يصف هذا البروتوكول استخدام بيروكسيد الهيدروجين المشفر وراثيا (H2O2)- الاستشعار الحيوي في الخلايا العصبية ويرقات سمك الحمار الوحشي المستزرعة لتقييم أدوار الإشارات الفسيولوجية ل H2O2 أثناء تطور الجهاز العصبي. ويمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا وتعديلها مع العلاجات التجريبية لدراسة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في التنمية العامة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطوير الخلايا العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات إشارات راسخة ، وهي مهمة في التطور الطبيعي ، وداء التوازن ، وعلم وظائف الأعضاء. من بين ROS مختلفة، بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)يتميز أفضل فيما يتعلق بأدوار في الإشارات الخلوية. وقد تورط H2O2 خلال التنمية في عدة أنواع. فعلى سبيل المثال، تم الكشف عن زيادة عابرة في H2O2 في أجنة حمار وحشي خلال الأيام الأولى بعد الإخصاب. وعلاوة على ذلك، استنزاف مصدر الخلوية الهامة H2O2، NADPH oxidase (NOX)، يضعف تطور الجهاز العصبي مثل التمايز، والنمو المحوري، والتوجيه من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) على حد سواء في الجسم الحي وفي المختبر. هنا ، نصف طريقة لتصوير مستويات H2O2 داخل الخلايا في الخلايا العصبية المستزرعة حمار وحشي ويرقات كاملة أثناء التطوير باستخدام جهاز الاستشعار الحيوي H2O2المشفر وراثيا ، roGFP2-Orp1. يمكن التعبير عن هذا المسبار بشكل عابر أو ثابت في يرقات حمار وحشي. وعلاوة على ذلك، يقلل قراءات قياس النسب من احتمال اكتشاف القطع الأثرية بسبب التعبير الجيني التفاضلي أو آثار الحجم. أولا، نحن نظهر كيفية عزل وزراعة RGCs المستمدة من أجنة حمار وحشي التي تعبر عن عابر roGFP2-Orp1. ثم نستخدم يرقات كاملة لمراقبة مستويات H2O2 على مستوى الأنسجة. وقد تم التحقق من صحة جهاز الاستشعار بإضافة H2O2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس مستويات H2O2 في أنواع خلايا وأنسجة محددة عن طريق توليد معدلة وراثيا مع تعبير حساس حيوي خاص بالأنسجة. وبما أن سمك الحمار الوحشي يسهل التلاعب الجيني والتنموي، فإن النهج الذي يظهر هنا يمكن أن يكون بمثابة خط أنابيب لاختبار دور H2O2 أثناء التطور العصبي والجنيني العام في الفقاريات.
المقدمة
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الإشارات ينظم تطوير وأداء الجهاز العصبي1. مصدر ROS الخلوية الهامة هي NADPH oxidases (NOX)، والتي هي بروتينات ترانسميمبرين توليد سوبر أكسيد وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2)2. توجد إنزيمات NOX في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، ويساهم ROS المشتقة من NOX في تطوير الخلايا العصبية3و4و5و6. وقد ثبت صيانة وتمايز الخلايا الجذعية العصبية، وإنشاء قطبية الخلايا العصبية، و نمو نيوريت، و اللدونة متشابك تتطلب مستويات كافية من ROS7
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع التجارب على الحيوانات أخلاقيا والموافقة عليها من قبل لجنة بوردو لرعاية الحيوانات واستخدامها (PACUC) ، وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة مع البروتوكول 2006002050 الموافقة عليه في 07/24/2020.
1. إعداد الحلول
- E2 وسائل الإعلام (1x)
- إعداد حلول E2A 100x (500 مل) و500x E2B (100 مل) و500x E2C (100 مل) من خلال الجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول 1. حلول Autoclave E2A و E2B و E2C. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- لوسائط 1x E2: اجمع 5 مل من 100x E2A و1 مل من 500x E2B و1 مل من 500x E2C. رفع حجم إلى 500 مل مع الماء العقيم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0-7.5.
- إعداد 50 مل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
RGCs حمار وحشي مثقف تمديد محاور في غضون 1D. صورة نسبة 405/480 ممثل H2O2-الاستشعار الحيوي هو مبين في الشكل 4A. جسم الخلية، محور عصبي، ومخاريط النمو مرئية بوضوح في الخلايا العصبية الفردية. يمكن أن تخضع هذه الخلايا العصبية لعلاجات مختلفة مع مرور الوقت لمراقبة H2O2 التغييرات. وجدنا سابقا أن إضافة 100 μM H2O2 إلى وسائط الثقافة يزيد من قيم النسبة ، مما يدل على أنه يمكن الكشف عن التغيرات في الوقت الحقيقي مع هذا النظام (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام في جميع أنحاء هذا البروتوكول. ونعتقد أن النظر في هذه النقاط سيحسن التدفق التجريبي. بالنسبة لثقافة RGC الأولية ، فإن عقم ZFCM (-) مهم جدا ، نظرا لأن هذه الوسائط الثقافية لا تحتوي على المضادات الحيوية ويمكن أن يحدث التلوث قبل أو أثناء التصوير. لتجنب ذلك، ننصح بإعداد واستخدام ZFCM(-) فقط داخل خزانة السلامة الحيوية وجعل وسائل الإعلام ZFCM(-) الطازجة بانتظام (الخطوة 1.5). وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تبقى مخزونات صفح في -80 درجة مئوية. يجب تخزين صفح المذاب عند درجة حرارة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (المنحة R01NS117701)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (المنحة 1146944-IOS)، وصندوق أبحاث الحبل الشوكي وإصابات الدماغ في إنديانا (منحة 20000289)، ومؤسسة أبحاث بوردو (منحة 209911)، ومكتب نائب الرئيس التنفيذي للبحوث والشراكات في جامعة بوردو (منحة 210362). نشكر الدكتور كوري ج. ويفر وهايلي رودر على إنشاء بروتوكول ثقافة سمك الحمار الوحشي RGC. نشكر هالي رودر بالإضافة إلى ذلك على توفير بيانات الشكل 4. نشكر ليا بياسي وكيني نغوين على المساعدة في ثقافة RGC. نشكر جنتري لي لتحرير النص. نشكر الدكتور توبياس ديك لتوفير roGFP2-Orp1 والدكتور تشينغ دينغ لأجهزة الكمبيوتر 2 + ناقلات تحتوي على roGFP2-Orp1. يتم إنشاء الشكل 2 مع Biorender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق ثقافة 35 مم | Sarstedt | 83-3900 | |
| طبق قاع زجاجي مقاس 35 مم | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| شعرية زجاجية من البورسليكات | Sutter / Fisher Scientific | NC9029378 | |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | فيشر Scientific | C79-500 | |
| غطاء زجاجي | Corning | 2850-22 | |
| أطباق بتري يمكن التخلص منها (100 × 15 مم) | VWR | 25384-094 | |
| مصل الأبقار الجنيني | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| الجلوكوز | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| حقن | العفن أدوات العلوم التكيفية | TU-1 | |
| المجهر المقلوب | نيكون | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| المسح المجهري متحد البؤر بالليزر | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium مع الفينول الأحمر | Gibco / Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium بدون الفينول الأحمر | Gibco / Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| ذوبان منخفض الاغاروز | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS | Hyclone / Fisher Scientific | SH3025601 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| فينول ريد | سيجما ألديتش | P0290 | |
| فينيل ثيوريا (PTU) | سيجما ألديتش | P7629 | |
| هوائي PicoPump | World Precision | Instruments PV820 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Purification | QIAGEN | 28104 | |
| ماوس مؤتلف slit2 | R & D Systems | 5444-SL-050 | |
| بيروفات الصوديوم | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 & micro ؛ مرشح m | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
| مجتذب الماصة | العمودي David Kopf Instruments | 700C |
المراجع
- Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiolo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
