقة بسطح البئر. جمع الوسط القاعدي الذي يحتوي على PBMCs في أنبوب طرد مركزي 2 مل.
      2. اغسل الآبار 2x ب 300 ميكرولتر من 1x dPBS ، واجمع الغسيل في نفس الأنبوب 2 مل. الطرد المركزي أنبوب 2 مل (500 × غرام، 5 دقائق، rtp)، وجمع supernatant في أنبوب جديد 2 مل دون إزعاج بيليه الخلية. تخزين supernatant في -80 درجة مئوية لتحليل السيتوكين والكيموكين ؛ إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من 1x dPBS.

6. قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يستمر هذا القسم من البروتوكول مباشرة من القسم السابق باستخدام تعليق خلية PBMC من الخطوة 5.3.3.2. تأكد من الحد الأدنى من التعرض للضوء خلال الخطوات التالية في هذا القسم. يمكن العثور على لوحة عينة من علامات تلطيخ السطح في الجدول 2.

  1. تلطيخ السطح
    1. انقل حبيبة خلية PBMC المعاد تعليقها إلى صفيحة بئر سفلية 96-V. تحلل أجهزة الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant.
    2. احتضان جميع PBMCs (باستثناء "غير ملطخة") مع 100 ميكرولتر من بقعة قابلة للحياة لمدة 15 دقيقة في rtp. قم بتعبئة ما يصل إلى 200 ميكرولتر باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). تحلل أجهزة الطرد المركزي عند 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، وتخلص من السوبرناتانت.
    3. قم بإعداد لوحة من الأجسام المضادة الملطخة السطحية ذات الأهمية مع نسب تخفيف مناسبة وحجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل تفاعل (قم بتعبئة المخزن المؤقت MACS للحصول على الحجم النهائي). قم بإجراء تلطيخ السطح عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المحضر إلى الخلايا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    4. اغسل بإضافة 150 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت. محلل جهاز الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق ، والتخلص من supernatant. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تلطيخ داخل الخلايا ، فانتقل مباشرة إلى حضانة 15 دقيقة في الخطوة 6.3.
  2. تلطيخ داخل الخلايا (إذا لزم الأمر)
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية لكل بئر. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. قم بتعبئة الآبار ب 100 ميكرولتر من 1x MACS العازل.
    2. جهاز طرد مركزي (800 × جم ، 3 دقائق ، 25 درجة مئوية) ، وإزالة supernatant. كرر الغسيل بإضافة 200 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت لغسيل النفاذية. جهاز طرد مركزي (500 × جم ، 3 دقائق ، 25 درجة مئوية) ، وإزالة supernatant.
    3. قم بإعداد التخفيفات للوحة الأجسام المضادة ذات الأهمية لتحقيق حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر باستخدام 1x Permeabilization Wash buffer. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النفاذية 1x.
    4. الطرد المركزي للخلايا (800 × جم ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، وإزالة supernatant. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور.
  3. ماصة 200 ميكرولتر من محلول التحلل في كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في rtp. محلل جهاز الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق والتخلص من supernatant.
  4. أعد تعليق كريات الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي وفقا للإعدادات الموضحة سابقا13 ، أو قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام.

7. تحديد مستويات السيتوكين والكيموكين

  1. معالجة 25 ميكرولتر من supernatant الغرفة القاعدية باستخدام فحص متعدد الإرسال المناعي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة18.
  2. احسب تركيز كل تحليل باستخدام برنامج مدير متعدد الإرسال باستخدام خوارزمية ملائمة للمنحنى (5 معلمات) للمنحنى القياسي.

8. تقييم التلوث الفيروسي

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مجموعة استخراج على 4 مجموعات من الحلول: محلول H3N2 المخزون، وتخفيف MOI 0.1 للعدوى، والتخفيفات التسلسلية 10x من MOI 0.1، والوسط القاعدي من العينات (كل من 48 و 72 ساعة بعد العدوى الفيروسية)12.
  2. حدد الجين غير الهيكلي (NS1) والمصفوفة (M1) كأهداف لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (انظر جدول المواد للاشعال المستخدمة في التجربة التمثيلية).
  3. قم بإجراء النسخ العكسي-PCR (RT-PCR) (42 درجة مئوية ، 60 دقيقة) لتحويل الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى cDNA قبل إجراء PCR الكمي (QPCR) لقياس مستويات NS1 و M1 كوكيل للوجود الفيروسي ، وربط المستويات بالمنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه من RT-qPCR الذي تم إجراؤه على التخفيف التسلسلي 10x ل MOI 0.1 aliquot. ارجع إلى الجدول 3 لمعرفة تكوين خلطات التفاعل ، واستخدم الشروط التالية: ما قبل الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، يليها تضخيم من 3 خطوات لمدة 40 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ منحنى الذوبان: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 65 درجة مئوية ل 60 ثانية ، و 97 درجة مئوية لمدة 1 ثانية.

9. فحص البلاك

  1. اليوم 0: البذر MDCK (كلية الكلاب في مدين داربي) في 24 بئرا
    1. قم بإزالة الوسط من قارورة T75 من خلايا MDCK المتقاربة. اغسل 2x مع 1x PBS لإزالة جميع آثار المصل. التربسين خلايا MDCK عن طريق إضافة 10 مل من التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 20-30 دقيقة حتى تنفصل الخلايا.
      ملاحظة: لا تنقر على القارورة لأن ذلك قد يؤدي إلى التكتل.
    2. ماصة تعليق الخلية في أنبوب 15 مل يحتوي على 2 مل من الوسط الأساسي الأدنى الكامل من النسر (EMEM). جهاز طرد مركزي (300 × جم ، 5 دقائق ، rtp) ، وإزالة supernatant.
    3. أعد تعليق الخلايا في 6 مل من EMEM الكامل. عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق.
    4. قم بتخفيف تعليق خلية MDCK إلى تركيز 1 × 105 خلايا / مل ، وبذور 1 مل من التعليق المخفف في كل بئر من صفيحة معقمة من 24 بئرا. احتضان في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للحصول على طبقة أحادية التقاء من خلايا MDCK في كل بئر.
  2. اليوم 1: عدوى خلايا MDCK
    1. تحضير وسط العدوى. قم بإزالة الوسط من الطبقة الأحادية MDCK في اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واغسل 2x باستخدام 1x dPBS. بالنسبة للغسيل الثاني ، اترك PBS في الآبار أثناء إعداد التخفيفات التسلسلية للفيروس.
    2. قم بإذابة عينات الفيروس على الجليد ، وتخفيفها بشكل متسلسل في صفيحة من 24 بئرا لتحقيق تخفيفات تسلسلية من 10-1 إلى 10-6.
      ملاحظة: على سبيل المثال ، املأ كل بئر في صفيحة من 24 بئرا ب 270 ميكرولتر من وسط العدوى.
    3. أضف 30 ميكرولتر من عينة الفيروس إلى البئر الأول في الصف. باستخدام طرف ماصة جديد ، اخلطه جيدا وانقله إلى البئر التالي في الصف لتخفيف العينة بمقدار 10 أضعاف. المضي قدما حتى يتم تحقيق تخفيف 10-6 ؛ تنفيذ الخطوات 9.2.1-9.2.3 لكافة عينات الفيروسات.
    4. قم بإزالة PBS من لوحة MDCK ، وأصاب في نسختين مع 100 ميكرولتر من التخفيفات الفيروسية المحضرة. لآبار التحكم ، أضف 100 ميكرولتر من وسط العدوى (بدون العينة الفيروسية). احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة ، وهز اللوحة للقضاء على البقع الجافة كل 15 دقيقة.
    5. إزالة التلقيح الفيروسي ، وإضافة 1 مل من تراكب السائل لكل بئر. احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
  3. اليوم 4 (72 ساعة بعد الإصابة): تصور البلاك
    1. قم بإزالة تراكب السائل ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ من الفورمالديهايد في 1x PBS لمدة 1 ساعة. قم بإزالة محلول الفورمالديهايد ، واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS أو الماء المقطر.
    2. قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بإضافة محلول بنفسجي كريستالي بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة صبغة البنفسج الكريستالية ، واغسل الخلايا بالماء الجاري. جفف اللوحة في rtp.
    3. بمجرد أن تجف ، عد اللويحات ، واحسب العيار الفيروسي وفقا للصيغة التالية:
      عدد اللويحات × عامل التخفيف = عدد اللويحات - وحدات التشكيل في 100 ميكرولتر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

على الرغم من أن الخلايا التائية التقليدية تشكل الذخيرة الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية ضد العدوى الفيروسية لتسهيل التطهير الفيروسي ، إلا أن مجموعة الخلايا التائية الفطرية تعمل عبر طيف أوسع لقمع الحمل الفيروسي من أجل إزالة فعالة في مرحلة لاحقة. لذلك ، يخلق هذا البروتوكول على وجه التحديد حالة قوية لدراسة الخلايا التائية الفطرية وتنشيطها وسكانها الوظيفيين بعد الإصابة بالأنفلونزا ، دون الحاجة إلى عينات الخلايا الظهارية والمناعية من نفس المتبرع. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على فيروسات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الاستجابات المناعية الفطرية ضد الفيروسات هي مجال دراسة غير مدروس في الإدارة المضادة للفيروسات. تعمل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء والخلايا المناعية الفطرية بشكل متضافر لقمع التكاثر الفيروسي أثناء العدوى ، إلى جانب العمل كمحدد للاستجابة التكيفية المفرطة النشاط إذا لم يتم الاحتفاظ بالحمل الفيروسي تحت السيطرة12،13،17. ومع ذلك ، فإن تطوير نموذج بشري ذي صلة لدراسة المناعة الفطرية الظهارية الفطرية المتقاطعة للتحقيق في تنشيط الخلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر موظفي الأبحاث في قسم NUS لطب الأنف والأذن والحنجرة وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة على مساعدتهم في العمل المتعلق بثقافة hNEC والثقافة الفيروسية. كما نود أن نشكر الجراحين والفريق الجراحي في مستشفى الجامعة الوطنية ، قسم طب الأنف والأذن والحنجرة ، على مساعدتهم في توفير عينات الخلايا والدم المطلوبة للدراسة.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المجلس الوطني للبحوث الطبية ، سنغافورة رقم. NMRC/CIRG/1458/2016 (إلى دي يون وانغ) ووزارة الصحة-OFYIRG19may-0007 (إلى كاي سين تان). كاي سين تان هو حاصل على دعم الزمالة من الزمالة الأوروبية للحساسية والمناعة السريرية (EAACI) 2019.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5٪ تريبسين-EDTAجيبكو15400-054
0.5 م حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، درجة الحموضة 8.0 ،الرثروفيرشيدمن RNase AM9260G0.5 متر EDTA
1.5 مل أنابيب SafeLockEppendorf00301200861.5 مل أنبوب الطرد المركزي
10 مل K3EDTA أنابيب فراغBD36664310 مل أنابيب جمع الدم
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12-بئر لوحةCorning 3513
12 بئر Transwell InsertCorning 3460إدراج غشاء
1x FACS محلول للتحللBD349202
2.0 مل أنابيب SafeLockEppendorf00301200942 مل أنبوب الطرد المركزي
24 بئرلوحة Corning   ؛3524
24 بئر Transwell InsertCorning 3470
3٪ حمض الخليك مع تقنيات الميثيلين الأزرقSTEMCELL07060
3،3 '، 5-triiodo-l-thyronineSigmaT-074
37٪ محلول فورمالديهايد مع 15٪ ميثانول كمثبت في H2< / sub>OSigma533998
5810R أجهزة الطرد المركزيEppendorf5811000320
5 مل بولي بروبيلين أنابيب (أنابيب التدفق)BD352058
70 & micro ؛ م مصفاة الخليةCorning 431751
A-4-62 الدوارEppendorf5810709008
AccutaseGibcoكاشف تفكك الخلاياA1110501
المضاد الحيوي المضاد للفطرياتGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolymerNAتراكب السائل
Bio-Plex Manager 6.2 البرمجيات القياسيةBio-Rad Laboratories، Inc171STND01برنامج مدير الإرسال
إبرة فراشة 21 جمدينار بحريني367287
سم الكوليراسيجماC8052
كريستال بنفسجي   ؛MerckC6158
Cytofix / Cytoperm SolutionBD554722التثبيت والنفاذية محلول
Dispase IISigmaD4693البروتياز المحايد
DMEM / ارتفاع الجلوكوزGE علوم الحياة للرعايةالصحية SH30243.01
DMEM / خليط المغذيات F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (ث L-Glutamine)ATCC30-2003
جهاز EVOM voltohmmeterWPI ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية300523
FACS محلولللحلل BD3492021x محلول للحليل
أنبوب فالكون 15 ملCellStar18827115 مل أنبوب
فالكون 50 ملCellStar22726150 مل أنبوب
سريع بدء الحمض النووي أساسي مجسات ماسترروش6402682001qPCR ماستر ميكس
فيكول باك أدوات بحث متميزة17544203كثافة التدرج وسائط
H3N2 (A / Aichi / 2/1968)  ATCCVR547
H3N2 M1 تسلسل التمهيدي الأماميSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 تسلسل التمهيدي العكسيSigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 تسلسل التمهيدي الأماميSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 تسلسل التمهيدي العكسيSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'مصل
الأبقار الجنيني المعطل بالحرارةGibco10500-064
hNESPCsالمتبرعون البشريونNA
عامل النمو الظهاري البشريجيبكو إنفيتروغينPHG0314
هيدروكورتيزونSTEMCELL Techonologies7925تم جمعها من خزعات الأنف أثناء جراحات
انحراف الحاجزالأنسولينSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR Instrument
Live / DEAD Blue Cell Stain Kit * لإثارة الأشعة فوق البنفسجيةThermofisherL23105بقعة الجدوى
MILLIPLEX MAP لوحة حبة مغناطيسية للسيتوكين البشري / كيموكين II - مخلوطة مسبقا 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23فحص المناعة المتعدد
الإرسال Mitomycin CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1706Reverse Transcriptase
N-2 supplementGibco-Invitrogen17502-048
NIH / 3T3ATCCCRL1658
Perm / Wash BufferBD554723نفاذية Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x مكملغذائي STEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Basal MediumSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)STEMCELL Techonologies5001
Random PrimersPromegaC1181Random Primers
المؤتلف Rnasin Rnase InpressorPromegaN2511RNase مثبط
الحمض النووي الريبي تحلل العازلةQiagenجزء من 52904
RPMI 1640 (ث L-Glutamine)ATCC30-2001
STX2 أقطابكهربائية WPI ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةSTX2القطب
T25 قارورةكورنينج430639
T75 قارورةكورنينج430641U
TPCK طقم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
Qiagen52904طقم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي
شكل حرف V 96 بئرCorning3894
الخالي على

المراجع

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنشيط المناعة الفطريةخلايا الظهارة الأنفيةالخلايا التائية الفطريةالخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيقياس التدفق الخلويالعدوى بفيروس الإنفلونزاالتآثر المناعي الظهاريتحليل السيتوكينات
نموذج الزراعة المشتركة الخالية من التلامس لدراسة تنشيط الخلايا المناعية الفطرية أثناء عدوى فيروس الجهاز التنفسي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.