يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق في الخلايا العصبية الحسية الشمية للفأر المنشط عن طريق التلوين المناعي المشترك والتهجين في الموقع

989 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62150

⸱

أبريل 11, 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

في هذه المقالة

ملخص

يجمع هذا البروتوكول بين التهجين في الموقع والتألق المناعي لتحديد جينات المستقبلات الشمية والقيلية المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية الشمية بعد التنشيط بواسطة المحفزات الكيميائية في الفأر.

الملخص

تعتمد على الاتصالات الكيميائية لنقل المعلومات البيئية ذات الصلة وإدراكها ، بدءا من تقييم جودة الغذاء إلى اكتشاف شركاء التزاوج أو التهديدات المتاحة. في الفئران ، يتم تنفيذ هذه المهمة بشكل أساسي بواسطة نظام حاسة الشم وأنظمته الفرعية الأساسية ، بما في ذلك أنظمة حاسة الشم الرئيسية والملحقة. كلاهما لهما أعضاء طرفية مأهولة بالخلايا العصبية الحسية التي تعبر عن مستقبلات مقترنة ببروتين G قادرة على ربط الإشارات الكيميائية التي تصل إلى تجويف الأنف. على الرغم من أن الخصائص الجزيئية لهذه المستقبلات مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن الروابط المحددة المشابهة. تجمع الطريقة الموضحة هنا بين الكشف عن التهجين في الموقع للمستقبلات الشمية أو الحمض مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوسومي الفسفوري S6 (pS6) - علامة على تنشيط الخلايا العصبية. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا العصبية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض لمحفزات كيميائية منقاة أو معقدة تكتشفها الأعضاء الشمية. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية بالتحقيق في الخلايا العصبية التي يتم تشغيلها في السياقات ذات الصلة بيولوجيا. من الناحية المثالية ، يجب استخدام هذه الطريقة لاستكشاف البيولوجيا الجزيئية للنظام الشمي ودراسة السلوكيات الشمية.

المقدمة

الإشارات الكيميائية هي أكثر أشكال الاتصال انتشارا في. في الثدييات ، يتم الكشف عن الإشارات الكيميائية بشكل أساسي من خلال حاسة الشم وهو أمر بالغ الأهمية للعثور على الطعام ، وتحديد شركاء التزاوج المحتملين ، وتجنب المفترسةالمحتملة 1،2،3. ينقسم نظام حاسة الشم بالماوس أيضا إلى أنظمة فرعية مختلفة ، لكل منها خصائصها التشريحية والفسيولوجية والجزيئية4. من بين هؤلاء ، يعد نظام حاسة الشم الرئيسي (MOS) ونظام حاسة الشم الملحقة (AOS) الأكثر دراسة على نطاق واسع وأفضل.

MOS مسؤول في الغالب عن الكشف عن الجزيئات الكيميائية المتطايرة التي تصل إلى تجويف الأنف. يتم تحقيق ذلك عن طريق الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) ، التي تملأ الواجهة الحسية للنظام - الظهارة الشمية الرئيسية (MOE). يعبر كل OSN عن واحد من آلاف المستقبلات الشمية (ORs) بطريقة أحادية الجين وأحاديةالأليل. علاوة على ذلك ، تميل ORs إلى أن تكون مضبوطة على نطاقواسع 6 ، وقد يرتبط رائحة واحدة بأكثر من OR ، مما يولد رمزا توافقيا للروائح7.

في المقابل ، فإن AOS مسؤول بشكل أساسي عن الكشف عن الفرمون والكايرومون. تعمل هذه الروابط على تنشيط الخلايا العصبية الحسية الصوتية (VSNs) في العضو الصوتي (VNO). تعبر شبكات VSNs في المنطقة القمية عن مستقبلات VNO من عائلة المستقبلات الصوتية 1 (V1Rs)8 ، بينما تعبر الخلايا العصبية في المنطقة القاعدية عن عائلة المستقبلات الصوتية 2 (V2Rs)9. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن بعض VSNs تشارك في التعبير عن أكثر من مستقبلات صوتية10،11،12.

على الرغم من جميع المعلومات المتاحة حول الخصائص الجزيئية ل ORs و VRs ، إلا أن المعرفة حول الروابط المماثلة لها لا تزال محدودة للغاية. يعد تحديد الخلايا العصبية الشمية المحددة المسؤولة عن اكتشاف جزيء أو محفز معقد مهمة مهمة لأولئك الذين يبحثون في حاسة الشم والسلوكيات التي يحركها حاسة الشم والاستجابات الفسيولوجية. تمت محاولة العديد من الاستراتيجيات لنزع التيمات من المستقبلات الشمية ، بما في ذلك تصوير الكالسيوم7 ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية13،14 ، وتعبير المستقبلات غير المتجانسة15 ، والاستراتيجيات القائمة على الجينات المبكرة الفورية (IEGs) 16. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بعض التقنيات لتقييم التأثيرات المعدلة للروائح في الخلايا العصبية الحسية ، باستخدام تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 17،18 واستراتيجيات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ببروتينالفلورسنت 19. تتطلب معظم هذه التقنيات إعدادا اصطناعيا أو يتم إجراؤها على الخلايا العصبية المنفصلة ، مما يجعل من المستحيل تقييم السلوكيات التي تسببها الروائح المستخدمة في وقت واحد.

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتحديد الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض للرائحة ، من خلال الجمع بين الريبوبرابات التي تكتشف ORs أو VRs مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوزومي S6 الفسفوري (pS6) ، وهو وكيل للتنشيط العصبي. هذه الطريقة هي طريقة موثوقة للتحقيق في هوية الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة إشارات كيميائية مختلفة في سياق ذي صلة بيولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول # 1883-1 ، المعتمد من قبل جامعة كامبيناس (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في معهد الأحياء - لجنة الأخلاقيات في استخدام في البحث) ، والذي يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الوطني الفيدرالي للتحكم في تجارب (CONCEA).

1. تحضير المواد

  1. قم بإعداد 1 لتر من 3٪ H2O2 (v / v) في 1x PBS. خفف 100 مل 10× PBS و 100 مل من 30٪ H2O2 في 500 مل من الماء عالي النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
  2. قم بإعداد حجرة مرطبة تحتوي على قطع من مناديل المختبر الخالية من النسالة المبللة بمحلول 5× SSC.
  3. تحضير محاليل غسيل التهجين: 5× SSC (عند 55 درجة مئوية) ، 2× SSC (55 درجة مئوية) ، 0.2× SSC (55 درجة مئوية) و 0.1× SSC (55 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة). قم بإذابة الكميات المناسبة من محلول مخزون SSC 20× في ماء فائق النقاء خال من RNase. تحضير المحاليل المخففة طازجة قبل بدء كل تجربة.
  4. تحضير محلول حجب الكيمياء المناعية: 1× PBS / 1٪ BSA / 0.1٪ Triton X-100. بالنسبة إلى 100 مل ، قم بتخفيف 10 مل من 10× PBS ، و 10 مل من 10٪ BSA و 3.33 مل من 3٪ Triton X-100 في 70 مل من الماء عالي النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. تحضير المحاليل المخففة طازجة قبل بدء كل تجربة.
  5. تحضير محلول PTw: 1× PBS / 0.1٪ Tween-20. للحصول على 100 مل ، قم بتخفيف 1 مل من 10٪ Tween-20 و 10 مل من 10× PBS في 70 مل من الماء فائق النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
  6. تحضير محلول ثلاثي إيثانول أمين 0.1 متر خال من RNase. للحصول على 250 مل ، قم بتخفيف 3.33 مل من ثلاثي إيثانول أمين من فئة الكاشف في 200 مل من الماء فائق النقاء الخالي من RNase تحت التحريك (استخدم الأواني الزجاجية الخالية من RNase والنمام المغناطيسي عند تحضير هذا المحلول). اضبط درجة الحموضة على 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. أكمل مستوى الصوت بماء فائق النقاء خال من RNase واحفظه محميا من الضوء حتى الاستخدام. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
  7. قم بإعداد 0.1٪ H2O2 (v / v) خال من RNase في 1× PBS. للحصول على 1 لتر ، قم بتخفيف 100 مل من 10× PBS و 3.3 مل من 30٪ H2O2 في 500 مل من الماء فائق النقاء الخالي من RNase. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء الخالي من RNase. قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
  8. تحضير محاليل خالية من RNase لما يلي: 0.2 M HCl ؛ 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0 ؛ 10 مجم / مل خميرة tRNA ؛ 10٪ SDS ؛ 10× برنامج تلفزيوني ؛ 100× حل دينهاردت. 20× SSC; 50٪ كبريتات ديكستران 6 م حمض الهيدروكلوريك
  9. تحضير محلول مثبت 4٪ بارافورمالدهيد خال من RNase. للحصول على 100 مل ، قم بإذابة 4 جم من بارافورمالدهيد في 80 مل من 1× PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 10 M هيدروكسيد الصوديوم. أكمل مستوى الصوت ب 1× PBS. يجب تحضير هذا الحل طازجا قبل بدء كل تجربة.
    أنذر: بارافورمالديهايد مادة خطرة يمكن أن تسبب ضررا إذا تم استنشاقها. قم بإعداد المحلول تحت غطاء الدخان وارتداء القفازات الواقية والقناع ونظارات السلامة.
  10. تحضير محلول تشريح خال من RNase: 30٪ سكروز / 0.45 م EDTA درجة الحموضة 8.0 / 1× PBS. للحصول على 100 مل ، قم بإذابة 30 جم من السكروز في 60 مل من 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 الخالي من RNase. أضف 10 مل من 10× PBS. أكمل مستوى الصوت ب 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 الخالي من RNase.
  11. قم بإعداد أسطوانات وأكواب زجاجية أو بلاستيكية متدرجة خالية من RNase.
  12. تحضير محاليل التهجين والتهجين المسبق الخالية من RNase: 50٪ فورماميد منزوع الأيونات (حجم / حجم) / 600 ملي كلوريد الصوديوم / 200 ميكروغرام / مل خميرة الحمض النووي الريبي / 0.25٪ SDS (وزن / حجم) / 10 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 / 1× محلول دينهاردت / 1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 / 10٪ كبريتات ديكستران (وزن / حجم). للحصول على 10 مل في أسطوانة متدرجة ، أضف 5 مل من الفورماميد منزوع الأيونات ، و 1.2 مل من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 200 ميكرولتر من 10 مجم / مل من الخميرة tRNA ، و 250 ميكرولتر من 10٪ SDS ، و 100 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl pH 8.0 ، و 200 ميكرولتر من 50× محلول Denhardt ، و 20 ميكرولتر من 500 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 ، و 2 مل من 50٪ كبريتات ديكستران (MW 500،000). أكمل الحجم بالماء فائق النقاء الخالي من RNase. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
    ملاحظة: كبريتات ديكستران لزجة جدا. ينصح بإعداد 20٪ إضافية من الحجم الإجمالي لحلول التهجين / التهجين المسبق لحساب أخطاء سحب العينات. يمكن حذف الحمض النووي الريبي للخميرة من محلول ما قبل التهجين ، إذا رغبت في ذلك.
  13. تحضير أغطية فيلم مختبر اللدائن الحرارية. قطع قطع فيلم مختبر لدائن حرارية مستطيلة أقصر بمقدار 1-2 مم من طول وعرض شريحة المجهر.
  14. تحضير المخزن المؤقت TN: 100 ملي مولار Tris-HCl / 150 ملي كلوريد الصوديوم. للحصول على 100 مل ، قم بتخفيف 10 مل من 1 M Tris-HCl pH 7.5 و 3 مل من 5 M كلوريد الصوديوم في 70 مل من الماء فائق النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
  15. إعداد المخزن المؤقت لحجب TNB: كاشف حجب 0.5٪ A (w/v) في TN Buffer. للحصول على 200 مل ، قم بإذابة 1 جم من الكاشف المانع A في 200 مل من TN Buffer (انظر جدول المواد للمصدر التجاري للكاشف المانع A).
  16. تحضير المخزن المؤقت TNT: 0.05٪ Tween-20 في TN Buffer. لمدة 1 لتر ، قم بتخفيف 5 مل من 10٪ Tween-20 في 950 مل من المخزن المؤقت TN. أكمل مستوى الصوت ببطء باستخدام المخزن المؤقت TN لتجنب الرغوة. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
  17. تحضير حل عمل Tyramide-Alexa 488: 1× المخزن المؤقت للتضخيم A / 0.0015٪ H2O2/1: 100 التيراميد - Alexa 488. بالنسبة ل 100 ميكرولتر ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H2O2 و 1 ميكرولتر من التيراميد - Alexa 488 في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم A (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد - أليكسا 488 ومخزن التضخيم A). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
  18. تحضير حل عمل Tyramide-Alexa 555: 1× المخزن المؤقت للتضخيم A / 0.0015٪ H2O2/1: 100 Tyramide-Alexa 555. بالنسبة ل 100 ميكرولتر ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H2O2 و 1 ميكرولتر من التيراميد Alexa 555 في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم A (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد - Alexa 555 ومخزن التضخيم A). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
  19. تحضير حل عمل التيراميد البيوتين: 1× المخزن المؤقت للتضخيم B / 0.0015٪ H2O2 / 1: 50 التيراميد البيوتين. وبالنسبة إلى 100 ميكرولتر، يخفف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H2O2 و2 ميكرولتر من بيوتين التيراميد في 97 ميكرولتر من مخزن التضخيم B (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد البيوتين ومخزن التضخيم B). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
  20. تخبز الأواني الزجاجية على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل. عالج الأواني البلاستيكية غير التي لا تستخدم لمرة واحدة (بما في ذلك الرفوف المنزلقة وبرطمانات كوبلن والمحاقن) بنسبة 3٪ H2O2 لمدة 15-30 دقيقة ، متبوعا بغسيل شامل تحت الماء الخالي من RNase. عالج الأدوات المعدنية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مثل أدوات التشريح والملقط وحاملات عينات التبريد ، بنسبة 3٪ H2O2 لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بغسيل شامل تحت الماء الخالي من RNase. نظف أسطح مقاعد البدلاء واللوح المسخن والكتل الجافة باستخدام محلول تنظيف RNase.

2. تخليق الريبوبروب

ملاحظة: يعتمد الإجراء التالي لتصنيع مجسات cRNA المسماة ب digoxigenin 1 كيلو بايت للتهجين في الموقع عبر النسخ في المختبر على البروتوكولات المنشورةسابقا 20،21،22،23.

  1. استخدم أزواج أولي قليل النوكليوتيدات المناسبة لتضخيم جزء من الحمض النووي 1 كيلو بايت من الجين المعني (على سبيل المثال ، جين المستقبلات الشمي). حدد أزواج التمهيدي التي تضخم منطقة موجودة في الرنا المرسال الناضج المراد اكتشافها (على سبيل المثال ، تسلسل ترميز الجين). يتم توفير مجموعة مختارة من الاشعال لمستقبلات حاسة الشم المختلفة في جدول المواد. للحصول على تفاصيل حول المجسات للكشف عن مستقبلات حاسة الشم الأخرى ، يرجى مراجعة المنشورات السابقة16،21.
  2. قم بتشغيل منتجات PCR على جل الاغاروز بنسبة 0.8٪ وقم بإزالة النطاق المطلوب 1 كيلو بايت.
  3. قم بتنقية جزء الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية هلام صغيرة مناسبة قائمة على العمود وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. قم بتحديد جزء الحمض النووي المنقى واستنساخه في ناقل استنساخ PCR مناسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ينصح باستخدام نواقل الاستنساخ التي تحتوي على محفزات بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 و SP6 التي تحيط بالمضخم المستنسخ.
  5. قم بتحويل البلازميد المؤتلف إلى بكتيريا مختصة خالية من إعادة التركيب عن طريق التحويل الكيميائي أو التثقيب الكهربائي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. عزل البذور المستعمرات البكتيرية المتحولة إلى وسط غني وعزل البلازميد عن طريق تحضير الحمض النووي المصغر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. قم بإجراء تحليل هضم تقييد باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة و / أو تسلسل سانجر للتحقق من هوية واتجاه جزء الحمض النووي المدرج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. قم بإجراء عملية الهضم المقيدة لخطية 10 ميكروغرام من البلازميد باستخدام إنزيم تقييد مناسب. لإنتاج مسبار ريبوبروب مضاد للإحساس بعد النسخ في المختبر ، استخدم إنزيم تقييد يهضم الحمض النووي البلازميد في أقصى الإدخال المقابل لمحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي الموجود في اتجاه مجرى النهر لتسلسل ترميز الجين. لإنتاج ريبوبروبس حسي بعد النسخ في المختبر ، استخدم إنزيم تقييد يهضم الحمض النووي البلازميد في أقصى الإدخال المقابل لمحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي الموجود في اتجاه المنبع لتسلسل ترميز الجين.
  9. قم بتشغيل حصة من منتج تفاعل خطية البلازميد على هلام الاغاروز بنسبة 0.8٪ للتأكد من اكتمال الهضم. بمجرد تأكيد الخطية الكاملة ، قم بتنقية ما تبقى من التفاعل باستخدام مجموعة تنظيف PCR القائمة على العمود وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. قم بتجميع مجسات الحمض النووي الريبي المسمى بالديجوكسيجينين عن طريق النسخ في المختبر باستخدام 1-2 ميكروغرام من البلازميد الخطي كقالب ، والإنزيم المناسب (على سبيل المثال ، T7 أو SP6 RNA polymerase) ، ومجموعة أدوات وضع العلامات على digoxigenin (DIG) مناسبة.
  11. قم بإزالة قالب الحمض النووي من التفاعل عن طريق الهضم باستخدام DNase I عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  12. قم بتنقية مجسات الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المصغرة القائمة على العمود أو مجموعة تنقية قائمة على الترشيح الهلامي. قم بإزالة المسبار الناتج في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  13. حدد كمية الريبوبروب الناتج ، ويفضل استخدام طرق الفلورومترية. عادة ما يكون العائد المتوقع أعلى من 100 نانوغرام / ميكرولتر.
  14. قم بتشغيل مسبار الريبوبروب على نظام الرحلان الكهربائي الآلي أو على هلام الاغاروز 0.8٪ خال من RNase للتحقق من جودة المسبار وتدهوره.
  15. قم بتخزين المسبار المركب عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة.

3. تعرض الفئران للمنبهات الشمية

  1. ضع كل على حدة في قفص نظيف لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التعرض. قم بإزالة شبكة الطعام قبل ساعتين على الأقل من التعرض. كانت جميع المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور C57BL / 6 من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا (متوسط الوزن: 20 جم).
  2. تحضير المنبه الشمي المناسب. يمكن استخدام محفزات مختلفة لتنشيط الخلايا العصبية الشمية في MOE (الظهارة الشمية الرئيسية) أو VNO (العضو الشمي). للحصول على قائمة شاملة بالمحفزات الشمية ، يرجى الرجوع إلى المنشورات الأخرى3 ، 16 ، 22 ، 23 ، 24. يمكن ترسيب المحفزات السائلة ، مثل المحاليل الكيميائية أو البول أو محلول البروتين المؤتلف ، على شاش طبي أو كرة قطنية.
  3. أدخل المنبه الشمي في القفص واترك دون إزعاج لمدة 1 ساعة.
  4. قم بالقتل الرحيم لموضوع الماوس وقم بتشريح MOE أو VNO بسرعة باستخدام أدوات التشريح الخالية من RNase.

4. تشريح الأنسجة والتجميد

  1. قم بتشريح MOE أو VNO تحت مجهر مجسم باستخدام محلول التشريح.
    1. بالنسبة ل VNO ، قم بإزالة عظام الحاجز السميكة ، تاركا قشور الغضاريف الأكثر نعومة المحيطة بالعضو.
  2. تحضير عينة للتقسيم بالتبريد.
    1. جفف العينة على قطعة من ورق النشاف وضعها داخل قالب بلاستيكي نسيجي يحتوي على وسيط تضمين.
    2. بالنسبة إلى VNO ، رتب كل عضو عموديا واسحبه إلى أسفل القالب البلاستيكي بمساعدة حقنة سعة 1 مل (الشكل 1 أ).
    3. بالنسبة لوزارة التربية والتعليم ، ضعه في الجزء السفلي من القالب البلاستيكي بحيث تكون اللوحة المصفوية متجهة لأسفل.
    4. قم بإزالة الفقاعات الزائدة حول العينة لأنها يمكن أن تتداخل مع التقسيم.
    5. تجميد العينات على الثلج الجاف.
    6. قم بتخزين كتلة العينة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجمدة لعدة أشهر قبل التقسيم.
  3. قم بإجراء التقسيم بالتبريد.
    1. قم بتشغيل ناظم البرد واضبط درجة الحرارة على -23 درجة مئوية قبل 4 ساعات على الأقل من الاستخدام.
    2. قم بإزالة الكتلة المجمدة من القالب البلاستيكي النسيجي وقم بقصها بشفرة حلاقة.
    3. اترك 5 مم حول العينة ، لأن هذا يجعل التعامل مع القسم أسهل (الشكل 1 ب).
    4. استخدم وسيط التضمين لتوصيل الكتلة بحامل عينة المبرد.
    5. اجمع 16 ميكرومتر على شرائح مجهر موجبة الشحنة.
    6. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل التهجين في الموقع .

5. بروتوكول التهجين في الموقع خطوة بخطوة

  1. جفف الشرائح لمدة 10 دقائق باستخدام مجفف الشعر. استخدم النفاثة الدافئة لإذابة الجليد من الشرائح ، ثم قم بالتبديل إلى نفاثة درجة حرارة الغرفة حتى يصبح وسط التضمين معتما.
  2. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من محلول تثبيت بارافورمالدهيد 4٪ خال من RNase واحتضانه عند 23-26 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأقسام النسيجية.
  3. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من 0.2 M HCl الخالي من RNase واحتضنه عند 23-26 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  6. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من 0.1٪ H2O2/1× PBS الخالية من RNase واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 23-26 درجة مئوية. قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام لمنع تدهور بيروكسيد الهيدروجين الناجم عن الضوء.
  7. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. قم بإجراء الأستلة عن طريق نقل الشرائح إلى وعاء يحتوي على 250 مل من ثلاثي إيثانول أمين خال من RNase 0.1 M pH 8.0 وقضيب تقليب مغناطيسي ، في غطاء دخان. أضف 625 ميكرولتر من أنهيدريد الخل تحت التحريك المستمر. اخفض سرعة التقليب ، وأضف 625 ميكرولتر أخرى قطرة قطرة على الشرائح ، ثم أطفئ التحريك واحتضنه لمدة 10 دقائق.
  9. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. اغسل الشرائح مرة واحدة في 1× PBS خالية من RNase عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. قم بإجراء التهجين المسبق عن طريق إزالة الشرائح من 1× PBS واحدة تلو الأخرى وتجفيف كل منها باستخدام مناديل مختبرية خالية من النسالة. Pipet 400 ميكرولتر من محلول التهجين المسبق على كل شريحة ووضعها داخل غرفة رطبة مدفأة مسبقا عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو فرن ساخن. احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  12. قم بتسخين محلول تهجين كاف إلى 60 درجة مئوية ، وتناول 200 ميكرولتر لكل شريحة في أنابيب الطرد الدقيق ، وتسخينها حتى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. أضف مسبار (مسبارات) الحمض النووي الريبي المرسال المناسب إلى أنابيب محلول التهجين (1 ميكروغرام / مل لكل مسبار) وقم بتغيير طبيعة الأرض عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  14. للتهجين ، خذ شريحة واحدة في كل مرة من الغرفة المرطبة ، وجففها وضعها على طبق ساخن 60 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول التهجين المحتوي على الريبوبروب وقم بتغطية الشريحة بغطاء زجاجي. احتضان لمدة 12-16 ساعة في الغرفة المرطبة عند 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: لا تسمح للشرائح بالتبريد بعد التهجين المسبق. يجب تحديد درجة حرارة التهجين تجريبيا لكل مسبار. يقترح ستون درجة مئوية كنقطة انطلاق ، لأنها تعمل بشكل جيد بشكل عام مع مجسات 1 كيلو بايت.
  15. قم بتسخين محاليل الغسيل SSC إلى 55 درجة مئوية في برطمانات منفصلة وضعها في حمام مائي عند درجة الحرارة المناسبة.
  16. بعد الانتهاء من التهجين ، قم بإزالة الغطاء من كل شريحة باستخدام حمام يحتوي على محلول SSC 5× عند 55 درجة مئوية. أمسك كل شريحة أفقيا داخل محلول SSC الدافئ. عندما ينفصل الغطاء ، قم بإمالة الشريحة واترك الغطاء يسقط إلى الأسفل.
  17. يغسل ب 2× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وعاء منزلق.
  18. يغسل ب 0.2× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في وعاء منزلق.
  19. يغسل ب 0.1× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في وعاء منزلق.
  20. انقله إلى 0.1× SSC عند 23-26 درجة مئوية واحتضنه لمدة 3 دقائق في وعاء منزلق.
  21. يغسل في PTw لمدة 10 دقائق في وعاء منزلق.
  22. يغسل مرتين في TN Buffer ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في وعاء منزلق.
  23. PIPET 600 ميكرولتر من TNB يحجب المخزن المؤقت على كل شريحة ويحتضن لمدة 3 ساعات عند 23-26 درجة مئوية.
  24. Pipet 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (الجسم المضاد المضاد للديجي المترافق بالبيروكسيداز المخفف 1: 400 في محلول TNB) على كل شريحة. قم بتراكب قطعة من فيلم المختبر بالحرارة بعناية على كل شريحة واحتضانها لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  25. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
  26. Pipet 100 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد والبيوتين على كل شريحة. قم بتغطيتها بأغطية فيلم مختبر لدن بالحرارة واحتضانها لمدة 12 دقيقة عند 23-26 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بتنفيذ خطوة الحضانة هذه بطريقة متداخلة ، مع 2 أو 3 شرائح لكل دفعة ، للسماح بالتحكم الجيد في أوقات الحضانة. قد تحتاج مدة حضانة التيراميد إلى الأمثل ، اعتمادا على حساسية مسبار الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي وتركيزه.
  27. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
  28. Pipet 200 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الستربتافيدين المترافق مع البيروكسيديز (SA-HRP ، مخفف 1: 100 في المخزن المؤقت TNB) على كل شريحة وتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة. احتضان عند 23-26 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  29. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
  30. Pipet 100 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد Alexa 488 على كل شريحة ، قم بتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة واحتضانها عند 23-26 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة في الظلام.
  31. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
  32. احتضان في 3٪ H2O2/1× PBS في وعاء منزلق لمدة 1 ساعة ، لتعطيل البيروكسيداز من الخطوات السابقة.
  33. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.

6. pS6 immunostaining

  1. Pipet 500 ميكرولتر من محلول 4٪ paraformaldehyde / 1× PBS على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأقسام.
  2. Pipet 500 ميكرولتر من 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 على كل شريحة واحتضانها لمدة 5 دقائق لاختراق الأقسام.
  3. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS في وعاء منزلق.
  4. Pipet 2-3 قطرات لكل قسم من محلول حجب تضخيم إشارة التيراميد المتاح تجاريا B (جدول المواد) وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  5. Pipet 400 ميكرولتر من محلول حجب الكيمياء المناعية على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لحجب الأقسام.
  6. Pipet 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية للأرانب المضادة ل pS6 (مخفف 1: 200 في محلول حجب الكيمياء المناعية ؛ التركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل) على كل شريحة ، وتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة ، وتحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  7. اغسل 3 مرات باستخدام 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 ، لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
  8. Pipet 2-3 قطرات لكل شريحة من محلول الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب المترافق مع البيروكسيديز المتوفرة تجاريا (جدول المواد) وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  9. اغسل 3 مرات باستخدام 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 ، لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
  10. تجف الشرائح وتضع 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد Alexa 555 على كل شريحة ، وتراكب بقطعة من غطاء فيلم المختبر بالحرارة ، وتحتضن لمدة 7 دقائق في الظلام.
  11. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
  12. Pipet 500 ميكرولتر من البقعة النووية المخففة (في 1× PBS) على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS عند 23-26 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
  14. قم بتركيب الشرائح مع وسيط تثبيت مضاد للبهتان واترك وسط التركيب يعالج لمدة 24 ساعة في الظلام.
  15. قم بتخزين الشرائح في درجة الحرارة المناسبة حتى التصوير ، لتجنب تلاشي الفلورة.

7. التصوير المجهري

  1. تنزلق الصورة باستخدام مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر مزود بمرشحات مناسبة للفلوروفورات المستخدمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يهدف البروتوكول الحالي إلى الحصول على صور مجهرية يتم فيها تصنيف جين المجرب المعني وعلامة النشاط العصبي pS6 بالفلورسنت. تتضمن الطريقة الموصوفة تضخيم إشارة التيراميد ، والذي ينتج عنه وضع علامات واضحة وقوية مع خلفية قليلة أو معدومة. يظهر التلوين المناعي pS6 كإشارة فلورية سيتوبلازمية تملأ عادة جسم الخلية العصبية بأكملها ، بينما تظهر إشارة التهجين في الموقع للخلايا العصبية المستقبلة الشمية على شكل تلطيخ سيتوبلازمي. pS6 هي علامة عابرة لتنشيط الخلايا العصبية الشمية ، وبالتالي ستظهر إشارة التلوين المناعي المرتبطة أقوى ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يحدد البروتوكول الموصوف هنا بشكل موثوق الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة الإشارات الكيميائية في الجهاز الشمي من خلال مزيج من الكشف في الموقع عن مستقبلات OR أو VR مع الكشف المناعي ل pS6 ، وهي علامة غير مباشرة للنشاط العصبي. يجب على المجرب توخي الحذر الشديد للحفاظ على سلامة الأنسجة وتنفيذ جميع الخطوات قبل التهجين في ظل ظروف خالية من RNase. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى تدهور mRNA وإلحاق الضرر بوضع العلامات على الريبوبروب. يجب توخي الحذر أثناء تشريح الأعضاء الشمية ، لأن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة من أي نوع.

شكر وتقدير

نشكر GAG Pereira و JA Yunes على الموارد ، و APF Ferreira و WO Bragança للمساعدة الإدارية والفنية ، وموظفي المرفق الأساسي لعلوم الحياة (LaCTAD-UNICAMP) للمساعدة في الفحص المجهري متحد البؤر. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP ؛ أرقام المنح 2009/00473-0 و 2015/50371-0 إلى F.P.) ، من قبل PRP / UNICAMP (أرقام المنح 2969/16 و 725/15 و 348/14 و 315/12 إلى F.P.) ، من قبل زمالات FAPESP إلى V.M.A.C. (2014 / 25594-3 ، 2012 / 21786-0 ، 2012 / 01689-0) ، T.S.N. (2012 / 04026-1) ، ومن قبل زمالة Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) إلى T.S.N.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS) ThermoFisher ScientificAM9625n / a
20x مخفف تضخيم (عازل تفاعل من  مجموعة Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 or  يشار إلى B40922باسم المخزن المؤقت للتضخيم A في الحلول العملية لتضخيم إشارة التيراميد - Alexa 488 أو تضخيم إشارة التيراميد - Alexa 555
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn / a
30٪ ألبومين مصل البقر (BSA) Merck(Sigma-Aldrich)A9576n /
a 30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O 2< / sub>)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n / a
أنهيدريد الخليكميرك (سيجما ألدريتش)320102Agarose
Merck (Sigma-Aldrich)A9539n / a
مخفف تضخيم (من مجموعة بيوتين TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAيشار إليه باسم Amplification Buffer B في محلول عملي لتضخيم إشارة التيراميد والبيوتين
المضادة ل pS6 (Ser 244/247) الأرانب متعددة النسيلةالجسم المضاد الحراري فيشر ساينتفيككات # 44-923G ، RRID: AB_2533798n / a
حجب المخزن المؤقت 1x (من مجموعة Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost) ThermoFisher ScientificB40923 أو   ؛ يشار إلى B40922على أنه محلول حجب B في خطوة تطوير إشارة التيراميد
كاشف الحجب (من مجموعة Biotin TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAيشار إليه على أنه كاشف حجب A في تركيبة TNB buffer
DAPI صبغة نوويةThermo Fisher ScientificD1306n / a
محلول Denhardt (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n / a
فورماميد منزوع السممميرك (سيجما ألدريتش)F9037ن / أ
محلول كبريتات ديكستران (50٪)ميرك (كيميكون)S4030ن / أ
حمض الإيثيلين ديامين - رباعي الأسيتيك (EDTA) ميرك(سيجما ألدريتش)E9884ن / أ
Hoechst 33342 وصمة عار نوويةثيرمو فيشر ScientificH1399ن / أ
حمض الهيدروكلوريك (HCl) ميرك( Sigma-Aldrich)320331n / a
محفزات حاسة الشمn / aPapes et al. (2010) ، Carvalho et al. (2015) ، Nakahara er al. (2016) ، Carvalho et al. (2020)n / a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n / a
الجسم المضاد المضاد للديجوكسيجينين المترافق مع البيروكسيداز (شظايا Fab) Merck(Roche)11207733910 ؛   RRID: AB_514500يشار إليه على أنه الجسم المضاد المضاد للديجي المترافق مع البيروكسيديز
والجسم المضاد المضاد للأرانب المترافق مع بيروكسيداز (كاشف مضاد للأرانب المترافق متعدد HRP من & nbsp ؛ مجموعة Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n / a
الستربتافيدين المترافق مع البيروكسيديز (من مجموعة البيوتين TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAN / A
ProLong Gold المضاد للبهتانالحامل Thermo Fisher ScientificP36934يشار إليه على أنه مضاد للبهتان متصاعد متوسط
RNase ماء فائق النقاءThermo Fisher Scientific10977015ن / أ
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)ميرك (سيجما ألدريتش)S9888ن / أ
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ميرك(سيجما ألدريتش)436143ن / أ
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)ميرك (سيجما ألدريتش)S8045ن / أ
السكروزميرك (سيجما ألدريتش)S0389ن / أ
ثلاثي إيثانول أمينميرك (سيجما ألدريتش)T58300n / a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n / a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n / a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n / a
Tyramide-Alexa 488 Conrupgate (من مجموعة Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost) ThermoFisher ScientificB40922n / a
مترافق Tyramide-Alexa 555 (من مجموعة Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923n / a
مترافق التيراميد والبيوتين (من مجموعة بيوتين TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAN / a
الخميرة tRNAMerck (Roche)10109495001n / a
< قوي > المقايسات التجارية الحرجة < / قوي>
مجموعة Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoostThermo Fisher ScientificB40922n / a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoostkit Thermo Fisher ScientificB40923N / a
DIG RNA Labeling Kit (SP6 / T7) Merck(Roche)11175025910n / a
كواشف تحليل شريط الشاشة الحمض النووي الريبي عالي الحساسية (المخزن المؤقت ، السلم ، والشريط)Agilent5067-5580 ، 5067-5581 ، و 5067-5579يشار إليه كنظام الرحلان الكهربائي الآلي
الماوس: C57BL / 6J سلالة فطريةمختبرات جاكسونرقم الأسهم:  000664;   RRID: IMSR_JAX: 000664)n / a
ProbeQuant G-50 Micro Columns28903408إلى Cytiva Biosciencesباسم مجموعة تنقية قائمة على ترشيح الهلام
QIAquick Gel ExtractQiagen28506يشار إليها على أنها مجموعة تنقية هلام صغيرة قائمة على العمود
RNeasy MinElute مجموعة أدوات تنظيفQiagen74204يشار إليها باسم مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود الصغير
TSA مجموعة البيوتينAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn / a
Oligonucleotides < / strong >
5 '&ndash ؛ AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr692
5 '– ACTGGCTTTGGGACAGTGGÇGÇ – 3 'تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr124
5 '&ndash ؛ TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr1509
5 '&ndash ؛ TAGAAAACCGATACCTTGTC
G – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr1512
5 '&ndash ؛ GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr78
5 '&ndash ؛ CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr691
5 '&ndash ؛ AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أOlfr638
5 '&ndash ؛ TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3 'تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aOlfr569
5 '&ndash ؛ TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r1
5 '&ndash ؛ CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r2
5 '&ndash ؛ ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3 "		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5" & ndash ؛ TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTc
CAC &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r13
5 '&ndash ؛ AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r89
5 '&ndash ؛ ATGGGAATGACCAACTTAGGC
A – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r118
5 '&ndash ؛ ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ATCGGATCCGCTGATTTTTTTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aVmn2r116
5 '&ndash ؛ ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TGGGTGTCTTCTTTCCTCAA
GA – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r28
5 '&ndash ؛ GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r41
5 '&ndash ؛ CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r46
5 '&ndash ؛ AGTGGGTCTTTTAGAAAGGAG
TG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r69
5 '&ndash ؛ GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3 'تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aVmn2r90
5 '&ndash ؛ CATATTCCACAGAGAGAAGT
TGGAC &ndash ؛ 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةن / أVmn2r107
5 '&ndash ؛ CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
5 '& ndash ؛ ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / aVmn2r83
5 '&ndash ؛ ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3 '		تقنيات الحمض النووي المتكاملةn / a
< قوية > مؤتلفة الحمض النووي < / قوي >
pGEM-T-Easy ناقلاتPromegaA1360موصى بها استنساخ PCR
ناقل<قوي>مواد أخرى< / قوي >
1 ملمحاقن فيشر Scientific14-829-10Fn / a
أنابيب مخروطية (15 مل و 50 مل)فيشر ساينتفيك14-432-22 ، 14-959-49Bn / a
برطمانات كوبلينفيشر Scientific12-567-099 ، 07-200-81
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n / a
أدوات تشريح وملقطRobozRS-6802 ، RS-8124 ، RS-7110 ، RS-5111n / a
حمام جافn / an / an / a
الرحلان الكهربائي معداتفيشر Scientific09-528-110Bn / a
فرش الرسم ذات النقطةالدقيقة Winsor & amp نيوتن10269097n / a
مضان أو مجهر متحد البؤرLeica MicrosystemsTCS SP5IIn / a
لوحة ساخنةFisher ScientificHP88850200n / A
غرفة مرطبة (إذا تم استخدامها في درجات حرارة أعلى ، فستحتاج إلى إغلاقها داخل حاوية Tupperware بلاستيكية)Thermo Fisher Scientific22-045-034N / a
مختبر Kimwipes الخالي من الوبرإلى Kimberly-Clark34120على أنه ورق مناديل مختبر خال من النسالة
طرد مركزيEppendorf5401000013n / a
أقفاص فأرInnoViveM-BTM ، MVX1n / a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n / a
ماصة p1000 ، p200 ، و p20 نصائح يمكن التخلصمنها فيشر ساينتفيك02-707-408 ، 02-707-411 ، 02-707-438n / a
تضمين الأنسجة البلاستيكيةThermo Fisher Scientific22-19n / a
Qubit 4 مقياس الفلورThermo Fisher ScientificQ33238يشار إليه على أنه طريقة الفلورومترية عالية الحساسية
شفرات الحلاقة أو المشارطFisher Scientific12-640n / a
RNA tapestation أو BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System أو 2100 أداة المحلل الحيويn / a
أسطوانات وأكواب متدرجة من الزجاج أو البلاستيك خالية من RNaseفيشر Scientific10-462-833 ، 02-555-25B ، 02-555-25D
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM80n / a
SuperFrost Plus المجهر شرائحThermo Fisher Scientific12-550-15يشار إليها باسم شرائح المجهر موجبة الشحنة
Parafilmشركة بميسPM999يشار إليها باسم فيلم مختبر اللدائن الحرارية
حمام مائيThermo Fisher ScientificTSCIR19n / a
، خال من يشار Kit يشار جهاز دقيق قالب

المراجع

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التنشيط العصبيالجهاز الشمي للفئرانالبروتين S6 المفسفرالكشف عن المنبهات الكيميائيةالمستقبلات المقترنة بالبروتين Gالسلوكيات الشميةمستقبلات العضو الميكعي الأنفي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.