Method Article

التوصيف الوظيفي للمتغيرات RYR1 البشرية المعبر عنها داخليا

DOI:

10.3791/62196

⸱

June 9th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Basel University Hospital, 2Department of Life Sciences, University of Ferrara, 3Department of Anesthesia, Basel University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا الأساليب المستخدمة لدراسة التأثير الوظيفي للطفرات RYR1 أعرب عنها محليا في فيروس إبشتاين بار خلدت الإنسان B-الخلايا الليمفاوية وخزعة العضلات المستمدة من خلايا الأقمار الصناعية المتمايزة في myotubes توصف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات في الجين RYR1 في المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيثة التعرض, اعتلال عضلي الأساسية واعتلال عضلي سنترونوي. بسبب الأنماط الظاهرية المتنوعة المرتبطة بطفرات RYR1 ، من الأساسي توصيف آثارها الوظيفية لتصنيف المتغيرات التي يحملها المرضى للتدخلات العلاجية المستقبلية وتحديد المتغيرات غير المسببة للأمراض. وقد اهتمت العديد من المختبرات بتطوير طرق لتوصيف وظيفيا طفرات RYR1 المعبر عنها في خلايا المرضى. هذا النهج له العديد من المزايا، بما في ذلك: يتم التعبير عن الطفرات الذاتية، RyR1 لا يتم التعبير عن أكثر من ذلك، يتم تجنب استخدام الخلايا التعبير عن heterologous RyR1. ومع ذلك ، لأن المرضى قد يقدمون طفرات في جينات مختلفة جانبا RYR1 ، فمن المهم مقارنة النتائج من المواد البيولوجية من الأفراد الذين يأوون نفس الطفرة ، مع خلفيات وراثية مختلفة. تصف المخطوطة الحالية الطرق التي تم تطويرها لدراسة الآثار الوظيفية لمتغيرات RYR1 المعبر عنها محليا في: (أ) خلد فيروس إبشتاين بار الخلايا الليمفاوية B البشرية و(ب) الخلايا الساتلية المشتقة من خزعات العضلات والمتمايزة في الميوتوب. ثم يتم رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجمة عن إضافة المنشطات RyR1 الدوائية. يتم تحميل نوع الخلية المحددة بمؤشر الكالسيوم الفلوري الفلورسنت النسبة ويتم رصد التغيرات داخل الخلايا [Ca2+] إما على مستوى الخلية الواحدة عن طريق المجهر الفلوري أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الطيف. يستريح [Ca2 +] ، ثم تتم مقارنة منحنيات استجابة الجرعة الناهضة بين الخلايا من الضوابط الصحية والمرضى الذين يؤوون المتغيرات RYR1 مما يؤدي إلى نظرة ثاقبة التأثير الوظيفي للمتغير معين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى الآن تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات RYR1 في السكان البشرية وربطها باضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيث (MHS)، ممارسة انحلال الربيدات المستحثة، الأمراض الأساسية المركزية (CCD)، مرض متعدد النوى (MmD)، اعتلال عضلة القلب المركزي (CNM)1،2،3 ; ومع ذلك، فإن الدراسات التي تميز آثارها الوظيفية متخلفة وتم اختبار ما يقرب من 10٪ فقط من الطفرات وظيفيا. يمكن استخدام نهج تجريبية مختلفة لتقييم تأثير متغير RyR1 معين، بما في ذلك نقل خلايا heterologous مثل HEK293 و COS-7 الخلايا مع ترميز البلازميد لWT وRYR1 متحولة cDNA4،5، نقل الخلايا الليفية الماوس خلل التنسيب مع البلازميدات وناقلات ترميز لWT وRYR1 متحولة cDNA ، تليها التحويل مع ميو دال والتمايز في myotubes6 ، جيل من نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا تحمل متحولة RyR1s7،8،9، توصيف الخلايا من المرضى الذين يعبرون عن البديل RYR1 الذاتية10،11،12. وقد ساعدت هذه الأساليب على تحديد كيفية تأثير الطفرات المختلفة وظيفيا على قناة RyR1 Ca2+ .

هنا، يتم وصف الأساليب التي تم تطويرها لتقييم الآثار الوظيفية لطفرات RYR1. يتم التحقيق في معلمات مختلفة من التوازن الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البشرية التعبير عن الذاتية قناة الكالسيوم RyR1، بما في ذلك الميوتوب وفيروس ابشتاين بار (EBV) خلدت الخلايا الليمفاوية B. يتم الحصول على الخلايا من المرضى، وتوسيع نطاقها في الثقافة وتحميلها مع النسبة الفلورسنت الكالسيوم المتهمين مثل Fura-2 أو الهندو-1. يتم قياس المعلمات التي تم الإبلاغ عن تغييرها بسبب طفرات RYR1 المسببة للأمراض بما في ذلك الراحة [Ca2 +] ، والحساسية تجاه ناهضات دوائية مختلفة وحجم مخازن Ca2 + داخل الخلايا إما على مستوى الخلية الواحدة ، باستخدام المجهر الفلوري ، أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الفلوريتر. ثم تتم مقارنة النتائج التي يتم الحصول عليها في الخلايا من ناقلات الطفرات بتلك التي تم الحصول عليها من أفراد عائلة التحكم السليم. وقد أثبت هذا النهج أن: (1) العديد من الطفرات المرتبطة MHS تؤدي إلى زيادة في يستريح [Ca2+] والتحول إلى اليسار في منحنى استجابة الجرعة إما إلى إزالة الاستقطاب الناجم عن KCl أو تنشيط RyR1 الدوائية مع 4-chloro-m-cresol10,11,12,13; '2' الطفرات المرتبطة اتفاقية مكافحة الارتهاق تؤدي إلى انخفاض في الذروة [Ca2 +] صدر عن طريق التنشيط الدوائي من RyR1 وانخفاض حجم إذا كان Ca2 + داخل الخلية مخازن12،13،14،15؛ '3' بعض المتغيرات لا تؤثر على Ca2 + التوازن13. مزايا هذا النهج التجريبي هي: بروتين RyR1 ليس مفرطا في التعبير والمستويات الفسيولوجية موجودة ، ويمكن تخليد الخلايا (كل من خلايا العضلات والخلايا الليمفاوية B) التي توفر خطوط الخلايا التي تحتوي على طفرات. بعض المساوئ تتعلق بحقيقة أن المرضى قد تحمل الطفرات في أكثر من جين واحد ترميز البروتينات المشاركة في التوازن الكالسيوم و / أو اقتران انكماش الإثارة (ECC) وهذا قد يعقد الاستنتاجات التجريبية. على سبيل المثال، تم تحديد اثنين من المتغيرات JP-45 في MHS والسكان السيطرة وتبين وجودها للتأثير على حساسية مستقبلات ثنائي هيدروبيريدين (DHPR) لتنشيط16. ويحتاج المرضى إلى أن يكونوا متاحين، وإلى جمع المواد البيولوجية حديثا، وإلى الحصول على تصاريح أخلاقية من المجالس الأخلاقية المحلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات المذكورة أدناه تتوافق مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية من Ethikkommission Nordwest - أوند Zentralschweiz EKNZ.

1. إعداد إبشتاين بار خلدت خطوط خلايا الخلايا الليمفاوية B11

  1. بعد الموافقة المستنيرة، اجمع 30 مل من الدم الكامل في أنابيب معقمة معالجة من EDTA من البروباند الذي يحمل طفرة RYR1 ومن أفراد الأسرة الأصحاء دون طفرة.
    ملاحظة: حافظ على جميع الحلول معقمة واعمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
  2. عزل الخلايا أحادية النوى من الدم كله بواسطة وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة (على سبيل المثال، Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
    1. ضع 30 مل من الدم العقيم في أنبوب معقم مخروطي سعة 50 مل.
    2. ضع طرف ماصة باستور التي تحتوي على وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة في الجزء السفلي من الأنبوب وطبقة 20 مل معقمة من محلول وسائط الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ببطء تحت الدم.
    3. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 900 × ز عند 18°-20 درجة مئوية، دون انقطاع.
      ملاحظة: تظهر طبقة الخلية أحادية العدد كحلقة غائمة عند الطور الفاصل بين طبقة وسائط الطرد المركزي المتدرجة للكثافة والطبقة العليا التي تحتوي على البلازما الغنية بالصفائح الدموية.
  3. مع ماصة معقمة بلطف إزالة طبقة بين المراحل التي تحتوي على خلايا أحادية نووية (حوالي 3-5 مل) ونقل الحل إلى أنبوب مخروطي معقم نظيف 50 مل.
  4. إضافة 20 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لشطف الخلايا، والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 600 × ز في درجة حرارة الغرفة وإعادة إنفاق بيليه في برنامج تلفزيوني. كرر ما مجموعه ثلاث مرات؛ وهذا يضمن إزالة كافة الوسائط.
  5. بعد الغسيل الأخير ، إعادة الإنفاق الخلايا في 1-2 مل من الأنسجة المتوسطة (RPMI المتوسطة تكملها 10 ٪ مصل العجل الجنيني ، 2 م ل الجلوتامين ، و 100 وحدة من البنسلين والستريبتوميسين). ضع خلايا أحادية نووية (حوالي 1 × 106 خلايا) في قارورة زراعة الأنسجة T125 التي تحتوي على 20 مل من متوسط زراعة الأنسجة.
  6. تصيب الخلايا أحادية النووية بفيروس إبشتاين بار.
    1. استخدام المضادات الفائقة من B95.8 ثقافاتخط الخلية (التي تحتوي على 10 2-103 وحدات تحويل / مل مخزنة في -80 درجة مئوية) كمصدر لEBV.
    2. Resuspend 1 × 106 خلايا أحادية نووية من الخطوة 1.5 في 20 مل من الأنسجة المتوسطة والثقافة ويعرضها ل2 مل من supernatant من خط الخلية B95.8 في وجود السيكلوسبورين A (0.2 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) للعدوى.
  7. ضع القارورة في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية والسماح للخلايا بالنمو. بعد أسبوع واحد تغيير الثقافة المتوسطة.
    ملاحظة: بمجرد أن تبدأ الخلايا B في الانتشار ، فإنها تشكل كتلا يمكن التعرف عليها وتنمو بسرعة بحيث يمكن توسيع الثقافات وتجميدها.
  8. استخراج الحمض النووي الجينومي من EBV خلدت خطوط الخلية B-الليمفاوية11 لتأكيد وجود أو عدم وجود طفرة معينة.

2. قياسات Ca2+ داخل الخلايا

ملاحظة: يمكن رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في خطوط خلايا الخلايا الليمفاوية B-lymphocyte المحولة من EBV في مجموعات الخلايا، مع مقياس الطيف المجهز بحامل التحريك المغناطيسي والكوفيت الذي تم ضبطه على 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك يمكن رصد التغيرات Ca2 + في خلايا واحدة عن طريق المجهر الفلوري. في كلتا الحالتين تتم إزالة الخلايا من قارورة زراعة الأنسجة، وغسلها مرتين مع محلول كريبس رينغر (140 mM NaCl، 5 mM KCl، 1 mM MgCl2، 20 mM HEPES، 1 mM NaHPO4، 5.5 mM الجلوكوز، pH 7.4 تحتوي على 1 mM CaCl2) وتحسب .

  1. للتجارب في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الطيف11،13،14
    1. خلايا ريسوسبند بتركيز نهائي من 1 × 107 خلايا / مل في محلول كريبس رينغر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع تركيز نهائي من 5 ميكرومتر Fura-2/AM.
    2. خلايا الطرد المركزي في 900 x ز لمدة 10 دقيقة وإعادة إنفاقها في محلول كريبس رينغر بتركيز 2 × 106 خلايا / مل.
    3. قياس التغيرات الفلورية (نسبة 340/380 نانومتر) باستخدام مقياس الطيف مجهزة ستيرر المغناطيسي تعيين في السرعة القصوى وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
    4. قبل التجربة تدور الخلايا في 900 × ز لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد الدقيق وإعادة إنفاق بيليه بسرعة في 1.5 مل من الحل كريبس رينغر مع 0.5 M M EGTA ولكن لا وأضاف كا2 +.
    5. ضع الخلايا في 3 مل من الطيف الزجاجي ومقياس الطيف وسجل نسبة الفلورسينس (340 نانومتر/380 نانومتر من الإثارة، انبعاث 510 نانومتر).
    6. تحقيق خط قاعدة مستقرة (حوالي 30 ثانية)، إضافة تركيز مختارة من ناهض RyR1 (4-chloro-m-cresol، أو 4-cmc) وتسجيل عابر الكالسيوم.
      ملاحظة: يتم استخدام محلول مخزون 300 مللي متر من 4 cmc في DMSO كمكشف البداية. يمكن إجراء هذا الحل مقدما، aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
    7. إجراء تجارب لتركيزات 4 cmc مختلفة.
      ملاحظة: تشمل 75 ميكرومتر، 150 ميكرومتر، 300 ميكرومتر، 450 ميكرومتر، 600 ميكرومتر، 750 ميكرومتر إلى 1 م لتوليد منحنى استجابة الجرعة من ناهض مقابل تغيير في [Ca2+]. يتم الحصول على تركيزات 4 cmc المختلفة عن طريق إضافة الحجم المناسب من 4 cmc من محلول المخزون ، مباشرة إلى cuvette التي تحتوي على الخلايا المحملة Fura-2. على سبيل المثال، لتركيز نهائي من 300 ميكرومتر 4-cmc، يتم إضافة 1.5 ميكرولتر من محلول المخزون إلى cuvette التي تحتوي على 1.5 مل من الخلايا في محلول كريبس رينغر. بالنسبة للتركيزات الناهضة المنخفضة، يجب تخفيف محلول مخزون 300 مللي متر إلى 75 مللي متر مع DMSO وإضافة الحجم المناسب إلى الكوفيت الذي يحتوي على 1.5 مل من الخلايا في محلول كريبس رينغر.
    8. إضافة 400 nM thapsigargin إلى الخلايا لحساب المبلغ الإجمالي للCa2 + موجودة في مخازن داخل الخلايا. سجل ذروة Ca2+.
    9. رسم ذروة الكالسيوم الناجم عن تركيز 4 cmc معين مقابل ذروة الكالسيوم الناجم عن thapsigargin، والذي يعتبر 100٪ وبناء منحنى استجابة جرعة 4 cmc مقارنة الخلايا من proband وقريب صحي
  2. للتجارب على خلايا مفردة13
    1. تمييع بولي-L-ليسين 1:10 في H2O معقمة وقبل علاج الأغطية الزجاجية لمدة 30 دقيقة. السماح للهواء الجاف تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة العقيمة.
    2. إعادة تعليق EBV تحويل الخلايا الليمفاوية B إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل في محلول كريبس رينغر التي تحتوي على 1 mM CaCl2 وإضافة تركيز نهائي من 5 ميكرومتر Fura-2/AM.
    3. ضع 1 مل من الخلايا على الأغطية المعالجة بولي-ل-ليسين واحتضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلايا الرطبة لمدة 30 دقيقة للسماح لخلايا EBV بالتمسك بزلة الغطاء الزجاجي أثناء التحميل.
    4. ضع غطاء في غرفة التشوه وابدأ التشوه (بمعدل 2 مل/دقيقة) مع محلول كريبس رينغر الذي يحتوي على 1 mM Ca2+.
    5. استخدم مجهر فلوري مقلوب (مجهز بهدف غمر الزيت 40x (فتحة رقمية 0.17)، والمرشحات (BP 340/380، FT 425، BP 500/530) لتسجيل القياسات عبر الإنترنت، مع مرفق كاميرا جهاز اقتران الشحنة التي يتم التحكم فيها بالبرامج (CCD).
    6. الحصول على الصور على فترات 1 ق في وقت التعرض الثابت (100 مللي ثانية لكل من 340- و 380 نانومتر أطوال موجية الإثارة. استخدم برنامج التصوير لتحليل التغيرات في الفلورسينس. قياس متوسط قيمة بكسل لكل خلية في أطوال موجية الإثارة من 340 و 380 نانومتر13.
    7. لتحقيق تحفيز الخلية، استخدم محفز تغلغل الخلية مع 12 صماما وإضافة تركيزات مختلفة من 4 cmc. صمام تدفق يحتوي على حل كريبس رينغر مع عدم إضافة Ca2 + بالإضافة إلى 100 μM La3 + لمراقبة إطلاق الكالسيوم من المتاجر داخل الخلايا فقط.
    8. بناء منحنى استجابة الجرعة من 4 cmc مقابل التغيير في [Ca2 +] ، كما هو موضح أعلاه.

3. إعداد myotubes الإنسان من خزعات العضلات10،12،15

ملاحظة: استخدمت مختبرات مختلفة أساليب مختلفة للحصول على الخلايا الميوبلاستة الميوباتية المشتقة بالخلايا الساتلية والميوتوب. وفيما يلي وصف للطريقة المستخدمة في بازل.

  1. شطف خزعة العضلات مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم الزائد وقطع إلى شظايا صغيرة من حوالي 0.5-1 ملم.
  2. إعداد 6 أطباق زراعة الأنسجة جيدا مع إدراج. إضافة 1.5 مل من نمو العضلات البشرية المتوسطة لكل بئر و 0.5 مل من نمو العضلات البشرية المتوسطة لكل إدراج.
    ملاحظة: يتكون متوسط النمو على النحو التالي: 500 مل من متوسط النسر المعدل في Dulbecco مع ارتفاع الجلوكوز، أو DMEM (4.5 ملغم / مل) ، تحتوي على مصل حصان 10 ٪ ، 5 نانوغرام / مل الأنسولين ، 3 مللي متر الجلوتامين ، 600 نانوغرام / مل البنسلين G والستريبتوميسين ، و 7 M HEPES ، درجة الحموضة 7.4. ويمكن أيضا المتاحة تجاريا الهيكل العظمي نمو العضلات المتوسطة يمكن استخدامها.
  3. ضع 2-3 شظايا العضلات الصغيرة في كل إدراج (الشكل 1A) ووضع أطباق الثقافة في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية). بعد ما يقرب من 8-10 أيام يمكن رؤية خلايا الأقمار الصناعية تنمو من ومحيط خزعة العضلات، تعلق على إدراج(الشكل 1،B و C، والسهام).
  4. إطلاق عدد كاف من الخلايا من الخزعة (بعد حوالي 10-14 يوما)، حاول على النحو التالي:
    1. إزالة كل ثقافة المتوسطة، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 0.5 مل من حل تريبسين / EDTA (0.025٪ تريبسين و 0.01٪ EDTA) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. إضافة 1 مل من متوسط النمو إلى الخلايا لتحييد تأثير التريبسين ونقل خلايا الأقمار الصناعية إلى قارورة جديدة لثقافة الخلايا T25؛ إضافة 3 مل من متوسط النمو ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
    3. تغيير متوسط النمو في اليوم التالي لإزالة EDTA وتغيير المتوسط مرة واحدة في الأسبوع.
  5. عندما تكون الخلايا الميوبلاستية التقاء 75٪ تقريبا، جرب ونقلها إلى غطاء الزجاج المعالج بالنعناع.
    ملاحظة: كنسبة، يجب نقل الخلايا التي تنمو في قارورة T25 واحدة على غطاء زجاجي واحد معالج بالنعناع قطره 43 مم. يجب وضع غطاء الزجاج داخل لوحة زراعة الأنسجة قطرها 60 ملم تحتوي على 3 مل من متوسط النمو.
  6. تنمو الخلايا على غطاء الزجاج في المتوسط النمو في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية) تغيير المتوسط مرة واحدة في الأسبوع. في التقاء 90٪، والتحول إلى التمايز المتوسطة تتكون على النحو التالي: ارتفاع الجلوكوز DMEM (4.5 ملغ / مل)، 0.5٪ ألبوم مصل البقري، 10 نانوغرام/ مل عامل نمو البشرة، 0.15 ملغم/مل الكرياتين، 5 نانوغرام/مل الأنسولين، 200 مللي متر الجلوتامين، 600 نانوغرام/مل البنسلين G والستريبتوميسين، و 7 مللي متر HEPES، pH 7.4). ويمكن أيضا استخدام وسيطة التمايز المتاحة تجاريا. تغيير وسيط التمايز مرة واحدة في الأسبوع.
  7. بعد 7-10 أيام في المتوسط التمايز، myotubes متعددة النوى مرئية. تقييم للتغيرات في [Ca2+] في غضون أسبوع واحد، كما هو موضح أدناه.

4. [Ca2 +]i قياسات النسبة المحددة مع Fura-2

  1. تحميل الزجاج coverlip نمت myotubes مع Fura-2/AM (التركيز النهائي من 5 ميكرومتر) المخفف في DMEM لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. لفترة وجيزة، وإزالة وسيطة التمايز من الخلايا المزروعة coverlip الزجاج وإضافة 2 مل متوسط التمايز الطازجة. إضافة 10 ميكرولتر من Fura-2 AM من محلول مخزون 1 mM واحتضان 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
  2. نقل الزجاج coverlip إلى غرفة التغلغل وشطف الخلايا مع محلول كريبس رينجر التي تحتوي على 2 MM CaCl2.
  3. إجراء قياسات على الإنترنت [Ca2+] كما هو موضح أعلاه في قسم الخلية الواحدة EBV باستخدام هدف FLUAR غمر الماء 20x (0.17 فتحة رقمية).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[Ca2+]i القياسات في مجموعات من الخلايا الليمفاوية B EBV الخالدة
الخلايا الليمفاوية B الأولية التعبير عن ايزوفورم RyR1 التي تعمل كقناة Ca2 + الافراج خلال مستقبلات مستضد الخلية B حفز عمليات الإشارات17. تخليد الخلايا B مع EBV، وهو إجراء يستخدم بشكل روتيني من قبل علماء الوراثة للحصول على خطوط الخلايا التي تحتوي على معلومات الجينوم للمرضى، ويوفر ميزة توليد خطوط الخلايا التي تعبر عن ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت بنجاح البروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة من قبل العديد من المختبرات لدراسة تأثير الطفرات RYR1 على التوازن الكالسيوم. وتتناول الخطوات الحاسمة للنهج المبينة في هذه الورقة العقم ومهارات وتقنيات زراعة الخلايا وتوافر المواد البيولوجية. من حيث المبدأ ، فإن استخدام الخلايا الليمفاوية B التي خلدها EBV أبسط ويسمح للمرء بتوليد خطوط الخلايا التي تحتوي على قنوات RyR1 المتحولة. يمكن تجميد الخلايا وتخزينها في النيتروجين السائل لسنوات عديدة ويمكن إعادة بدء الثقافات في أي وقت. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن يختار ما إذا كا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة بمنح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNF) ومؤسسة العضلات السويسرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-m-cresolFluka24940
أنابيب جمع الدمSarstedt172202
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichA7906
الكافيينMerk102584
Cascade 125+ CCDالكاميرا القياسات الضوئية
تتالي 128+ CCDالقياسات
الكرياتينسيجما ألدريتشC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
عامل نمو البشرة (EGF)سيجما ألدريتشE9644
فيكول باكسيتيفا17144002
مصل ربلة الساق الجنينيةThermoFisher Scientific26140079
Fura-2 / AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Horse SerumThermo Fisher Scientific16050122
الأنسولينThermoFisher A11382II
IonomycinSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
LamininThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
نظام التروية الدقيقةALA-ScientificDAD VM 12 صمام مشعب
المنشأبرنامجOriginLab Corp
Pennicillin / StreptomycinGibco Life Sciences15140-122
غرفة التروية POC-RPecon000000-1116-079
بولي إل ليسينسيجما ألدريتشP8920
RPMIمقياس الطيفالفلوري 21875091
العلمي بيركين إلمرLS50
أطباق زراعة الأنسجة ThapsigarginCalbiochem586005
Falcon353046
قارورة زراعةالأنسجة Falcon353107
إدراج زراعة الأنسجة Falcon353090
محلول التربسين / EDTAThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware
Zeiss Axiovert S100 مجهر التلفزيونCarl Zeiss AG
Zeiss أغطية زجاجيةZeiss AG0727-016
الضوئيةالعلمي برنامج الحراري Carl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
  2. Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
  3. Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
  4. Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
  5. Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
  6. Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
  7. Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
  8. Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
  9. Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
  10. Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
  11. Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077(2001).
  12. Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
  13. Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
  14. Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
  15. Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
  16. Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
  17. Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
  18. Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
  19. Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
  20. Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
  21. Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372(2016).
  22. Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
  23. Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
  24. Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
  25. Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
  26. Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
  27. Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RYR1 VariantsCalcium HomeostasisIntracellular CalciumFluorescence MicroscopySpectrofluorometer AnalysisB LymphocytesHuman MyotubesFura 2 AMDose Response CurveMalignant Hyperthermia

Related Articles