دراسات عالية الدقة للبروتينات في الأغشية الطبيعية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة

ملخص

يوضح هذا العمل بالتفصيل إجراءات أساسية قوية حول كيفية تحضير عينات البروتين الغشائي المسمى بالنظائر وتحليلها بدقة عالية باستخدام طرق التحليل الطيفي الحديثة للرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة.

الملخص

تعتبر بروتينات الغشاء حيوية لوظيفة الخلية وبالتالي تمثل أهدافا دوائية مهمة. يوفر التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (ssNMR) وصولا فريدا لاستكشاف بنية وديناميكيات هذه البروتينات في الأغشية البيولوجية ذات التعقيد المتزايد. هنا ، نقدم التحليل الطيفي الحديث للرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة كأداة لدراسة بنية وديناميكيات البروتينات في الأغشية الدهنية الطبيعية وعلى النطاق الذري. تستفيد هذه الدراسات الطيفية من استخدام طرق ssNMR عالية الحساسية ، أي ssNMR المكتشفة بالبروتون (¹H) و DNP (الاستقطاب النووي الديناميكي) المدعومة ب ssNMR. باستخدام بروتين برميل بيتا للغشاء الخارجي البكتيري BamA والقناة الأيونية KcsA ، نقدم طرقا لإعداد بروتينات الغشاء المسمى بالنظائر واستخلاص المعلومات الهيكلية والحركية بواسطة ssNMR.

المقدمة

تشكل الدراسات الهيكلية والحركية لبروتينات الغشاء في البيئات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تحديا لتقنيات البيولوجيا الهيكلية^{التقليدية 1}. تقدم طرق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة الحديثة (ssNMR) نهجا فريدا لتوصيف بروتينات الغشاء^{2،3،4،5،6،7} وقد استخدمت منذ فترة طويلة لدراسة بروتينات الغشاء ، بما في ذلك مضخات البروتين المدمجة^{بالغشاء 8} ، والقنوات^9،10،11 ، أو المستقبلات^{12،13، 14،15}. التطورات التقنية مثل المجالات المغناطيسية فائقة الارتفاع >1,000 ميجاهرتز ، وترددات الدوران السريعة بزاوية سحرية >100 كيلو هرتز ، وتقنيات فرط الاستقطاب¹⁶ قد أنشأت ssNMR كطريقة قوية لدراسة بروتينات الغشاء في البيئات ذات التعقيد المتزايد باستمرار من الجسيمات الشحمية إلى أغشية الخلايا وحتى الخلايا الكاملة. على سبيل المثال ، أصبح DNP أداة قوية لمثل هذه التجارب (انظر المرجع^{17،18،19،20،21،22،23،24،25}). في الآونة الأخيرة ، يوفر ¹ssNMR المكتشف H إمكانيات متزايدة لدراسة بروتينات الغشاء بدقة طيفية عالية وحساسية^{25،26،27،28،29}. يسلط هذا العمل الضوء على اثنين من بروتينات الغشاء البكتيرية التي تشارك في الوظائف الأساسية ، أي إدخال البروتين ونقل الأيونات. البروتينات المقابلة ، BamA^{25،30،31،32،33} و KcsA^{23،27،28،34،35،36،37،38،39} (أو المتغيرات الوهمية^{منها 10،40}) تم فحصها بواسطة ssNMR الأساليب لأكثر من عقد من الزمان.

يتم هنا تقديم بروتوكول تمثيلي لإعداد وتوصيف ssNMR لبروتينات الغشاء البكتيرية المنشأ. يتم عرض الخطوات المختلفة للبروتوكول في الشكل 1. أولا ، يتم شرح التعبير ووضع العلامات على النظائر والتنقية وإعادة تشكيل الغشاء ل BamA. بعد ذلك ، يتم تقديم سير عمل عام لتوصيف بروتين الغشاء بواسطة ssNMR ؛ على وجه التحديد ، تعيين العمود الفقري للبروتين الغشائي باستخدام ¹H المكتشف ssNMR في زاوية سحرية سريعة. أخيرا ، تم تفصيل الإعداد الأساسي والاكتساب للتجارب المدعومة بالاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) ، والتي تعزز بشكل كبير حساسية إشارة ssNMR.

البروتوكول

1. إنتاج ^{2 H ، 13}C ، ¹⁵N-Label BamA-P4P5

ملاحظة: في حين أن هذا البروتوكول يتطلب العمل مع البكتيريا سالبة الجرام غير المسببة للأمراض ، فإن الالتزام بإجراءات السلامة البيولوجية الأساسية أمر لا بد منه ، أي ارتداء نظارات السلامة ومعاطف المختبر والقفازات واتباع إجراءات التشغيل المؤسسية القياسية للعمل مع الكائنات الحية الدقيقة.

1. استخدم مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية BL 21 Star (DE3) التي تحتوي على ترميز البلازميد pET11aΔssYaeT للإشريكية القولونية BamA-P4P5 لتلقيح 50 مل من مرق Lysogeny المكمل ب 50 ميكروغرام / لتر من الأمبيسلين.
2. قم بزراعة الثقافة عند 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى OD₆₀₀ من 0.6. تدور في 2,000 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 50 مل من M9 (انظر الجدول 1) إلى حد أقصى_{OD 600} من 0.1.
   ملاحظة: تتم جميع خطوات النمو المستقبلية في الظروف المذكورة أعلاه ما لم يذكر خلاف ذلك.
3. قم بزراعة الثقافة حتى OD₆₀₀ من 0.5. تدور عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في 50 مل من M9 تحتوي على 90٪ D₂O (انظر الجدول 1 للوصفة) إلى حد أقصى_{OD 600} من 0.1. قم بزراعة المزرعة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة.
4. قم بتدوير المزرعة عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في 50 مل 90٪ D₂O M9 إلى OD₆₀₀ كحد أقصى 0.1. تنمو حتى يتم الوصول إلى_{OD 600} من 1.0.
5. قم بتدوير المزرعة عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحضير 100 مل من وسط 100٪ D₂O M9 بكميات غنية بالنظائر من الجلوكوز غير المخصب وكلوريد الأمونيوم. قم بالتعليق في 100٪ D₂O M9 متوسطة إلى OD₆₀₀ كحد أقصى قدره 0.1. تنمو حتى يتم الوصول إلى OD₆₀₀ من 0.7.
6. قم بتدوير المزرعة عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 مل من وسط 100٪ D₂O M9 مع النظائر (انظر الجدول 1) إلى حد أقصى_{OD 600} من 0.1.
7. اسمح للثقافة بالنمو حتى يتم الوصول إلى OD₆₀₀ من 0.6-0.9. يحفز ب 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG). قم بالتعبير لمدة 4 ساعات وحصاد الخلايا عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

2. التنقية وإعادة الطي وتشكيل الجسيمات البروتينية الشحمية BamA-P4P5

ملاحظة: يجب إجراء جميع خطوات هذا القسم في غطاء الدخان. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند فتح الأنابيب بعد الطرد المركزي يحد من الهباء الجوي الضار.

1. قم بإذابة الحبيبات على الثلج. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من العازلة الباردة 1. انظر الجدول 2 للاطلاع على المخازن المؤقتة.
2. قم بتدوير المحلول عند 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من H₂O المقطر على البارد ، اترك التعليق يحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق.
3. قم بتدوير التعليق عند 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد التعليق في 10 مل Buffer البارد 2 واتركه يحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
4. استكمل الخليط ب 10 مل إضافية من المخزن المؤقت البارد 2 واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى على الثلج. أضف 0.5٪ n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) ولفها برفق.
5. قم بتقطيع العينة على الجليد عند 13 كيلو هرتز حتى الاستخدام الشرير لمدة 10 ثوان من نبضات التشغيل / الإيقاف. قم بالدوران عند 25,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل ثلاث مرات باستخدام 20 مل من Buffer 3. جهاز طرد مركزي عند 25,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من Buffer 4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتشغيل العينة على الجليد عند 13 كيلو هرتز ، حتى يتم استخدام نبضات التشغيل / الإيقاف بطول 10 ثوان.
7. قم بتدوير العينة عند 25,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6 مع حذف إضافة مثبط الإنزيم البروتيني والحضانة عند 37 درجة مئوية.
8. اغسل الحبيبات ب 20 مل من الماء ومرتين باستخدام Buffer 3. قم بالدوران عند 25,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتقسيم التعليق إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1 مل وقم بتدوير أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بأقصى سرعة على جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لمدة 20 دقيقة. يتم تقييم نقاء الجسم المدرج بواسطة هلام SDS-Page بنسبة 10٪ ، انظر الشكل 2 أ. العائد المتوقع ل BamA-P4P5 المنقى ثلاث مرات (²ساعة ، ¹³درجة مئوية ، ¹⁵نيوتن) المسمى هو 30 مجم / لتر.
9. قم بإذابة الأجسام المدرجة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5 و 300 ميكرولتر من H₂O. أضف 6M من كلوريد الجوانيديوم (GdnCl). اضبط حجم أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى 1 مل باستخدام H₂O. دوامة الخليط واحتضانه لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. دوامة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بشكل دوري (كل 30 دقيقة).
10. تدور عند 100,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. استخدم قانون بير لامبرت لتحديد تركيز البروتين بمقدار 280 نانومتر. معامل الانقراض المولي هو 117،120 م ^-1سم ^-1. إذا كان التركيز >100 ميكرومتر ، فقم بتخفيفه باستخدام 1x Buffer 5 مع 6 M GdnCl. قم بتخفيف البروتين بسرعة 10x في Buffer 6. احتضن الخليط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بالنسبة للطرد المركزي الفائق ، استخدم أنابيب الطرد المركزي الفائق 1.5 مل.
11. حدد كفاءة إعادة الطي باستخدام جل SDS-Page شبه الأصلي. خذ مقاصتين سعة 10 ميكرولتر من الخطوة 2.10 وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت Lameili (المخزن المؤقت 8) إلى كل حصة. اغلي عينة واحدة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية ؛ اترك الكمية الأخرى على الجليد. بعد ذلك ، قم بتشغيل كلتا العينتين عند 14 مللي أمبير على هلام SDS-Page بنسبة 10٪. تفتقر أجزاء التكديس والتشغيل من المواد الهلامية إلى عامل الاختزال و SDS. يتم تحقيق تلطيخ البروتين باستخدام صبغة Coomassie. النتائج المتوقعة موضحة في الشكل 2 ب.
12. قم بتدوير العينة عند 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ركز العينة على حجم عمل يبلغ 8 مل باستخدام مرشح طرد مركزي 30 كيلو دالتون. قم بتدوير العينة عند 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بقياس امتصاص البروتين عند 280 نانومتر. كما في الخطوة 2.10 ، حدد تركيز البروتين.
13. احسب كمية الدهون المطلوبة لنسبة الدهون إلى البروتين 10: 1 (LPR-mol / mol). من مخزون الكلوروفورم ، أضف الكمية المطلوبة من الدهون ، كما هو محسوب، في الخطوة 2.12 ، في قارورة قاع مستديرة سعة 100 مل (RBF). قم بإخلاء الكلوروفورم من RBF تحت تيار لطيف من النيتروجين. ضع RBF على فراغ عالي لمدة 3 ساعات. رطب طبقة الدهون ب 1 مل من Buffer 7. احتضان RBF لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
14. أضف خليط البروتين (من الخطوة 2.12) إلى RBF.
15. خفف خليط البروتين / الدهون (من الخطوة 2.14) إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل في RBF. استخدم Buffer 7 المكمل بمثبط 1x للبروتياز المذاب في DMSO واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
16. غسيل الكلى ضد 100 حجم من العازلة 7 لمدة أسبوعين (استخدم 12-14 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع أنابيب غسيل الكلى). في أول 24 ساعة ، قم بإجراء غسيل الكلى في درجة حرارة الغرفة مع إضافة Buffer 7 الطازج كل 8 ساعات. بعد ذلك ، قم بتغيير المخزن المؤقت مرة واحدة يوميا ، وإجراء غسيل الكلى عند 4 درجات مئوية.

3. ملء دوار ssNMR

1. بعد الخطوة 2.16 ، جهاز الطرد المركزي لمدة 30-60 دقيقة عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية بحيث يتم تشكيل حبيبات. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
   ملاحظة: تم تحسين التقنية التي تمت مناقشتها أدناه لدوار مقاس 3.2 مم ولكنها قابلة للتطبيق على أي قطر دوار تقريبا.
2. قم بضرب العينة في الدوار وقم بتدويرها برفق باستخدام جهاز طرد مركزي للطاولة.
   ملاحظة: اعتمادا على تناسق العينة، يمكن للمرء إما استخدام أداة تكثيف لضغط العينة، أو ملعقة بدلا من الماصة لوضع العينة في الدوار.
3. كرر هذه العملية 2-3x حتى يتم ملء الدوار إلى الارتفاع الصحيح وتحقق مما إذا كانت هناك مساحة كافية للغطاء المتبقي ، كما هو موضح في خط العلامة على أداة التكثيف. أغلق الدوار باستخدام أداة وضع الغطاء على سطح مستو. ضع علامة على نصف الحافة السفلية للدوار.
   ملاحظة: تأتي أجيال الدوار ssNMR الجديدة مع علامة ليزر متينة على الحافة السفلية للكشف البصري عن تردد دوران الدوار. خلاف ذلك ، يقترح استخدام قلم شاربي ؛ حيث تم تحسين كاشف MAS خصيصا لحبر Sharpi.
4. استخدم عدسة مكبرة للتحقق مما إذا كان الغطاء في وضع جيد.

4. توصيف العينة بواسطة التحليل الطيفي 2D ^{13 C-13}C ssNMR

1. أدخل الدوار في المغناطيس ، باستخدام روتين الغزل التلقائي لوحدة MAS ، قم بتدوير العينة حتى تردد MAS المطلوب بين 10 و 20 كيلو هرتز MAS أثناء تبريد العينة إلى درجة حرارة 270 كلفن. ضبط ومطابقة القناتين ¹H و ¹³C.
   ملاحظة: لاختيار تردد MAS ، تجنب مطابقة مسافة التحول الكيميائي عن طريق الخطأ بين منطقة Cα الطيفية ومنطقة الكربونيل الكربوني مع تردد الدوران ، أي تجنب حالة الرنين الدوراني من الدرجة الأولى⁴¹.
2. قم بتحسين تجربة الاستقطاب المتبادل ^{1 H-13}C⁴² (CP) عن طريق تغيير طاقة التردد اللاسلكي على قناة البروتون من 25-80 كيلو هرتز. المعلمات النموذجية هي طاقة الترددات اللاسلكية 45 كيلو هرتز على ¹³درجة مئوية ، 80-100 كيلو هرتز غير متجانسة ^{، 1}فصل H⁴³ أثناء الاستحواذ ، تأخير إعادة التدوير 1.8-2.0 ثانية ، و 64 عملية مسح.
   1. قم بتحسين وقت التلامس CP للحصول على أقصى حساسية للإشارة على الكربون الأليفاتي.
   2. حدد طول ^{النبضة 1}H 90 ° في تجربة ¹³C-CP بضرب نبضة البداية في أربعة ، أي عن طريق تحسين نبضة 360 درجة ، وتغيير الطول حتى تختفي الإشارة. قم بتضمين نبضة مستطيلة مباشرة بعد نقل CP وقم بتحسين طول النبضة ¹³درجة مئوية 90 درجة بالتضاغط.
3. قم بإجراء تجربة من نوع انتشار الدوران المدفوع بالبروتون (PDSD) 2D ^{13 C-13}C مثل PARIS مع وقت نقل مغنطة يبلغ 30 مللي ثانية للكشف عن الارتباطات بين المتبقية وقياس جودة العينة. انقل مستويات الطاقة ووقت التلامس وأطوال النبضة 90 درجة من تجربة ¹³C-CP المحسنة مسبقا. استخدم وقت اكتساب يتراوح بين 4 و6 مللي ثانية في البعد غير المباشر. قم بمعالجة الطيف باستخدام وظائف جرس الخطيئة التربيعية (QSIN) أو ، بالنسبة للعينات غير الحساسة ، توسيع الخط الأسي في كلا البعدين.
4. استخرج شرائح من القمم المتقاطعة المعزولة وحدد عرض الخط عند نصف الارتفاعات. يشير عرض الخط بين ~ 0.3-1.0 ¹³درجة مئوية جزء في المليون إلى عينة جيدة الترتيب ، وهي مثالية لتوصيف ssNMR ، في حين أن عرض الخط فوق 1.0 ¹³درجة مئوية جزء في المليون يدل على عدم التجانس التوافقي الذي قد يضر بتوصيف ssNMR. طيف 2D CC PARIS من BamA الموضح في الشكل 3 أ هو مثال على بروتين جيد الترتيب يعطي أطياف عالية الجودة.

5. تعيين العمود الفقري عن طريق التحليل الطيفي ثلاثي الأبعاد ssNMR المكتشف على ^{شكل حرف H}

1. الحصول على بصمات الأصابع الطيفية 2D NH
   1. املأ العينة بدوار 1.3 مم ، كما هو موضح أعلاه. أدخل الدوار في المغناطيس ، وقم بتدوير العينة إلى 10-20 كيلو هرتز MAS وتبريد العينة إلى درجة حرارة 240-250 كلفن أو أقل ، اعتمادا على مواصفات مسبار ssNMR. أستنتج واجهة وحدة MAS لزيادة تردد MAS تدريجيا في خطوات من kHz 5 إلى 60 kHz MAS.
   2. تحسين اتساع CP وأوقات التلامس وأطوال النبضة 90 درجة في تجارب ¹³درجة مئوية و ¹⁵نيوتن CP. استخدم السعات حوالي 30-50 أو 70-100 كيلو هرتز على القنوات النووية غير المتجانسة وقم بتغيير السعة على القناة ¹H من 80-180 كيلو هرتز. استخدم تأخير إعادة التدوير من 0.7-1.2 ثانية ، جنبا إلى جنب مع فصل البروتون غير المتجانس النووي منخفض الطاقة 15 كيلو هرتز⁴⁴. انظر أيضا المرجع⁴⁵ للحصول على مزيد من التفاصيل العملية حول كيفية إعداد تجارب CP ssNMR.
   3. احصل على تجربة 2D NH لقياس دقة ¹H. انقل معلمات N-CP ¹⁵واستخدم زمن اكتساب 15 و25 مللي ثانية تقريبا في الأبعاد المباشرة وغير المباشرة. بالنسبة لأول نقل ^{من 1}ساعة إلى ¹⁵نيوتن سى بي، استخدم وقت الاتصال المحسن مسبقا. بالنسبة للنقل الخلفي ^{من 15}نيوتن إلى ¹ساعة ، استخدم وقت التلامس 0.7-1.0 مللي ثانية لتقليل نقل المغنطة المتبقية.
   4. استخدم قمع ميسيسيبي من 50 إلى 250 مللي ثانية⁴⁶ ، اعتمادا على محتوى الماء العينة. قم بمعالجة الطيف باستخدام وظائف جرس الخطيئة التربيعية (QSIN) في كلا البعدين. استخرج شرائح من القمم المتقاطعة المعزولة وحدد عرض الخط عند نصف الارتفاعات. يظهر مثال على طيف NH ثنائي الأبعاد²⁵ عالي الجودة ل BamA-P4P5 المضمن في الغشاء في الشكل 3 ب.
2. مهام العمود الفقري
   1. تحسين تجربة CP محددة من 1D ¹⁵N إلى ¹³Cα⁴⁷. ضع الموجة الحاملة ¹³درجة مئوية في منتصف منطقة Cα حوالي 55 جزء في المليون. استخدم سعة تردد لاسلكي ¹³درجة مئوية تبلغ 20 كيلو هرتز وقم بتغيير سعة ¹⁵نيوتن من 35 إلى 45 كيلو هرتز للنقل الأقصى إلى إشارات Cα والحد الأدنى من النقل إلى إشارات الكربونيل. قم بتحسين وقت الاتصال من 3 إلى 10 مللي ثانية بزيادات قدرها 1 مللي ثانية.
   2. قم بإجراء تجربة 3D CαNH. انقل جميع سعات CP وأوقات التلامس وأطوال النبضات من الخطوات المحسنة مسبقا. استخدم ما يقرب من 10 مللي ثانية و 30 مللي ثانية في أبعاد الاستحواذ غير المباشرة والمباشرة. قم بمعالجة الطيف باستخدام وظائف جرس الخطيئة التربيعية (QSIN) في جميع الأبعاد الثلاثة.
   3. تحسين نقل مغنطة 1D Cα إلى CO DREAM⁴⁸. ابدأ بنقل CP ^{محدد من 15}نيوتن إلى ¹³درجة مئوية. بعد ذلك ، انقل المغنطة من Cα إلى ثاني أكسيد الكربون باستخدام قفل الدوران على قناة ¹³درجة مئوية. قم بتغيير سعة التردد اللاسلكي من 20 إلى 35 كيلو هرتز للنقل الأمثل. تحسين وقت النقل من 4 إلى 10 مللي ثانية.
   4. قم بإجراء تجربة 3D Cα (CO) NH. انقل جميع اتساع الترددات اللاسلكية وأوقات التلامس وأطوال النبضة من الخطوات المحسنة مسبقا. استخدم ما يقرب من 10 مللي ثانية و 30 مللي ثانية في أبعاد الاستحواذ غير المباشرة والمباشرة. قم بمعالجة الطيف باستخدام وظائف جرس الخطيئة التربيعية (QSIN) في جميع الأبعاد الثلاثة.
   5. كرر الخطوات من 1 إلى 4 وتكييفها لتجارب 3D CONH و CO (Cα) NH المماثلة. استخدم هذه التجارب الرباعية ثلاثية الأبعاد للمشي المتسلسل Cα و CO لتعيين العمود الفقري للبروتين ، كما هو موضح في مثال KcsA في الشكل 4²⁸.

6. ديناميكيات البروتين عن طريق ^{التحليل}الطيفي ssNMR المكتشف H

1. بالنسبة ^{لدراسات 15}N T₁ ، استخدم تجربة 2D NH المحسنة مسبقا عند 60 كيلو هرتز MAS وقم بتضمين تأخير بعد خطوة الاستقطاب المتبادل ^{الأولى من 1}H إلى ¹⁵N. احصل على سلسلة من تجارب 2D NH وقم بتغيير التأخير من 0 إلى 16 ثانية باستخدام خطوات ، على سبيل المثال ، 0 و 2 و 4 و 8 و 16 ثانية.
2. ارسم الشدة الطبيعية للإشارات التي تم حلها كدالة لوقت التأخير المتزايد. قم بتركيب اضمحلال T₁ مع الأس الفردية وفقا ل y = exp ^{(-x / T1)} ، مع كون y هي شدة الإشارة في وقت الاضمحلال x.
3. وبالمثل ، بالنسبة ^{لدراسات 15}N T_1rho ، قم بتضمين نبضة قفل الدوران في برنامج النبض على قناة ¹⁵N بسعة rf بين 15-20 كيلو هرتز بعد خطوة الاستقطاب المتبادل ^{الأولى من 1}H إلى ¹⁵N^26،49. احصل على سلسلة من تجارب 2D NH وقم بتغيير التأخير من 0 إلى 150 مللي ثانية وقم بملاءمة اضمحلال T_1rho للإشارات التي تم حلها إلى أس مفرد. يتم عرض بيانات توضيحية ¹⁵N T_1rho لقنوات K ⁺ المضمنة في الغشاء في الشكل 5^27،28.

7. الاستقطاب النووي الديناميكي

ملاحظة: تتعلق الخطوات التحضيرية التالية باستخدام إعدادات DNP التجارية باستخدام دوارات MAS من الياقوت مقاس 3.2 مم (الشكل 6)²⁰. قد يؤدي استخدام دوارات الزركونيا أو غيرها من معدات DNP إلى تحسين إشارة DNP أقل.

1. أعد تعليق حبيبات البروتين الغشائي (من الخطوة 3.1) في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNP الديوتيرات (60٪ (حجم / حجم) d8- والجلسرين ، و 15 ملي مولار AMUPol⁵⁰. بالنسبة للتجارب بسرعة 800 ميجاهرتز ، نوصي باستخدام 10 ملي مولار NATriPOL-3⁵¹. انظر أيضا المرجع⁵² لمزيد من الجوانب العملية لتجارب DNP ssNMR.
2. جهاز طرد مركزي لمدة 10-20 دقيقة عند 100,000 × جم عند 4 درجات مئوية بحيث يتم تشكيل حبيبات. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
3. قم بتبريد محول الطرد المركزي ومكونات الدوار MAS الياقوتي مقاس 3.2 مم إلى <4 درجة مئوية. يجب القيام بالخطوات التالية (7.4-7.7) في أسرع وقت ممكن لمنع تقليل عوامل DNP.
4. ضع دوار الياقوت مقاس 3.2 مم في محول جهاز الطرد المركزي واملأه بتعليق الجسيمات الشحمية البروتينية من الخطوة 7.2.
5. ماصة عينة البروتين الغشائي المعلق على الجدار الداخلي للدوار بعناية باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. اسمح للمحلول بالانزلاق لأسفل إلى أسفل الدوار. تأكد من عدم تكوين فقاعات الهواء.
6. قم بتدوير العينة في الدوار لمدة 5-10 دقائق عند 4,500 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على عصير DNP الزائد عن طريق إخراجها بعناية دون تعطيل حبيبات الخلية. كرر الخطوات 6.4-6.6 حتى يمتلئ الدوار.
7. ضع فاصل البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) بعناية باستخدام برغي الفاصل أعلى الدوار.
8. ضع الدوار ، وجانب الغطاء لأسفل في مكبس دوار⁵³ واغمر الدوار في النيتروجين السائل. اترك ما لا يقل عن 30-60 ثانية حتى يتجمد الدوار والعينة.
9. ابدأ تشغيل وحدة المبادل الحراري وقم بتبريد مسبار DNP إلى ~ 90 كلفن.
10. اضبط وحدة MAS على الوضع اليدوي واضبط درجة الحرارة المتغيرة (VT) على 135 لتر / ساعة وتدفقات غاز المحمل والدفع على ~ 6 لتر / ساعة.
11. قم بتشغيل الإخراج على وحدة تحكم MAS.
12. انقل العينة المجمدة من الخطوة 7.8 من السائل N2 إلى ماسك العينة وضعها في المسبار (انظر أيضا المرجع⁵³).
13. قم بزيادة ضغط تحمل المسبار (Bp) يدويا إلى ~ 500 ملي بار قبل إشراك "الإدراج". ينصح بذلك للدوران المستقر والآمن للدوار.
14. (أ) زيادة معدل MAS إلى القيمة المطلوبة باستخدام الإجراء الموصوف في المرجع⁵³.
15. تحقق من تحسينات DNP مع وبدون الموجات الدقيقة باستخدام تجارب CP 1D القياسية (انظر أيضا ، على سبيل المثال ، المرجع^51،54) (الشكل 7) قبل الشروع في التجارب متعددة الأبعاد ، على سبيل المثال ، تجارب 2D CC الموضحة في القسم 3 من هذه المقالة.

النتائج

يوضح الشكل 2 المواد الهلامية التمثيلية لنقاء الجسم (اللوحة A) وإعادة طي أجسام التضمين (اللوحة B3). يؤكد الشكل 2 التنقية الناجحة ل ¹³C ، ¹⁵N-N BamA-P4P5.

يوضح الشكل 3 أ طيفا نموذجيا 2D ^{13 C-13}C لبروتين غشائي جيد الترتيب ، ويوضح الشكل 3 ب طيفا نموذجيا وعالي الجودة 2D ¹⁵N¹H لبروتين غشاء perdeuterated

المناقشة

تعتبر بروتينات الغشاء لاعبا رئيسيا في تنظيم الوظائف الخلوية الحيوية في كل من الكائنات بدائية النواة وحقيقية النواة. وبالتالي ، فإن فهم آليات عملهم على المستويات الذرية للاستبانة أمر بالغ الأهمية. دفعت تقنيات البيولوجيا الهيكلية الحالية الفهم العلمي لبروتينات الغشاء بعيدا جدا ولكنها اعتمدت بشكل كبير على البيانات التجريبية التي تم جمعها من الأنظمة المختبرية الخالية من الأغشية. في هذه المقالة ، يتم تقديم نهج تجريبي يسمح بالحصول على نظرة ذرية لبنية ووظيفة اثنين من بروتينات الغشاء البكتيرية ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأمونيوم موليبدات	ميرك	277908
الأمونيوم -15N كلوريد	الكورتكنت	CN80P50
أمبيسلين	سيجما ألدريتش	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
حمض البوريك	Merck	B6768
بروموفينول الأزرق	سيجما	B0126
ثنائي كلوريد الكالسيوم	ميرك	499609
كلوريد الكولين	سيجما	C-1879
كلوريد الكوبالت	ميرك	449776
كبريتات النحاس	ميرك	C1297
D-Biotin	Merck	8512090025
أكسيد الديوتيريوم	كورتكنت	CD5251P1000
ثنائي ميثيل سلفوكسيد	ميرك	D9170
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك	سيجما ألدريتش	L6876
حمض الفوليك	سيجما	F-7876
الجلوكوز 13C + 2H	كورتكنت	CCD860P50
الجلسرين	هانيويل	G7757
الجلسرين (12C3 ، 99.95٪ D8 ، 98٪)	نظير اليوروبوت	CDLM-8660-PK
الجلسرين (غير المخرب)	هانيويل	G7757-1L
جلايسين	سيجما ألدريتش	50046
جوانيدين هيدروكلوريد	روث كارل	NR.0037.1
كبريتات الحديد	ميرك	307718
الأيزوبروبيل بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد	ثيرموفيشر	R0392
مرق ليزوجيني	ميرك	L3022
ليزوزيم	سيجما ألدريتش	L6876
كلوريد المغنيسيوم - سداسي هيدرات	فلوكا	63064
كبريتات المغنيسيوم	ميرك	M5921
فوسفات أحادي البوتاسيوم	ميرك	1051080050
ميوينوسيتول	سيجما	I-5125
n-Dodecyl-B-D-maltoside	Acros Organics	3293702509
N ، N-Dimethyldodecylamine N-oxide	Merck	40236
Nicatinamide	Sigma	N-3376
حمض البانتوثينيك	Sigma	21210-25G-F
مثبط البروتياز	Sigma	P8849
بيريدوكسال هيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	P9130
ريبوفلافين	ألدريتش	R170-6
كلوريد الصوديوم	ميرك	K51107104914
ثنائي هيدروجين الصوديوم - أحادي الهيدرات	سيجما ألدريتش	1،06،34،61،000
كبريتات دوديسيل الصوديوم	علمي حراري	28365
هيدروكسيد الصوديوم	ميرك	1،06،49،81،000
السكروز	سيجما لايف ساينس	S9378
الثيامين-حمض الهيدروكلوريك	ميرك	5871
تريس-هيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	10،70،89،76،001
كلوريد الزنك	ميرك	208086
الإشريكية القولونية BL21 DE3 *	نيو إنجلاند بيولابس	C2527
1.5 مل أنابيب فائقة	بيكمان كولتر	357448
30 كيلو دالتون مرشح الطرد المركزي	Amicon	UFC903024
3.2 مم الياقوت DNP الدوار مع أغطية	Cortecnet	H13861
3.2 مم تفلون إدراج	Cortecnet	B6628
3.2 مم معبوة / مفرغة	Cortecnet	B6988
3.2 مم الجدار العادي MAS الدوار	Cortecnet	HZ16913
3.2 مم طقم أدوات دوار MAS الجدار	العادي Cortecnet	HZ09244
ل 3.2 مم دوار الجدار الرقيق	Cortecnet	B136904
1.3 مم دوار MAS + أغطية	Cortecnet	HZ14752
1.3 مم أداة تعبئة	Cortecnet	HZ14714
1.3 مم حزمة عينة	Cortecnet	HZ14716
1.3 مم مزيل	غطاءCortecnet	HZ14706
أداة مجموعة الغطاء 1.3 مم	Cortecnet	HZ14744
أنابيب غسيل الكلى 12-14 كيلو دالتون	Spectra / Por	132703
Sharpie - HS15094