تصوير الأمعاء ب "الوضوح"

ملخص

نصف بروتوكول تلطيخ الوضوح السلبي (PACT) لأمعاء الفأر لتمكين تصور الأنسجة تحت الظهارية ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وخلايا الغدد الصم المعوية (EEC) بدون تقطيع الأنسجة. يتضمن البروتوكول تضمين الهيدروجيل للأنسجة الثابتة بالفورمالديهايد ، وإزالة الدهون اللاحقة باستخدام منظف أنيوني "لتنظيف" الأنسجة.

الملخص

تطورت CLARITY (الأنسجة الجامدة المتوافقة مع التصوير الصلب المهجن بالدهون الشفافة hYydrogel) مؤخرا كتقنية قيمة تتضمن تضمين مادة الأكريلاميد في أنسجة إزالة الشحوم (بدون تقسيم) وللحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد للتلوين المناعي. هذه التقنية ذات صلة كبيرة في تصوير بيئة الأمعاء الديناميكية حيث تتفاعل أنواع الخلايا المختلفة أثناء التوازن وحالات المرض. يتم وصف هذه الطريقة المحسنة لأمعاء الفأر هنا ، مما يساعد على تتبع أنواع الخلايا مثل الظهارة ، والغدد الصم المعوية ، والخلايا العصبية ، والخلايا الدبقية ، والإسقاطات العصبية في الظهارة أو خلايا الغدد الصم المعوية التي تتوسط الاستشعار الميكروبي أو الاستشعار الكيميائي للمغذيات على التوالي. يتم تثبيت أنسجة الأمعاء (1-1.5 سم) في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في اليوم الأول. في اليوم 2 ، يتم التخلص من PFA ، ويتم غسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS. يتم تضمين الأنسجة هيدروجيل للحفاظ على سلامتها عن طريق الحضانة في محلول هيدروجيل 4٪ (أكريلاميد) في PBS (مخفف من 30٪ ProtoGel) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في اليوم 3 ، يتم تحضين محلول هيدروجيل الأنسجة عند 37  درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح ببلمرة الهيدروجيل. ثم يتم غسل الأنسجة ثلاث مرات برفق باستخدام PBS لإزالة الهيدروجيل الزائد. تتضمن الخطوة اللاحقة من إزالة الشحوم (التطهير) حضانة الأنسجة في كبريتات دوديسيل الصوديوم (8٪ SDS في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة يومين (اليومين 4 و 5) على شاكر في درجة حرارة الغرفة (RT). في اليوم 6 ، يتم غسل الأنسجة التي تم تطهيرها جيدا باستخدام PBS لإزالة SDS. يمكن تلطيخ الأنسجة مناعية عن طريق الحضانة في الأجسام المضادة الأولية (مخفف في مصل الحمار العادي بنسبة 0.5٪ في PBS الذي يحتوي على 0.3٪ Triton X-100) ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، والحضانة اللاحقة في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة Alexa Fluor لمدة 1.5 ساعة في RT ، والتلوين النووي باستخدام DAPI (1: 10000). يتم نقل الأنسجة على شريحة زجاجية نظيفة وتركيبها باستخدام VectaShield للتصوير متحد البؤر.

المقدمة

تطورت CLARITY (الأنسجة الصافية المتبادلة بالدهون الشفافة المتبادلة مع الأكريلاميد والتصوير الصلب المتوافق مع الأنسجة hYdrogel) مؤخرا كتقنية قيمة تتضمن تضمين مادة الأكريلاميد (الهيدروجيل) وإزالة دهون الأنسجة للحفاظ على بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد للتلوين المناعي (بدون تقسيم) ^1،2. الأنسجة المضمنة في الهيدروجيل شفافة بصريا ونفاذية للجزيئات الكبيرة ، حيث يتم الحفاظ على البروتينات والأحماض النووية بعد إزالة الدهون بواسطة المنظفات. تم الاعتراف ب CLARITY كواحد من بين عشرة اختراقات بارزة في عام 2013 بواسطة Science³. على الرغم من أنها تم تطويره....

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموصوفة من قبل لجنة جامعة إيموري لاستخدام ورعايتها. سمح لفئران C57BL / 6 (يمكن استخدام الذكور والإناث) في عمر 8-12 أسبوعا من العمر بحرية الوصول إلى الطعام والماء قبل القتل الرحيم.

1. إزالة الأمعاء (اليوم 1)

1. القتل الرحيم للفأر بطريقة الاختناق بثاني أكسيد الكربون ، بمعدل تدفق 1.6 مل من غاز ثاني أكسيد الكربون حتى يتم ملاحظة توقف التنفس لمدة دقيقتين).
2. ضع الفأر ضعيفا على لوح تشريح مع تثبيت الأطراف. تعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام الملقط ، افتح الجلد بالمقص.
3. ارفع الكبد برفق وحدد المعدة. ثم أمسك المعدة بالملقط ، وقطع المريء فوق المعدة ....

النتائج

يتم تمثيل الصور من أنسجة أمعاء الفأر التي تم تطهيرها بتقنية CLARITY في الشكل 1. ينتج عن الإكمال الناجح للبروتوكول صورا عالية الجودة ونقية حيث يمكن تصور جميع التفاصيل الخلوية بوضوح. يعد تلطيخ DAPI للنوى مؤشرا جيدا جدا لتقييم جودة بروتوكول CLARITY والتلوين المناعي اللاحق لأنه يمكن أن يصور سلامة الأنسجة. علاوة على ذلك ، يوفر شكل الخلية أيضا دليلا على كيفية نجاح البروتوكول خاصة في حالة الخلايا العصبية والدبقية والغدد الصماء المعوية ذات التشكل الخلوي المميز. تظهر الخلية المشوهة ذات التلطيخ الهزيل.......

المناقشة

طريقة CLARITY مفيدة للغاية لتلوين أمعاء الفئران لتصور أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الظهارة والخلايا العصبية والخلايا الدبقية في 3D ، وخاصة شبكة الإسقاطات العصبية التي تمتد عبر جدار الأمعاء إلى التجويف⁵ وتعصيبها إلى الخلايا الدبقية والخلايا EEC. تم تعديل الطريقة المعروضة هنا وفقا للدراسة الأصلية التي أجراها Yang et al. 2014¹.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الشطف الفوري للمثبت بعد تثبيت أنسجة الأمعاء طوال.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4٪ بارافورمالدهايد (PFA)   في PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	يستخدم لتثبيت الأنسجة
4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1 / 10،000 تخفيف
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	1/500 تخفيف
مضاد GFAP (بروتين حمض الليفية الدبقية)	Abcam	ab7260	1/500 تخفيف
مضاد بيتا III Tubulin (أو Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 تخفيف
الكروموجرانين A	Abcam	ab15160	1/250 تخفيف
ProtoGel   30٪	التشخيص الوطني	EC-890	سام ، خطير ، تعامل بحذر- صنع محلول 4٪ في PBS للاستخدام
كبريتات دوديسيل الصوديوم	ThermoFischer Scientific	28364	8٪ في PBS
Vectashield تركيب وسيط	Vector Laboratories	H-1000

تخفيف