نقدم بروتوكولا لتوليد حركة الأسنان التقويمية في الفئران وطرق التصور ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين والأوعية الدموية للأربطة اللثة دون تقسيم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نقدم بروتوكولا لتوليد حركة الأسنان التقويمية في الفئران وطرق التصور ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين والأوعية الدموية للأربطة اللثة دون تقسيم.
حركة الأسنان التقويمية هي عملية بيولوجية معقدة لتغيير الأنسجة الرخوة والثابتة نتيجة للقوى الخارجية. من أجل فهم عمليات إعادة العرض المعقدة هذه ، من المهم دراسة أنسجة الأسنان واللثة ضمن سياقها ثلاثي الأبعاد وبالتالي تقليل أي قطع أثرية من الأقسام والأنسجة. وغالبا ما تستخدم نماذج الماوس في علم الأحياء التنموية والهيكلية، وكذلك في الميكانيكا الحيوية نظرا لصغر حجمها، وارتفاع معدل الأيض، وعلم الوراثة وسهولة التعامل معها. من حيث المبدأ هذا أيضا يجعلها نماذج ممتازة للدراسات المتعلقة بالأسنان. ومع ذلك ، فإن العائق الرئيسي هو صغر حجم الأسنان ، والأضراس على وجه الخصوص. تهدف هذه الورقة إلى توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد حركة الأسنان التقويمية وطرقتين للتصوير ثلاثي الأبعاد للمكون الليفي للأربطة اللثة من ضرس الفك السفلي للفأرة. تعتمد الطريقة الأولى المقدمة على إعداد التصوير المقطعي الدقيق الذي يتيح تصوير المرحلة لتعزيز أنسجة الكولاجين الطازجة. الطريقة الثانية هي طريقة تطهير العظام باستخدام إيثيل سينامات التي تمكن التصوير من خلال العظام دون تقسيم ويحافظ على الفلورية الذاتية. الجمع بين هذه الطريقة المقاصة مع الفئران مراسل مثل Flk1-كري; قدمت TdTomato فرصة أولى من نوعها لتصوير الأوعية ثلاثية الأبعاد في PDL وعظم الحويصلات.
العملية البيولوجية الأساسية الكامنة في حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي إعادة عرض العظام. ويعزى الزناد لعملية إعادة عرض هذه التغييرات في هيكل الرباط اللثة (PDL) مثل الإجهاد خارج الخلية (ECM) ، نخر وكذلك تدمير الأوعية الدموية وتشكيل1،2،3. ترتبط المحفزات المحتملة الأخرى لإعادة عرض العظام الحويصلات الشمسية باستشعار القوة بواسطة الخلايا العظمية في العظام ، وكذلك التشوه الميكانيكي للعظم الحويصلات الدموية نفسه ؛ لكن دورهم في OTM لا يزال غير توضيح كامل4,5.
على الرغم من العديد من الدراسات التي تهدف إلى الكشف عن العلاقات بين هيكل وظيفة من PDL خلال OTM، آلية وظيفية واضحة لم يتم تعريفهابعد 6،7. والسبب الرئيسي لذلك هو التحدي في استرجاع بيانات الأنسجة الرخوة (PDL) الموجودة بين اثنين من الأنسجة الصلبة (الاسمنت والعظام الحويصلات). عادة ما تتطلب الطرق المقبولة لجمع المعلومات الهيكلية التثبيت والقسمة التي تعطل وتعديل بنية PDL. وعلاوة على ذلك، فإن معظم هذه الطرق تسفر عن بيانات 2D التي حتى لو لم تكن مشوهة، تعطي معلومات جزئية ومترجمة فقط. وبما أن PDL ليست موحدة في هيكلها ووظيفتها ، فإن النهج الذي يعالج الهيكل ثلاثي الأبعاد السليم لمجمع الأسنان PDL-bone بأكمله له ما يبرره.
هذه الورقة سوف تصف طريقة لتوليد OTM في الفئران وطريقتين التي تمكن التصور 3D من ألياف الكولاجين في PDL دون أي تقسيم العينة.
وتستخدم نماذج مورين على نطاق واسع للتجارب في الجسم الحي في الطب والبيولوجيا التنموية وتسليم الأدوية والدراسات الهيكلية. ويمكن تعديلها وراثيا للقضاء على أو تعزيز بروتينات محددة وظيفة; أنها توفر سيطرة سريعة وقابلة للتكرار ويمكن التنبؤ بها التنمية; كما أنها سهلة الصورة نظرا لحجمها الصغير8. على الرغم من مزاياها العديدة ، لا تستخدم نماذج الماوس في أبحاث طب الأسنان بشكل متكرر ، خاصة عندما يكون هناك ما يبرر التلاعب السريري ، ويرجع ذلك في الغالب إلى الأسنان الصغيرة الحجم. نماذج حيوانية مثل الفئران9،10،11، ال12،13، الخنازير14،15،16 والقرود17 تستخدم في كثير من الأحيان من الفئران. مع التطور الأخير لتقنيات التصوير عالية الدقة ، فإن مزايا استخدام نموذج الماوس لفك رموز العمليات المعقدة في OTM عديدة. تقدم هذه الورقة طريقة لتوليد حركة ميسالية للسن الضرس في الفك السفلي مع مستويات القوة الثابتة التي تؤدي إلى إعادة عرض العظام. تتم معظم تجارب OTM في القوارض في الفك العلوي ، لأن حركة الفك السفلي ووجود اللسان يضيفان مستوى تعقيد آخر. ومع ذلك ، فإن الفك السفلي له العديد من المزايا عندما يكون المطلوب السلامة الهيكلية ثلاثية الأبعاد. يمكن تشريحه بسهولة كعظم كامل. في بعض الأنواع يمكن فصله إلى اثنين من الفك السفلي هيمي من خلال السمفونية الليفية; وهو مدمج، شقة ويحتوي فقط على الأسنان دون أي مساحات الجيوب الأنفية. في المقابل ، فإن الفك العلوي هو جزء من الجمجمة ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأعضاء والهياكل الأخرى ، وبالتالي هناك حاجة إلى تقسيم واسع النطاق من أجل تشريح عظم السنفية مع الأسنان المرتبطة بها.
باستخدام غرفة الرطوبة في المنزل إلى جانب نظام التحميل داخل عالية الدقة الصغرى CT التي تمكن تعزيز المرحلة، وضعنا طريقة لتصور الأنسجة الليفية الطازجة في 3D كما هو موضح سابقا9،18،19،20،21،22،23. يتم مسح الأنسجة الطازجة مباشرة بعد التضحية بالحيوان دون أي تلطيخ أو تثبيت ، مما يقلل من قطع الأنسجة وكذلك تعديلات الخصائص الميكانيكية الحيوية. ويمكن استخدام هذه البيانات 3D للتوزيع وتحليل اتجاه الألياف كما هو موضح في مكان آخر19.
ويستند الثاني 3D طريقة تصوير الأنسجة الكاملة المعروضة هنا على المقاصة البصرية من الفك السفلي الذي يتيح التصوير من ألياف PDL من خلال العظام دون أي تقسيم. ومن المثير للاهتمام أنه يتيح أيضا تصور ألياف الكولاجين من العظام نفسها، ولكن هذا لن يناقش هنا. بشكل عام، هناك طريقتان لإزالة الأنسجة. الأول هو المقاصة المائية حيث يتم غمر العينة في محلول مائي مع مؤشر انكسار أكبر من 1.4 إما من خلال الغمر البسيط أو الإماهة المفرطة أو تضمين الهيدروجيل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة في مستوى الشفافية وكذلك الحفاظ الهيكلي على الأنسجة ، وبالتالي تتطلب تثبيت الأنسجة. الطريقة الثانية التي تسفر عن عينات شفافة للغاية ولا تتطلب التثبيت هي طريقة المقاصة القائمة على المذيبات24،25. لقد قمنا بإنشاء طريقة مقاصة معدلة قائمة على المذيبات استنادا إلى الإيثيل-3-فينيلبروب-2-إينوات (إيثيل سينامات، ECi) للعينات الفكية. هذه الطريقة لديها مزايا استخدام غير سامة الغذاء الصف عامل المقاصة، والحد الأدنى من انكماش الأنسجة، والحفاظ على البروتينات الفلورية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد القومي للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية الصادرة عن اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة هارفارد (البروتوكول رقم 01840).
1. حركة الأسنان التقويمية
2. التصوير المقطعي الدقيق من ألياف PDL في الفك السفلي هيمي الطازجة
3. طريقة المقاصة (الشكل 3)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تقدم هذه الورقة طريقة لإنتاج OTM بالإضافة إلى طريقتين للتصوير ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين داخل PDL دون أي تقسيم. لأغراض البحث الحيواني ، عندما لا تكون محاذاة الأسنان ضرورية ، تعتبر حركة الأسنان تقويم الأسنان إذا كانت تولد إعادة عرض عظم السنفية على جميع مستويات الجذر. مطلوب مستوى القوة الثابتة المطبقة على الأسنان من أجل توليد OTM موثوق بها. هنا، يتم استخدام لفائف NiTi تنشيط شكل الذاكرة لتوليد قوة متسقة من 10 غرام طوال الوقت التجريبي من 7 أيام وما بعدها إذا كان ذلك مبررا. تفعيل لفائف وصفها هنا (الشك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
توليد OTM في الفئران مرغوب فيه للغاية بسبب الحجم وعلم الوراثة ومزايا المناولة. استخدام الفك السفلي يوفر سهولة التعامل مع كل من حيث تشريح الأنسجة وكذلك إعداد العينة والتصوير. هنا قدمنا طريقة لتوليد OTM مع حركة تحويلية من الأسنان داخل العظام في غضون 7 أيام من OTM. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تمديد المدة الإجمالية لحركة الأسنان ، لأن الملف المنشط يوفر مستوى قوة ثابت للحركة يصل إلى حوالي 1 مم. ومع ذلك ، يتم إصلاح الجانب المليطي من الملف إلى القاطع ، الذي يثور باستمرار. ونتيجة لذلك، فإن ناقلات القوة تتغير تدريجيا وتبدأ في ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة (NIDCR R00- DE025053، PI:Naveh). نود أن نشكر مركز هارفارد للتصوير البيولوجي على البنية التحتية والدعم. يتم إنشاء جميع الأرقام مع biorender.com.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1-مل BD Luer-Lok حقنة | BD | 309628 | |
| 1X فوسفات مخزن محلول ملحي | VWR علوم الحياة | 0780-10L | |
| 200 دليل على الإيثانول | VWR علوم الحياة | V1016 | |
| سبائك الألومنيوم 5019 سلك | Sigma-aldrich | GF15828813 | سلك قطره 0.08 مم ، طول 100 ، معتدل صعب. تستخدم كربط سلكي حول الضرس |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N / A | تستخدم لتحليل عمليات المسح المقطعي المحوسب الدقيقة |
| Castroviejo حاملات الإبر الدقيقة | أدوات العلوم | الدقيقة 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x / 1.0 ، CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N / A | تستخدم للتصوير التوافقي الثاني |
| مقبض المقبس المخروطي ، طرف واحد ، يدوي | G.Hartzell وابنه | 126-CSH3 | مقبض مرآة التفتيش |
| EC Plan-Neofluar 5x / 0.16 | Zeiss | 440321-9902 | تستخدم لتصوير الألواح الخفيفة |
| Elipar DeepCure-S LED ضوء | المعالجة 3M ESPE | 76985 | |
| أنابيب القفل الآمن Eppendorf ، 1.5 مل | Eppendorf | 22363204 | |
| إيثيل سينامات ، > = 98٪ | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| إبرة تحت الجلد ، 27 جم × 1/2 بوصة | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg / ml | Henry Schein Animal Health | NDC: 11695-0702-1 | |
| KIMWIPES ماسحات المهام الحساسة | Kimberly-Clark | 21905-026 (رقم كتالوج VWR) | تم شراؤها من |
| VWR LightSheet Z.1 نظام مجهر الإضاءة المزدوج | Zeiss | LightSheet Z.1 / LightSheet 7 | تستخدم لتصوير الألواح الخفيفة |
| LSM 880 NLO متعدد الفوتون المجهر | Zeiss | LSM 880 NLO | يستخدم للتصوير ثنائي الفوتون |
| MEGAmicro ، طائرة ، قطر 5 مم ، SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | MicroCT مرآة تspectrio للسطح |
| الأمامي ، MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science | Tools 17000-01 | |
| PermaFlo مركب قابل للتدفق | Ultradent | 948 | |
| منصة الإجراء | N / A | N / A | مصنوعة حسب الطلب من مواد المختبر |
| ميكروسكوب ستيريو روتيني M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi لفائف مفتوحة زنبرك | TOMY Inc. | يوفر ملف NiTi المغلق بقطر 0.15 مم بقطر ملف داخلي يبلغ 0.9 مم قوة 10 جرام. يمكن شراء منتجات مماثلة من Dentsply Sirona. | |
| سلك ربط من الفولاذ المقاوم للصدأ T-304 ، قطر 0.009 بوصة | تقويم | SBLW109 | 0.009 بوصة (.23 مم) ، مزاج ناعم |
| X-Ject E (زيلازين) 100 مجم / مل | هنري شاين لصحة | NDC: 11695-7085-1 | |
| Z100 تصالحي ، ظل A2 | 3M ESPE | 5904A2 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.