مقالة منهجية

إنشاء كيميرا الدماغ الأمامي للطيور لتقييم نمو الوجه

DOI:

10.3791/62183

⸱

فبراير 18, 2021

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة تقنية زرع الأنسجة التي تم تصميمها لاختبار خصائص الإشارات والأنماط للدماغ الأمامي القاعدي أثناء النمو القحفي الوجهي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام جنين الطيور كنظام نموذجي لأكثر من قرن وأدى إلى فهم أساسي لتطور الفقاريات. تتمثل إحدى نقاط القوة في هذا النظام النموذجي في أنه يمكن تقييم تأثير الأنسجة والتفاعل بينها مباشرة في الأجنة الوهمية. لقد أظهرنا سابقا أن الإشارات من الدماغ الأمامي تساهم في تشكل الوجه من خلال تنظيم شكل مجال التعبير للقنفذ الصوتي (SHH) في منطقة الأديم الظاهر الجبهي الأنفي (FEZ). في هذه المقالة ، يتم وصف طريقة توليد الوهم الأمامي وتقديم الرسوم التوضيحية لنتائج هذه التجارب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركز الكثير من الأبحاث المعاصرة في علم الأحياء التنموي على دور الجينات في تشكيل الأجنة. هناك أدوات جيدة لفحص آليات النمو من منظور وراثي. ومع ذلك ، يتم تجميع الأجنة وتخضع للتشكل استجابة لتفاعلات الأنسجة. نظام الطيور هو أداة كلاسيكية تستخدم لتقييم مجموعة متنوعة من تفاعلات الأنسجة التي تنظم التطور للأسباب التالية: علم الأجنة مفهوم جيدا ، ويمكن الوصول إلى الأجنة بسهولة ، وأدوات تحليل أنظمة الطيور متطورة بشكل جيد ، والأجنة غير مكلفة.

تم استخدام نظام زرع الطيور على نطاق واسع لتتبع النسب وتقييم تفاعلات الأنسجة أثناء التطور لما يقرب منقرن من الزمان 1،2،3،4. تم استخدام هذا النظام للتحقيق في مركز الإشارات ، منطقة الأديم الظاهر الجبهي الأنفي (FEZ) ، الذي ينظم تشكل الفك العلوي5 ، وتم نشر مقطع فيديو يصف هذه التقنية سابقا6. بالإضافة إلى كتكوت السمان ، تم استخدام أنواع أخرى لإنتاج الكيميرا لتحليل تفاعلات الأنسجة. على سبيل المثال ، تم زرع الفأر FEZ من النوعالبري 7 والفئرانالطافرة 8 ، واستخدم آخرون أنظمة البط والسمان والكتاكيت لتقييم دور القمة العصبية في تشكيل الهيكل العظمي للوجه9،10،11،12.

في هذا العمل ، تم تقييم دور الدماغ الأمامي في تنظيم نمط التعبير الجيني في المنطقة الاقتصادية الحرة عن طريق زرع الدماغ الأمامي البطني بشكل متبادل بين أجنة السمان والبط والكتاكيت ، لأن إشارة من الدماغ الأمامي مطلوبة للحث على تعبير القنفذ الصوتي في المنطقة الاقتصادية الحرة. عمليات زرع الدماغ الأمامي ليست فريدة من نوعها في هذا المجال. تم استخدام عمليات الزرع هذه لتقييم تطور الحركة في أجنة السمان والبط13 ، على الرغم من أنه في هذه التجارب تم أيضا زرع الأنسجة التي ساهمت في المشتقات غير العصبية. في أعمال أخرى ، تم تقييم الدوائر السمعية في الطيور عن طريق زرع الدماغ الأمامي 14 ، لكن عمليات الزرع هذه احتوت على خلايا قمة عصبية مفترضة ، والتي تساهم في تشكيل الوجه9،10 وتشارك في تنظيم تعبير SHH في FEZ15. ومن ثم ، تم ابتكار نظام لزرع الدماغ الأمامي البطني فقط من نوع واحد من الطيور إلى آخر قبل إغلاق الأنبوب العصبي لتقييم دور الدماغ في شكل الوجه16 (الشكل 1 أ ، ب). كانت هذه الطريقة خالية من تلوث القمة العصبية للكسب غير المشروع. في هذه المقالة ، يتم توضيح الطريقة ووصف النتائج المتوقعة ، ومناقشة التحديات التي تواجهها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تحضين بط بيكين الأبيض (Anas platyrhynchos) ودجاج Leghorn الأبيض (Gallus gallus) والسمان الياباني (Cortunix coturnix japonica) عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة حتى يتم مطابقتها في HH7 / 817.

1. تحضير أنسجة المتبرع

ملاحظة: تم وصف تحضير الكواشف والأدوات وكيفية فتح البيض للتلاعب التجريبي6.

  1. قم بإعداد وسائط DMEM باللون الأحمر المحايد ، وماصة نقل الزجاج ، وإبر التنغستن الحادة.
  2. كشف الأجنة (كما هو موضح في6).
  3. حصاد ترقيع الأنسجة من الجانب الأيسر من الدماغ الأمامي القاعدي للمرحلة 7/8 من الأجنة. استخدم إبر التنغستن الحادة المنحنية 6 لشق قطعة من الدماغ الأمامي برفق بطول ~ 0.3 مم وعرض 0.2 مم ، مع التأكد من عدم تضمين الأديم الباطن الأساسي عن طريق تحريك الإبرة أسفل الدماغ الأمامي بحيث تكون الإبرة موازية لمحور الأنبوبالعصبي .
  4. باستخدام ماصة نقل الزجاج ، التقط الكسب غير المشروع من الجنين المانح.
  5. انقل الكسب غير المشروع إلى DMEM الذي يحتوي على أحمر محايد (0.01٪ في PBS ، 23 درجة مئوية) لمدة دقيقتين لتلطيخه ، ثم ضع الكسب غير المشروع الملون في DMEM الذي لا يحتوي على أحمر محايد حتى يصبح جاهزا للنقش.

2. إعداد المضيف

  1. احتضان البيض المخصب من دجاج ليغورن الأبيض (جالوس جالوس) على حرارة 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة حتى HH7 / 8 17.
  2. كشف الأجنة (كما هو موضح في6).
  3. باستخدام إبر التنغستن الحادة ، قم بإعداد موقع الكسب غير المشروع عن طريق القطع برفق ، ثم إزالة قطعة 0.3 مم × 0.2 مم من الدماغ الأمامي القاعدي من الجانب الأيسر لاستيعاب الكسب غير المشروع كما حدث لعزل أنسجة المتبرع.
  4. احرص على تجنب الاضطراب المفرط للأديم الباطن الأساسي ، والذي سيكون واضحا حيث ستبدأ حبيبات صفار البيض في التسرب من خلال أي تمزق يتم إجراؤه. هذا يتطلب ممارسة ولن تنجح كل المحاولات.
  5. بعد الانتقال إلى المضيف6 ، ضع الكسب غير المشروع ليحل محل الدماغ الأمامي القاعدي المستأصل للمضيف.
  6. ضع الشريط بإحكام فوق الفتحة وأعد الجنين إلى حاضنة 37 درجة مئوية للمدة الزمنية المناسبة للتحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم الخيمرية وتلوث الزرع
من أجل تقييم الوهم ، يجب معالجة مدى الوهم وتلوث الكسب غير المشروع بأنواع الخلايا الأخرى. يسمح إنشاء الوهم عن طريق زرع أنسجة السمان في أجنة الفرخ بهذا النوع من التحليل. باستخدام خلايا السمان للأجسام المضادة QCPN يمكن تصورها وتمييزها عن الأنسجة المضيفة (الشكل 1 C ، D). في هذه الحالة ، تم تلطيخ الأنسجة المشتقة من الدماغ الأمامي البطني فقط بالجسم المضاد مما يشير إلى أن الكسب غير المشروع لم يكن ملوثا بأنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الطريقة الموصوفة بفحص تفاعلات الأنسجة بين الدماغ الأمامي القاعدي والأديم الظاهر المجاور. يختلف هذا النهج عن طرق زراعة الدماغ الأمامي السابقة ، لأن أنسجة المتبرع كانت مقصورة على الدماغ الأمامي البطني. هذا يلغي زرع خلايا القمة العصبية ، والتي ثبت أنها تشارك في تشكيل مورفولوجيا الوجه 9,10. ومن ثم ، كان قصر الكسب غير المشروع على الدماغ الأمامي القاعدي ضروريا لتقييم النتائج التجريبية المخطط لها.

في البحث السابق الذي استخدم عمليات زرع ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والقحف الوجهي التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R01DE019648 و R01DE018234 و R01DE019638.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x PBSTEKTEKZR114
35 × 10 مم طبق بتريفالكون1008
DMEMThermofisher11965084
حامل إبرةأدوات العلوم الدقيقة26016-12
أحمر محايدسيجما553-24-2
رقم 5 ملقط دومونأدوات العلوم الدقيقة11252-20
باستور بيبيتسثيرموفيشر13-678-6B
QCPN الأجسام المضادةدراسات النمو بنك الورم الهجين ، جامعة أيوا ، أيوا ، الولايات المتحدة الأمريكية
أدوات العلوم الدقيقة لمقص14058-11
العلوم الدقيقة لإبرة التنغستن26000
أدوات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  2. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
  8. Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
  9. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
  10. Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
  11. Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  12. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  13. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
  14. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
  15. Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
  16. Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
  19. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
  20. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة