Method Article

القياسات القائمة على الفلورسينس من فوسفاتيديلسيرين / فوسفاتيديلينوزيتول 4-تبادل الفوسفات بين الأغشية

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن نصف بروتوكولات باستخدام أجهزة استشعار الدهون الفلورية والدهون لتحديد ما إذا كان البروتين مقتطفات وينقل فوسفاتيديلسيرين أو فوسفاتيديلينوزيتول 4-فوسفات في المختبر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم العثور مؤخرا على العديد من أعضاء البروتين المرتبط بالأوكسيسترول (OSBP) المرتبط بالبروتينات (ORP) / OSBP homologs (Osh) لتمثيل مجموعة جديدة من بروتين نقل الدهون (LTP) في الخميرة والخلايا البشرية. أنها نقل فوسفاتيديلسيرين (PS) من الشبكية الانتوبلازمية (ER) إلى غشاء البلازما (PM) عن طريق PS /فوسفاتيديلينوزيتول 4-فوسفات (PI(4)P) دورات التبادل. تسمح هذه النتيجة بفهم أفضل لكيفية توزيع PS ، وهو أمر بالغ الأهمية لعمليات الإشارات ، في جميع أنحاء الخلية والتحقيق في الصلة بين هذه العملية واستقلاب فوسفوينوسيتيد (PIP). وكان لتطوير بروتوكولات جديدة قائمة على الفلورسينس دور فعال في اكتشاف وتوصيف هذه الآلية الخلوية الجديدة في المختبر على المستوى الجزيئي. تصف هذه الورقة إنتاج واستخدام جهازي استشعار الدهون المسمى الفلورسنت، NBD-C2Lact و NBD-PHFAPP، لقياس قدرة البروتين على استخراج PS أو PI(4)P ونقل هذه الدهون بين الأغشية الاصطناعية. أولا، يصف البروتوكول كيفية إنتاج وتسمية والحصول على عينات عالية النقاء من هذه الإنشاءات اثنين. ثانيا، تشرح هذه الورقة كيفية استخدام أجهزة الاستشعار هذه مع قارئ لوحة مضانة لتحديد ما إذا كان البروتين يمكن استخراج PS أو PI (4) P من الليبوسومات، وذلك باستخدام Osh6p كدراسة حالة. وأخيرا، يوضح هذا البروتوكول كيفية قياس حركة تبادل PS/PI(4) P بدقة بين الليبوسومات من تكوين الدهون المحدد وتحديد معدلات نقل الدهون عن طريق نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) باستخدام مقياس الفلورومتر القياسي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوزيع الدقيق للدهون بين الأغشية المختلفة وداخل أغشية الخلايا eukaryotic1،2 له آثار بيولوجية عميقة. فك تشفير كيف تعمل LTPs هي قضية هامة في بيولوجيا الخلية3،4،5،6، والنهج في المختبر هي ذات قيمة كبيرة في معالجة هذه المسألة7،8،9،10،11. هنا، يتم تقديم استراتيجية في المختبر، على أساس الفلورسينس التي كانت مفيد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية NBD-C2Lact

ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول تفاصيل استخدام جهاز تعطيل الخلية لكسر البكتيريا، فإنه يمكن تعديلها لاستخدام استراتيجيات تحلل أخرى(على سبيل المثال، الصحافة الفرنسية). في بداية تنقية, فمن الإلزامي لاستخدام العازلة التي يتم degassed حديثا, تصفية, وتكمل مع 2 م dithiothreitol (DTT) لمنع أكسدة السيستين. ومع ذلك ، بالنسبة لخطوة وضع العلامات على البروتين ، من المهم إزالة DTT تماما. يجب تنفيذ العديد من الخطوات على الجليد أو في غرفة باردة لتجنب أي تدهور البروتين. يجب جمع عينات من حجم 30 ميكرولتر في خطوات مختلفة من البروتوكول لإجراء تحليل بواسطة الصوديوم دودسيلسلفات-البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SD....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: وصف أجهزة الاستشعار الدهون الفلورية والمقاسات في المختبر. (أ) نماذج ثلاثية الأبعاد من NBD-C2Lact و NBD-PHFAPP استنادا إلى الهيكل البلوري لنطاق C2 من اللاكتاديرين البقري (PDB ID: 3BN648) وهيكل NMR لنطاق PH من بروتين FAPP1 البشري (PDB ID: 2KCJ46). ن، ن<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد نتائج هذه المقايسات بشكل مباشر على إشارات أجهزة استشعار الدهون الفلورية. وبالتالي، فإن تنقية هذه المسابير التي تحمل علامة 1:1 مع بنك دبي الوطني وبدون تلوث حر بالفلوروفور من NBD هي خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. كما أنه من الإلزامي التحقق مما إذا كان LTP قيد الفحص مطويا بشكل صحيح وليس مجمعا. يجب أن تكون كمية LTP التي تم اختبارها في مقايسات الاستخراج مساوية أو أعلى من تلك التي يمكن الوصول إليها من جزيئات PS أو PI (4) P لقياس ما إذا كان هذا LTP يستخرج هذه الدهون بكفاءة. والواقع أن NBD-C2Lact و NBD-PHFAP.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للدكتورة أ. كوتريس على تدقيقها الدقيق للمخطوطة. ويمول هذا العمل منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-16-CE13-0006) ومن المجلس الوطني للبحوث العلمية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  L-سيستين & جي 97 ٪ (FG) سيجماW326305-100 جمقم بإعداد محلول مخزون 10 ملي مولار L-cysteine في الماء. يتم تخزين Aliquots عند -20 درجة ؛ C
2 مل قارورة العنبر ، PTFE / Rub Lnr ، لتخزين الدهون في CHCL 3< / sub>WheatonW224681
خرز زجاجي بقطر 4 ممSigmaZ265934-1EA
50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيFalcon
& Auml ؛ جهاز تنقية KTAالرعاية الصحيةFPLC
رقائق
Amicon Ultra-15 مع MWCO من 3 و 10 كيلو دالتونMerckUFC900324 ، UFC901024
Amicon Ultra-4 مع MWCO من 3 و 10 كيلو دالتونMerckUFC800324 ، UFC801024
أمبيسلينقم بإعداد محلول مخزون 50 مجم / مل بمياه مفلترة ومعقمة وتخزينه عند -20 & درجة ؛ ج.
BestatinSigmaB8385-10mg
BL21 خلايا الذهب المختصةAgilent
C16: 0 Liss & nbsp ؛ (Rhod-PE) في CHCl3< / sub> (1 مجم / مل) AvantiPolar Lipids810158C-5MG
C16: 0 / C16: 0-PI (4) P & nbsp ؛  Echelon LipidsP-4016-3تذوب 1 مجم من مسحوق C16: 0 / C16: 0-PI (4) P في 250 & micro ؛ L من MeOH و 250 & micro ؛ L من CHCl3. ثم أكمل مع CHCl3< / sub> إلى 1 مل. يجب أن يصبح الحل واضحا.
C16: 0 / C18: 1-PS (POPS) في CHCl3< / sub> (10 مجم / مل) AvantiPolar Lipids840034C-25mg
C18: 1/C18: 1-PC (DOPC) في CHCl3 (25 ملغم/مل)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 سيجماتحضير محلول مخزون 10 ملي من CaCl 2 < / sub > في الماء.
ثابتةلاضطراب الخلية
الكلوروفورم (CHCl3< / sub>) RPE-ISOكارلو إربا438601
كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche5056489001
ماء
ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) ، لا مائي ، نقي >99٪
DNAse I المؤتلف ، خالي من RNAse ، في مسحوقRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-Bتحضير محلول مخزون 1 M DTT في ماء Milli-Q. قم بإعداد 1 مل من الكميات وتخزينها عند -20 درجة مئوية ؛
أعمدة كروماتوغرافيا Econo-Pac (1.5 × مرات ؛ 12 سم).بيوراد7321010
كوفيت التثقيب الكهربائي 2 ممOzymeEP102
Electroporator Eppendorf 2510Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 و Ti45 Beckmanالغزل المحلل
الزجاجي المحاقن الزجاجية (10 و 25 و 50 & micro; L) لتجربة التألقمحاقن هاملتون
الزجاجية (25 ، 100 ، 250 ، 500 ، و 1000 & micro ؛ L) للتعامل مع حلول مخزون الدهونهاميلتون1702RNR ، 1710RNR ، 1725RNR ، 1750RN type3 ، 1001RN
Glutathione Sepharose 4B حباتGE Healthcare17-0756-05
Glycerol (99٪ نقي)SigmaG5516-500ML
أنابيب انحلال الدم مع غطاء
HEPES ، >99٪ نقيةSigmaH3375-500G
Illustra NAP 10 عمود تحليةالمياه GE الرعاية الصحيةGE17-0854-02
الأيزوبروبيل & -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) EuromedexEU0008-Bقم بإعداد محلول مخزون IPTG بسعة 1 متر في Milli-Qwater. قم بإعداد 1 مل من الكميات وتخزينها عند -20 درجة مئوية ؛
K-AcetateProlabo26664.293
Lennox LB مرق متوسط بدون جلوكوزمحضر بماء مللي كيو ومعقم.
النيتروجين السائلليندي
ميثانول (MeOH) > 99.8٪VWR20847.24
MgCl2< / sub>Sigmaقم بإعداد محلول 2 M MgCl2< / sub>. تصفية الحل باستخدام 0.45 & micro ؛ مرشح م. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-BindingGreiner Bio-one655900
Mini-Extruder مع اثنين من محاقن هاميلتون الضيقة سعة 1 ملAvanti Polar Lipids610023
قارئ لوحة مضان أحاديTECANM1000 Pro
N ، N'-Dimethyl-N- (Iodoacetyl) -N'- (7-Nitrobenz-2-Oxa-1،3-Diazol-4-yl) Ethylenediamine) (IANBD Amide)المجساتالجزيئية تذوب 25 مجم من IANBD في 2.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتحضير 25 كمية من 100 ميكرو ؛ L في أنابيب الغطاء اللولبي سعة 1.5 مل. لا تقم بلف الغطاء تماما. بعد ذلك ، قم بإزالة DMSO في مجفف التجميد للحصول على 1 مجم من IANBD الجاف لكل أنبوب. يتم إغلاق الأنابيب وتخزينها عند -20 درجة ؛ C في الظلام.   
كلوريد الصوديومSigmaS3014-1KG
PBS137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي مولار KCl ، 10 ملي مولار هيدروهيدروشميس2< / فرعي>PO4< / فرعي> ، 1.8 ملي مولار KH2PO4 ، معقمة ومخزنة عند 4 درجات مئوية.
قوارير زجاجية على شكل كمثرى (25 مل ، 14/23 ، زجاج دوران)Duran Group
PepstatinSigmap5318-25mg
pGEX-C2LACT  < / sub>plasmidمتوفر عند الطلب من مختبرنا
pGEX-PHFAPP< / sub> البلازميدمتوفر عند الطلب من مختبرنا
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) & جي ؛ 98.5٪ (GC)SigmaP7626-25gتحضير محلول مخزون PMSF 200 ملي مولار في مرشحات البولي كربونات الأيزوبروبانول
فوسفوراميدونسيجماR7385-10mg
(قطر 19 مم) بحجم مسام 0.2 وميكرو ؛ mAvanti Polar Lipids610006
عمود كروماتوغرافيا Poly-Prep (بحجم سرير 0-2 مل وخزان 10 مل)Biorad7311550
Prefilters (قطرها 10 مم).Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/بناء النماذج ثلاثية الأبعاد للبروتينات (الشكل 1 أ) كوفيت
الكوارتز للأشعة فوق البنفسجية / التألق المرئي (الحد الأدنى للحجم 600 وميكرو ؛ ل)هيلما
كوارتزمبرد هيلما
  ؛ Eppendorf 5427REppendorf
المبخر الدوارBuchiB-100
أنابيب الممركزة الدقيقة ذات الغطاء اللولبي (1.5 مل)Sarsted
قضيب التحريك المغناطيسي الصغير PFTE (5 مرات ؛ 2 مم)
أنابيب المسنتري الدقيقة ذات الغطاء المفاجئ (0.5 ، 1 ، و 2 مل)Eppendorf
SYPRO البرتقاليصبغة الفلورسنت للكشف عن البروتين في جل SDS-PAGE
ThermomixerStarlab
THROMBIN ، من البلازما البشريةسيجما10602400001قم بإذابة 20 وحدة في 1 مل من ماء مللي Q وتحضير 25 ميكرو ؛ L aliquots في 0.5 مل أنابيب Eppendorf. ثم قم بتجميدها وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
تريس ، فائق النقاءMP819623
الطرد المركزي L90Kبيكمان
الأشعة فوق البنفسجية / مقياس الطيفالمرئي SAFAS
UV / مقياس الطيف الفلوري المرئي مع حامل خلية يتم التحكم في درجة حرارته وجهاز التحريكJasco أو ShimadzuJasco FP-8300 أو Shimadzu RF-5301PC
غرفة فراغ
حمام مائيJulabo
XK 16/70 عمود معبأ بالرعاية الصحية
GE الألومنيومديناميكيات منزوع الأيونات (Milli-Q) اللون كوفيت جهاز طرد مركزي الضوئي Sephacryl S200HR GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 PhosphateLipid Transfer ProteinFluorescence MeasurementsLiposome AssayNBD C2 LactNBD PH FAPPLipid Transfer KineticsFluorescence Resonance Energy TransferOsh6p Protein

Related Articles