التصوير ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين PDL أثناء حركة تقويم الأسنان في نموذج مورين الفك السفلي

العملية البيولوجية الأساسية الكامنة في حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي إعادة عرض العظام. ويعزى الزناد لعملية إعادة عرض هذه التغييرات في هيكل الرباط اللثة (PDL) مثل الإجهاد خارج الخلية (ECM) ، نخر وكذلك تدمير الأوعية الدموية وتشكيل^1،2،3. ترتبط المحفزات المحتملة الأخرى لإعادة عرض العظام الحويصلات الشمسية باستشعار القوة بواسطة الخلايا العظمية في العظام ، وكذلك التشوه الميكانيكي للعظم الحويصلات الدموية نفسه ؛ لكن دورهم في OTM لا يزال غير توضيح كامل^4,5.

على الرغم من العديد من الدراسات التي تهدف إلى الكشف عن العلاقات بين هيكل وظيفة من PDL خلال OTM، آلية وظيفية واضحة لم يتم تعريفها^{بعد 6،7}. والسبب الرئيسي لذلك هو التحدي في استرجاع بيانات الأنسجة الرخوة (PDL) الموجودة بين اثنين من الأنسجة الصلبة (الاسمنت والعظام الحويصلات). عادة ما تتطلب الطرق المقبولة لجمع المعلومات الهيكلية التثبيت والقسمة التي تعطل وتعديل بنية PDL. وعلاوة على ذلك، فإن معظم هذه الطرق تسفر عن بيانات 2D التي حتى لو لم تكن مشوهة، تعطي معلومات جزئية ومترجمة فقط. وبما أن PDL ليست موحدة في هيكلها ووظيفتها ، فإن النهج الذي يعالج الهيكل ثلاثي الأبعاد السليم لمجمع الأسنان PDL-bone بأكمله له ما يبرره.

هذه الورقة سوف تصف طريقة لتوليد OTM في الفئران وطريقتين التي تمكن التصور 3D من ألياف الكولاجين في PDL دون أي تقسيم العينة.

وتستخدم نماذج مورين على نطاق واسع للتجارب في الجسم الحي في الطب والبيولوجيا التنموية وتسليم الأدوية والدراسات الهيكلية. ويمكن تعديلها وراثيا للقضاء على أو تعزيز بروتينات محددة وظيفة; أنها توفر سيطرة سريعة وقابلة للتكرار ويمكن التنبؤ بها التنمية; كما أنها سهلة الصورة نظرا لحجمها الصغير⁸. على الرغم من مزاياها العديدة ، لا تستخدم نماذج الماوس في أبحاث طب الأسنان بشكل متكرر ، خاصة عندما يكون هناك ما يبرر التلاعب السريري ، ويرجع ذلك في الغالب إلى الأسنان الصغيرة الحجم. نماذج حيوانية مثل الفئران^9،10،11، ال^12،13، الخنازير^14،15،16 والقرود¹⁷ تستخدم في كثير من الأحيان من الفئران. مع التطور الأخير لتقنيات التصوير عالية الدقة ، فإن مزايا استخدام نموذج الماوس لفك رموز العمليات المعقدة في OTM عديدة. تقدم هذه الورقة طريقة لتوليد حركة ميسالية للسن الضرس في الفك السفلي مع مستويات القوة الثابتة التي تؤدي إلى إعادة عرض العظام. تتم معظم تجارب OTM في القوارض في الفك العلوي ، لأن حركة الفك السفلي ووجود اللسان يضيفان مستوى تعقيد آخر. ومع ذلك ، فإن الفك السفلي له العديد من المزايا عندما يكون المطلوب السلامة الهيكلية ثلاثية الأبعاد. يمكن تشريحه بسهولة كعظم كامل. في بعض الأنواع يمكن فصله إلى اثنين من الفك السفلي هيمي من خلال السمفونية الليفية; وهو مدمج، شقة ويحتوي فقط على الأسنان دون أي مساحات الجيوب الأنفية. في المقابل ، فإن الفك العلوي هو جزء من الجمجمة ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأعضاء والهياكل الأخرى ، وبالتالي هناك حاجة إلى تقسيم واسع النطاق من أجل تشريح عظم السنفية مع الأسنان المرتبطة بها.

باستخدام غرفة الرطوبة في المنزل إلى جانب نظام التحميل داخل عالية الدقة الصغرى CT التي تمكن تعزيز المرحلة، وضعنا طريقة لتصور الأنسجة الليفية الطازجة في 3D كما هو موضح سابقا^{9،18،19،20،21،22،23}. يتم مسح الأنسجة الطازجة مباشرة بعد التضحية بالحيوان دون أي تلطيخ أو تثبيت ، مما يقلل من قطع الأنسجة وكذلك تعديلات الخصائص الميكانيكية الحيوية. ويمكن استخدام هذه البيانات 3D للتوزيع وتحليل اتجاه الألياف كما هو موضح في مكان آخر¹⁹.

ويستند الثاني 3D طريقة تصوير الأنسجة الكاملة المعروضة هنا على المقاصة البصرية من الفك السفلي الذي يتيح التصوير من ألياف PDL من خلال العظام دون أي تقسيم. ومن المثير للاهتمام أنه يتيح أيضا تصور ألياف الكولاجين من العظام نفسها، ولكن هذا لن يناقش هنا. بشكل عام، هناك طريقتان لإزالة الأنسجة. الأول هو المقاصة المائية حيث يتم غمر العينة في محلول مائي مع مؤشر انكسار أكبر من 1.4 إما من خلال الغمر البسيط أو الإماهة المفرطة أو تضمين الهيدروجيل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة في مستوى الشفافية وكذلك الحفاظ الهيكلي على الأنسجة ، وبالتالي تتطلب تثبيت الأنسجة. الطريقة الثانية التي تسفر عن عينات شفافة للغاية ولا تتطلب التثبيت هي طريقة المقاصة القائمة على المذيبات^24،25. لقد قمنا بإنشاء طريقة مقاصة معدلة قائمة على المذيبات استنادا إلى الإيثيل-3-فينيلبروب-2-إينوات (إيثيل سينامات، ECi) للعينات الفكية. هذه الطريقة لديها مزايا استخدام غير سامة الغذاء الصف عامل المقاصة، والحد الأدنى من انكماش الأنسجة، والحفاظ على البروتينات الفلورية.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد القومي للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية الصادرة عن اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة هارفارد (البروتوكول رقم 01840).

1. حركة الأسنان التقويمية

1. لتوليد سرير فأر، استخدم منصة بلاستيكية مسطحة مع مسند رأس على شكل إسفين بزاوية 45 درجة. يمكن إنشاء مسند الرأس عن طريق قطع صندوق بلاستيكي.
   1. رفع نهاية الرأس من المنصة لتوليد زاوية 30 درجة تقريبا بين مسند الرأس والطائرة الجدول. إرفاق مشبك ورق سميك عازمة (0.036 "في القطر) إلى نهاية الجانب الرأس لعقد القواطع العلوية.
   2. على نهاية الذيل، وتوليد سطح مرتفعة التي يمكن إرفاق سلسلة طاقة تقويم الأسنان لعقد القواطع السفلي. راجع الشكل 1 للحصول على مثال النظام الأساسي.
2. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من xylazine في 10 ملغ / كغ والكيتامين 100mg / kg باستخدام حقنة 1 مل وإبرة قياس 27.
3. ضع الماوس المخدر على النظام الأساسي المخصص وشل الفك العلوي عن طريق ربط القواطع العلوية على حلقة مشبك الورق. افتح الفك السفلي للفأرة مع سلسلة الطاقة التقويمية المكلبة على القواطع السفلية. الحفاظ على الخدين تراجع مع تراجع الفم القولونية المصغرة.
4. ضع المنصة تحت المجهر الجراحي أو أي مجسم آخر يمكن أن يصل إلى تكبير 5-6x.
5. تطبيق 50 ميكرولتر من المالحة (ما يقرب من 1 قطرة) على عيون الماوس لمنع جفاف القرنية. تجديد المالحة كل 20 دقيقة.
6. قطع قطعة من سلك الألومنيوم (0.08 مم قطر) 1 سم في الطول. حرك السلك من الجانب البوكال لغويا في المنطقة بين البروكسيمال خوار نقطة الاتصال بين الأضراس الأولى والثانية باستخدام حامل إبرة جراحية دقيقة. اترك حافة حرة مقاس 2 مم أمام أول ضرس لكي يتم ربطها في نهاية الربيع.
7. قطع قطعة من التيتانيوم النيكل (NiTi) لفائف، حوالي 7 إلى 9 خيوط في الطول.
   ملاحظة: الخصائص المرنة لللفائف ستوفر قوة ثابتة لحركة تقويم الأسنان. يجب أن يكون الطول الإجمالي غير المدرب لللفائف أقصر من الفجوة بين القاطع والضرس. نضع في اعتبارنا أن هناك حاجة إلى 2 المواضيع إضافية على كل نهاية لفائف مرساة إلى الأسنان. يتم اختيار سلك الألومنيوم من أجل الحد من القطع الأثرية المسح الضوئي مثل تصلب شعاع أثناء التصوير المقطعي المصغر.
8. إدراج NiTi لفائف الربيع (0.15 مم قطر السلك، 0.9 مم قطر لفائف الداخلية؛ يسلم قوة من 10 غرام) بين الضرس الأول السفلي والقواطع السفلية. استخدام رباط الأسلاك إدراجها حول الضرس الأول في الخطوة 1.6، تطور السلك بإحكام حول 2 المواضيع من الربيع لفائف لإصلاح لفائف على الجانب الضرس.
9. لضمان مستوى القوة الموحدة، استخدم تماما 3 خيوط نشطة بين الضرس الأول والقاطع. إزالة مؤقتا سلسلة الطاقة من القاطع وحلقة 2 إلى 3 المواضيع غير المدربة على القاطع لترسيخ لفائف. الشريحة المواضيع وصولا الى هامش gingival حرة القاطع.
10. وضع طبقة من الراتنج مركب قابلة للتدفق على الحدود القاطعة لللفائف وعلاجه مع ضوء علاج الأسنان. استبدال سلسلة الطاقة بعد علاج الراتنج.
11. باستخدام نفس ضوء المعالجة، تسخين لفائف NiTi لمدة 20 s. وهذا سوف تشديد لفائف NiTi. يظهر الموضع النهائي الشكل 1C.
12. إما ترك الجانب المقابل سليمة أو إدراج صورية مثل السلك بين الأضراس الأولى والثانية.
13. ضع الماوس المخدر تحت ضوء ساخن للحفاظ على الماوس دافئا حتى التعافي.
14. ضع الماوس مرة أخرى في قفص فردي وراقبه يوميا. لا يلزم تغيير النظام الغذائي أثناء حركة تقويم الأسنان.
    ملاحظة: جهاز OTM على جانب واحد يسبب بعض الانزعاج ولكن لا يضعف التغذية. ومع ذلك، لا ينصح إدخال الأجهزة على كلا الجانبين بسبب كمية إضافية من عدم الراحة. لا يلزم تناول أدوية الألم ما لم تظهر علامات الألم الخارجية.

2. التصوير المقطعي الدقيق من ألياف PDL في الفك السفلي هيمي الطازجة

1. تركيب هيمي الفك السفلي (الشكل 2)
   1. بعد المدة المرغوبة لحركة تقويم الأسنان ، ضحي بالفأر عن طريق خلع عنق الرحم. إزالة الفك السفلي وفصلها إلى الفك السفلي هيمي.
      ملاحظة: بما أن العينة لن تكون ثابتة، فمن المهم جدا إجراء تشريح الفك وتركيبه في أقرب وقت ممكن، وبشكل مثالي في غضون 30 دقيقة.
   2. إزالة الأنسجة الرخوة المحيطة بلطف مع مسح نظيفة خالية من الوبر.
   3. إزالة جهاز تقويم الأسنان باستخدام مقص مجهري وملاقط تحت مجهر ستيريو مع التكبير 4x على الأقل.
   4. حافظ على رطوبة العينة في حجم 1.5 مل، أنبوب طرد مركزي صغير إلى جانب قطعة من المسح الخالي من الوبر مبللة بالماء.
   5. ضع راتنج الأسنان المركب القابل للحزم في فتحة العينة على المسرح ، ثم ضع الهيمي الفك السفلي الطازج في المركب. قبل تركيب تأكد من أن سطح العظام في اتصال مع مركب الأسنان خالية من أي أنسجة لينة وجافة، وإلا فإن مركب الأسنان لا علاج بشكل صحيح.
   6. ضبط موقف هيمي الفك السفلي حتى يتم توسيط الضرس الأول في الأخدود خط الوسط من المرحلة. تأكد من أن سطح الانسداد أفقي. علاج المركب عندما راض عن تحديد المواقع.
      ملاحظة: يمكن وضع كميات صغيرة إضافية من مركبات الأسنان على جانبي الفك السفلي و / أو عبر القاطع للمساعدة في تثبيت العينة.
   7. ضع مسحا مبللا خاليا من الوبر داخل برك الرطوبة في مرحلة العينة. ضع مركب الأسنان على سطح الانسداد من الضرس الأول. قبل إغلاق الغرفة، تأكد من عدم وجود أي شيء يمنع مسار الأشعة السينية على مستوى العينة.
   8. ألصق الغرفة في مقطع مقطعي صغير. المسمار الغرفة في مرحلة عينة التصوير المقطعي الدقيق بحيث يتم تقليل الحركة أثناء التصوير.
   9. بدوره على الأشعة السينية واتخاذ الصور 2D في حين خفض سندان عموديا، حتى يتم إحاطة غيض من سندان من قبل المركب ولكن لم يتم الكشف عن أي زيادة في القوة.
   10. بمجرد أن يتم تضمين سندان في المركب، أغلق مصدر الأشعة السينية. ثم افتح غرفة التصوير المقطعي المصغر وعالج المركب من خلال نافذة زجاج شبكي واضحة.
2. إعدادات التصوير المقطعي المصغر
   1. تعيين الجهد المصدر إلى 40 كيلو فولت والتيارات إلى 200 μA. باستخدام كاشف التكبير 10x، ضع العينة داخل إطار الرؤية. استخدم binning من 2 للصور الملتقطة.
      ملاحظة: نظرا لأن PDL أقل كثافة بكثير من العظام والأسنان ، فإن تصور PDL يتطلب طاقة أعلى ووقت تعرض أعلى. سيوفر هذا البروتوكول إعدادات تصور PDL.
   2. تعيين وقت التعرض لصورة واحدة إلى 25 s. تعيين دوران مرحلة العينة إلى نطاق 183 درجة أو أكثر. تعيين المسح الضوئي ل 2500 التوقعات. لا تستخدم أي مرشح مصدر الأشعة السينية، والمسح الناتج لديها حجم voxel من 0.76 ميكرومتر على كل جانب.
   3. جمع مسح مرجعي لإعادة الإعمار السليم وفقا للمبادئ التوجيهية التصوير المقطعي الدقيق. استخدم 1/3 عدد الصور المرجعية كإسقاطات إجمالية. أعد بناء وحدة التخزين بدون إعادة تركيب إضافية، باستخدام خوارزمية تمت تصفيتها من الإسقاط الخلفي.

3. طريقة المقاصة (الشكل 3)

1. إعداد خمسة أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل.
2. إعداد 1.4 مل من الحلول التالية في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل: 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) في ملحي الفوسفات المخزنة (PBS)، و 50٪ الإيثانول (EtOH) في المياه الديونة (DI)، و 70٪ EtOH في مياه DI، وأنابيب من 100٪ EtOH.
   ملاحظة: يستخدم PFA لتثبيت العينة. كما ستعمل عملية مسح ECi على عينات غير مثبتة. لمسح العينات غير المثبتة، ما عليك سوى تخطي خطوة PFA.
3. مكان تشريح هيمي الفك السفلي في 4٪ PFA. تغطية مع رقائق الألومنيوم ومكان على الروك على الإعداد لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعة.
4. نقل هيمي الفك السفلي إلى 50٪ EtOH. وضعه على الروك مغطاة من الضوء لمدة 16 ساعة.
5. نقل هيمي الفك السفلي إلى 70٪ EtOH. وضعه على الروك مغطاة من الضوء لمدة 16 ساعة.
6. نقل هيمي الفك السفلي إلى 100٪ EtOH. وضعه على الروك مغطاة من الضوء لمدة 16 ساعة.
7. كرر 3.6. في أنبوب EtOH 100٪ الثاني.
8. إعداد 5 مل من ECi في أنبوب زجاجي أو البولي بروبلين.
   ملاحظة: ECi يذوب البوليسترين، ولكن ليس البولي بروبلين. أيضا، إذا لم يكن استخدام الأنسجة مع البروتينات الفلورية يمكن أن تتعرض العينة للضوء أثناء إجراء المقاصة.
9. نقل هيمي الفك السفلي إلى أنبوب ECi. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم ومكان على الروك على الإعداد لطيف لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين العينة المجففة في ECi في درجة حرارة الغرفة. درجة التجمد أو الانصهار في ECi هي 6.5 إلى 8.0 درجة مئوية. لا تخزن عند 4 °C .
10. وهيمي الفك السفلي على استعداد للتصوير مع المجهر الفلوري.
    ملاحظة: أثناء التصوير، يجب أن تكون العينة مغمورة في ECi لتبقى شفافة بصريا.

تقدم هذه الورقة طريقة لإنتاج OTM بالإضافة إلى طريقتين للتصوير ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين داخل PDL دون أي تقسيم. لأغراض البحث الحيواني ، عندما لا تكون محاذاة الأسنان ضرورية ، تعتبر حركة الأسنان تقويم الأسنان إذا كانت تولد إعادة عرض عظم السنفية على جميع مستويات الجذر. مطلوب مستوى القوة الثابتة المطبقة على الأسنان من أجل توليد OTM موثوق بها. هنا، يتم استخدام لفائف NiTi تنشيط شكل الذاكرة لتوليد قوة متسقة من 10 غرام طوال الوقت التجريبي من 7 أيام وما بعدها إذا كان ذلك مبررا. تفعيل لفائف وصفها هنا (الشكل 1) يولد سلالة في لفائف NiTi داخل المرحلة martensitic ويجلب لفائف لحالة التنويم المغناطيسي، الذي يسلم الإجهاد المستمر على الأسنان. ارتفاع درجة حرارة لفائف مع ضوء المعالجة بعد الإدراج لفائف سوف نتأكد أيضا من سبيكة سوف تتحول إلى شكلها الأوستينية وتأثير الذاكرة الشكل سوف يحدث.

هنا نعرض نتائج تمثيلية من الفئران الذكور البالغة من العمر 9 أسابيع. يبلغ متوسط المسافة المتوسطة بين تيجان الأضراس الأولى والثانية بعد 7 أيام من OTM 40 ميكرومترا كما تقاس بين الأسطح بين البروكسية للضرس في الأشعة المقطعية الدقيقة مع تكبير 1X (n = 12 ، st.dev. = 15 ميكرومترا) (الشكل 1E). متوسط مساحة PDL في الاتجاه المتوسط هو 80 ميكرومتر قبل وبعد 7 أيام من OTM (الشكل 4B). وهذا يؤكد أن أول الضرس المترجمة mesially و 7 أيام هو الوقت المناسب لتوليد OTM في نموذج الماوس في حين توليد عمليات ارتشاف العظام وapposition في الطبيعة (الشكل 4). تم تغذية الفئران نظام غذائي قياسي من البليت الثابت. لم يتم إجراء أي تغيير في النظام الغذائي بعد إدخال الجهاز.

الطريقة الأولى التي قدمت لتصور التغيرات في مجمع الأسنان PDL العظام خلال OTM يستند إلى مرحلة تعزيز التصوير المقطعي الدقيق للأنسجة الطازجة (الشكل 4) الذي وصف بالتفصيل سابقا9،18،19،20،22،23. باختصار، قدمت قدرة تعزيز المرحلة إما مصغرة CT أو السنكروترون، الاستقرار الميكانيكي للأنسجة الليفية والبيئة الرطبة، يمكن تصور الألياف الكولاجينية الطازجة دون أي تثبيت أو عوامل متناقضة. في PDL الألياف التي ينظر إليها هي تلك التي ترتبط كل من الأسنان والعظام، وأساسا نوع I الكولاجين19. هذه الفرصة الفريدة لتصور في 3D PDL سليمة تمكن تحليل كثافة الألياف 3D، توجه الألياف، فضلا عن حركة 3D من الأسنان كما هو موضح سابقا9،19. على وجه التحديد ، هنا نقدم التصور للشبكة الليفية في PDL. في الوقت 0 ، يمكن ملاحظة إعادة عرض الفسيولوجية في كل من العظام وPDL. إعادة عرض يحدث أيضا في الاسمنت الخلوية; ومع ذلك، لا يرتبط هذا مباشرة إلى الطريقة المعروضة، وبالتالي لن يتم تفصيل. واجهة العظام PDL هو في الغالب على نحو سلس على حد سواء في عرضية (الشكل 4A) ومترهل (الشكل 4B) الطائرات قبل أي تطبيق القوة. في المستوى التاجي (الشكل 4C)، واجهة العظام PDL هو أكثر خشونة وخاصة نحو المنطقة apical التي قد تكون مؤشرا على التوازن إعادة عرض يميل نحو ارتشاف. في 3 أيام من OTM (الشكل 4D-F)، الذي يتم نقل الضرس الأول mesially (يتم تمثيل الاتجاه من قبل السهم متقطعة)، يتم تقليل كثافة الألياف في PDL (رؤوس الأسهم البيضاء). واجهة العظام PDL هو أقسى من 0 أيام بسبب تطور الحفر في سطح العظام التي تدل على نشاط العظام وعمليات ارتشاف العظام المرتبطة أساسا قوى الضغط في PDL26، ولكن هنا ينظر في مناطق التوتر في 3 أيام. واقترح تدمير الأنسجة في مناطق التوتر داخل PDL27،28 ويمكن أن ينظر إليه بوضوح باستخدام هذه الطريقة. وينظر إلى الحدود الخام على مستويات مختلفة من الجذور (السهام البيضاء) ، وبالتالي يشير إلى أن حركة الأسنان هي ترجمة في طبيعتها وليس مجرد ترجيح التاج. في 7 أيام من OTM (الشكل 4G-I)، علامات ارتشاف العظام، مثل الحفر داخل العظام، والحدود الخام والتوسع في الفضاء PDL، وينظر في جميع الطائرات ولكن متوسط مساحة PDL أضيق مما كانت عليه في 3 أيام من OTM (الشكل 4D-F). في بعض المناطق ومع ذلك، أصبحت الحدود بين العظام وPDL أكثر سلاسة بعد 7days من OTM وتقع هذه المناطق على الأسطح البعيدة من الجذور، والتي هي على الأرجح مؤشرا على apposition العظام، كما هو متوقع في OTM إلى الاتجاه السطالي.

نظرا لوقت التصوير المقطعي الدقيق الطويل (~ 19 ساعة) ودوران المرحلة ، فإن تركيب العينة أمر ضروري للحفاظ على العينة ثابتة. العينة الغير مستقرة ستؤدي إلى مسح ضبابي يعرض الشكل 5 كيف يبدو التصوير المقطعي المصغر عندما تتحرك العينة أثناء الفحص. الأسنان والعظام ضبابية. لا لوحظت ألياف PDL ولا الخلايا العظمية. في مثل هذه الحوادث هناك صورة ظلية موجودة حول هامش الكائن. في الشكل 5، يمكن ملاحظة الخطوط العريضة المتعددة لتاج الأسنان (السهام).

اعتمادا على هدف البحث، قد يتم التضحية القرار والتصور من ألياف PDL في التجارة لوقت أقصر المسح الضوئي عندما يتم المطلوب فقط معلومات عن الأنسجة الصلبة.

طريقة تكميلية للتصور 3D من ألياف PDL دون أي تقسيم عن طريق المجهر البصري على عينات مسح بصريا باستخدام ECi (الشكل 3). يمكن استخدام هذه الطريقة على عينة دون تثبيت وتحافظ على إشارات الفلورسنت الموجودة في الأنسجة قبل التطهير. يتم عرض الفك السفلي Hemi قبل وبعد مسح ECi في الشكل 3B و 3C. يمكن تأكيد مسح العينة الكافية من PDL عندما يمكن رؤية ورقة الشبكة من خلال راموس الفك السفلي. يمكن تعديل كمية المقاصة عن طريق إطالة عملية الجفاف. يظهر الشكل 6 إشارة الجيل التوافقي الثاني (SHG) من ألياف الكولاجين في كل من عظم السنفات وPDL في الفك السفلي المطهي. تصوير ألياف الكولاجين في العظام في 3D هو عملية معقدة، والتي غالبا ما تستخدم أساليب المجهر الإلكتروني مثل FIB / SEM. ومع ذلك ، باستخدام طريقة المقاصة القائمة على ECi وSHG ، ينظر بوضوح إلى ألياف العظام الحويصلات ، خاصة في الاتجاه الأفقي. عند ترجمة من خلال عينة عميقة في PDL من سطح العظام، والانتقال إلى مستوى الألياف PDL واضح جدا كما الألياف تغيير اتجاهها فجأة إلى واحد عمودي.

ويمكن أيضا أن تستخدم المجهر Lightsheet لتصوير البروتينات الفلورية من خلال العظام. في هذه الحالة من عينة مسح من Flk1-creالمعدلة وراثيا ; Tdtomato الماوس19,29,30, ويلاحظ بوضوح الخلايا البطانية الفلورية بطانة الأوعية الدموية ( الشكل7A,ب, ج, ه). المقاصة المناسبة هي المفتاح لتوليد صور مفهومة مع المجهر ورقة الضوء. عندما لا يتم مسح العظام تماما، لم يلاحظ الأوعية الدموية داخل PDL(الشكل 7D، F).

الشكل 1:إعداد إدخال جهاز تقويم الأسنان. أ. سرير الماوس مصنوعة من العرض مختبر لدعم الحيوان والحفاظ على الفم مفتوحة. منصة بلاستيكية (PP) للجسم على منحدر 30 درجة ومسند الرأس (HR) على زاوية 45 درجة من سطح PP. يستخدم حامل أنبوب من مستويين (TS) لرفع رأس نهاية PP. ترسي حلقة مشبك الورق (السهم الأسود) القواطع العلوية، وخطافات سلسلة الطاقة التقويمية السفلية (السهم الأبيض) على القواطع السفلية. 5 مم قطرها مرآة التفتيش كان يستخدم للتفتيش البصري للأضراس. باء - ال 20 في المائ منظر جانبي لسرير الماوس. يتم وضع علامة على الزوايا بين الأسطح (الأخضر والأرجواني). جيم - الدوائر التي لا يمكن أن صورة تمثيلية للجهاز الذي تم وضعه بشكل صحيح. د- الأضراس ينظر من خلال مرآة التفتيش قبل زرع الجهاز. هاء - ال هاء صورة تمثيلية من الأضراس بعد حركة تقويم الأسنان. خطوط متقطعة تتبع المخطط التفصيلي للضرس الأول والثاني. واو - ال و- ال و. رسم تخطيطي للجهاز وموضعه. يمثل الخط الأحمر ربط السلك حول أول ضرس. يمثل الخط البرتقالي الراتنج المركب القابل للتدفق المستخدم لترسيخ الملف. يظهر ملف NiTi باللون الأزرق ومسمي. زاي - 1- ال 1 تشريح هيمي الفك السفلي مع الجهاز المرفقة بعد حركة تقويم الأسنان لمدة 7 أيام. لاحظ كيف أن خيوط 3 لفائف لا تزال مفتوحة، مما يشير إلى أن الملف لا يزال نشطا بعد 7 أيام. مقياس الشريط = 1 مم في E و G. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: هيمي الفك السفلي شنت في غرفة مصنوعة خصيصا للتصوير المقطعي الدقيق. وينظر إلى مصدر الأشعة السينية على اليسار وكاشف على اليمين. مستطيل أحمر يحدد هيمي الفك السفلي التي شنت في الغرفة على مرحلة عينة (SS). غرفة المثال المعروضة هنا هي جزء من مجموعة اختبار ميكانيكية ، بما في ذلك المحرك (M) ، السندان (A ، المبينة بخطوط بيضاء متقطعة) ورمح السندان (AS) فوق الغرفة. يتم مشدود الإعداد الكامل على مرحلة CT. تظهر الصورة الداخلية صورة مقربة للمنطقة الحمراء المبينة، تحتوي على غرفة الرطوبة مع عينة بداخلها. باء - ال 20 في المائ أعلى عرض عينة محمولة على مرحلة العينة. حمامات الرطوبة (السهم الرمادي) مدمجة في محيط للحفاظ على الرطوبة أثناء التصوير. على المسرح الدائري في الوسط ، يمكن تركيب هيمي الفك السفلي في الأخدود العميق المائل (السهم الأسود). أخدود رقيقة (السهم الأبيض) علامات خط الوسط من المرحلة للمساعدة في توجيه العينة. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن رسم تخطيطي للمرحلة الدائرية مع عينة الأخدود. يدعم ميل الأخدود الفك السفلي ويسمح بتركيب الأضراس على طول المحور الرأسي للجذور. د- ممثل مصغرة CT 2D شريحة جنبا إلى جنب مع صورة حجم 3D من عينة هيمي الفك السفلي. الفجوة بين الكواكب هنا هي 52 ميكرومتر. يتم تركيب العينة على مرحلة العينة أدناه (غير مبين) والسندان (A) في الأعلى بواسطة مركب الأسنان (DC). مقياس الشريط = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. طريقة المقاصة المستندة إلى ECi للفك السفلي للفأرة المتشرذم. أ. يتم غمر الهيمي الفك السفلي تشريح في 4٪ PFA، 50٪ EtOH، 70٪ EtOH، و 100٪ EtOH على التوالي. بعد الجفاف، يتم تخزين الفك السفلي الهيمي في ECi لمدة لا تقل عن 12 ساعة حتى التصوير. باء - ال 20 في المائ هيمي الفك السفلي مباشرة بعد تشريح. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن هيمي الفك السفلي بعد الانتهاء من المقاصة. أشرطة المقياس = 5 مم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4:تمثيلي في الموقع التصوير المقطعي الدقيق من PDL عينة جديدة في مراحل مختلفة من حركة تقويم الأسنان. A-C، لا حركة تقويم الأسنان. أ. صورة مصغرة CT 2D في الطائرة العرضية للهيمي الفك السفلي تظهر الجذور النخاعية (M) وال البعيدة (D) داخل عظم الحويصلات ، B-Buccal ، L-Lingual الجانبين من عظم الحويصلات. بين جذور الأسنان والعظام السنية ، لوحظ بوضوح مساحة PDL والألياف داخلها. B. صورة 2D في الطائرة القوس. C. صورة 2D في الطائرة التاجية. D-E، صور 2D بعد 3 أيام من OTM، رؤوس الأسهم نقطة في مناطق في PDL مع انخفاض في كثافة ألياف الكولاجين، والسهام البيضاء نقطة في مناطق ارتشاف العظام. G-I، صور 2D بعد 7 أيام من OTM، الأسهم السوداء تشير إلى مناطق من apposition العظام. أشرطة المقياس = 150 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صورة 2D الصغرى CT في الطائرة القوس، والتي تبين هياكل ضبابية من كل من الأسنان والعظام بسبب حركة الأسنان أثناء المسح الضوئي. تشير الأسهم إلى خطوط لوح متعددة من السن ، مما يشير إلى حركته. شريط مقياس 150 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: مسح ECi الفك السفلي تظهر أول الضرس المصورة مع الجيل التوافقي الثاني (SHG). نقاط السهم الأبيض في منطقة حيث ينظر إلى ألياف الكولاجين من PDL، لاحظ الاتجاه الرأسي، والسهام السوداء نقطة في منطقة حيث ينظر إلى كل من الألياف الرأسية من PDL وكذلك الألياف الأفقية للعظم الحويصلات. تي الأسنان، F-furcation، AB-alveolar العظام، MR-الجذر السطالي، DR-الجذر القاصي، شريط مقياس 150 ميكرومتر. تم الحصول على الصور باستخدام عدسة 20X متعددة الغمر للحلول مع RI من 1.33-1.56. تم تعيين ليزر الإثارة في 860nm في السلطة 10٪. بكسل وقت المسكن: 0.51μs; وضع المسح الضوئي: إطار; المتوسط: 16؛ 16؛ 16؛ 16؛ 16؛ نوع الكاشف: كاشف أنبوب المولاتيل الضوئي غير المفبرك؛ كاشف كسب 800V. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7. صور المجهر Lightsheet من ECi تطهيرها Flk1-Cre; tdTomato الماوس. أ. تطهيرها على النحو الأمثل السيطرة هيمي الفك السفلي. شبكة الأوعية الدموية داخل العظام (رأس السهم) ومساحة PDL (السهم) مرئية. باء - ال 20 في المائ inset من المنطقة المتوسطة من الضرس الأول (الأحمر المبين في A) يظهر الأوعية الدموية. C. تطهيرها على النحو الأمثل 7 أيام OTM هيمي الفك السفلي وD. دون المستوى الأمثل مسح هيمي الفك السفلي. هاء - ال هاء صورة ثنائية الأبعاد للوحة C في الطائرة القوسية ، توضح الصورة الأوعية الدموية المحددة جيدا في العظام (السهم الرمادي) ومساحة PDL (السهام البيضاء). واو - ال و- ال و. صورة شريحة ثنائية الأبعاد للوحة D، وهي نفس المنطقة التي تظهر فيها الصور في E، مما يؤدي إلى صورة ضبابية. أشرطة مقياس A، C، D = 500 ميكرومتر، B، E، F = 100 μm تم التقاط الصور مع هدف خطة 5X، وذلك باستخدام الكاميرا ككاشف. وكان ليزر الإثارة 561 نانومتر في 4٪ السلطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.