Method Article

تقييم وقياس الفجوات الظهارية الدقيقة في الغشاء المخاطي للقولون باستخدام تلطيخ التألق المناعي

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة جديدة لتصور الموقع المحدد حيث يتم تعزيز النفاذية عبر الخلايا وشبه الخلوية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب. في هذا الاختبار ، نطبق صبغة فلورية 10 كيلو دالتون مترافقة على ديكستران ليسين قابل للإصلاح لتصور مناطق النفاذية العالية (HPR) في الغشاء المخاطي للقولون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخلق الخلايا الظهارية المبطنة للغشاء المخاطي المعوي حاجزا ماديا يفصل المحتوى اللمعي عن الخلال. ارتبط ضعف الحاجز الظهاري بتطور أمراض مختلفة مثل أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD). في الغشاء المخاطي الملتهب ، تتوافق التآكل السطحي أو التآكل الدقيق الذي يفسد الطبقات الأحادية الظهارية مع المواقع ذات النفاذية العالية. وقد تورطت العديد من الآليات في تكوين التآكل الدقيق بما في ذلك تساقط الخلايا وموت الخلايا المبرمج. غالبا ما تمثل هذه التآكل الدقيق فجوات ظهارية مجهرية موزعة بشكل عشوائي في القولون. ظهر تصور وقياس تلك الفجوات الظهارية كأداة مهمة للتحقيق في وظيفة الحاجز الظهاري المعوي. هنا ، نصف طريقة جديدة لتصور الموقع المحدد حيث يتم تعزيز النفاذية عبر الخلايا وشبه الخلوية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب. في هذا الاختبار ، نطبق صبغة فلورية 10 كيلو دالتون مترافقة على ديكستران ليسين قابل للإصلاح لتصور مناطق النفاذية العالية (HPR) في الغشاء المخاطي للقولون. كشف الاستخدام الإضافي لعلامات موت الخلايا أن HPR يشمل بؤر موت الخلايا المبرمج حيث يحدث البثق / التساقط الظهاري. يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا بسيطا ولكنه فعال لتصور وقياس التعرية الدقيقة في الأمعاء ، وهي أداة مفيدة للغاية في نماذج الأمراض ، حيث يتم اختراق الحاجز الظهاري المعوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يخلق الغشاء المخاطي في الجهاز الهضمي حاجزا ماديا يفصل بين البيئة خارج الخلية وبيئة المضيف الداخلي ، ويشارك في امتصاص العناصر الغذائية والماء والإلكتروليتات. يشمل الحاجز المعوي طبقة مخاطية مكونة من البروتينات السكرية ، وطبقة أحادية من الخلايا الظهارية ، والصفيحة المخصوصة الأساسية هي خلايا مناعية ولحمية موجودة. ترتبط الخلايا الظهارية المعوية التي تشكل الحاجز المادي ببعضها البعض بواسطة مجمعات بروتينية مختلفة ، والتي تشمل تقاطع الالتصاق (AJ) والتقاطع الضيق (TJ) والديسموسومات (DMs). يؤدي الضعف في وظيفة الحاجز الظهاري إلى زيادة نفاذية الأمعاء ويسمح بنقل المواد الضارة ومسببات الأمراض من التجويف إلى الخلال1. هناك عدد متزايد من الأمراض التي يتعرض فيها الحاجز الظهاري للخطر ، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) مثل مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) والتهاب القولون غير المحدد (IC). يتزايد معدل الإصابة بمرض التهاب الأمعاء في جميع أنحاء العالم ، حيث يقترب انتشاره من 0.5٪ في الغرب. على الرغم من أن أسباب مرض التهاب الأمعاء غير واضحة ، إلا أن الاستجابة المناعية / الالتهابية المفرطة التي يتم تشغيلها في جدار الأمعاء تساهم بشكل مباشر في اضطراب الحاجز الظهاري عن طريق الحد من إعادة تأسيس التوازن الظهاري المعوي2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من التهاب القولون طويل الأمد معرضون لخطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم (CRC)5. الأمراض الأخرى المرتبطة باضطراب الحاجز الظهاري المعوي هي متلازمة القولون العصبي ، والسمنة ، ومرض الاضطرابات الهضمية ، وحساسية الغلوتين غير الهضمية ، والحساسية الغذائية6. لهذه الأسباب ، هناك حاجة ملحة لتطوير مناهج تجريبية تسمح بتحليل سلامة الحاجز الظهاري المعوي في النماذج الحيوانية التي تحاكي التسبب في البشر

هنا ، قمنا بتقييم الخلايا شبه الخلوية المعدية المعوية السلبية والنفاذية عبر الخلايا المرتبطة بعملية التهابية في ظهارة القولون باستخدام تقنية بسيطة. للتحقيق في التدفق العابر للجزيئات الكبيرة ، قمنا بقياس الانتشار السلبي ل FITC-dexterrn (4 كيلو دالتون) و RITC-dextران (10 كيلو دالتون) في أكياس القولون من الجسم الحي. علاوة على ذلك ، من خلال حقن ديكستران فلوري 10 كيلو دالتون ليسين قابل للتثبيت في تجويف أكياس الأمعاء ، حددنا على وجه التحديد المناطق ذات النفاذية العالية في الغشاء المخاطي الملتهب. سمح لنا استخدام علامات موت الخلايا المبرمج والأجسام المضادة ضد بروتينات AJ بإثبات أن مناطق النفاذية العالية في الغشاء المخاطي الملتهب تتوافق مع مناطق معينة حيث تخضع الخلايا الظهارية لموت الخلايا المبرمج وتتعطل تقاطعات الخلايا الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنية الجديدة لتقييم سلامة الظهارة في أي نموذج يتعرض فيه الحاجز الظهاري المعوي للخطر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية CINVESTAV لرعاية واستخدام المختبر (CICUAL).

1. تحضير المواد والكواشف

  1. محلول هارتمان قبل التسخين (130 ملي كلوريد الصوديوم ، 28 ملي لاكتات ، 4 ملي كلوريد كلوريد ، 1.5 ملي كلوريدالكالسيوم 2) إلى 37 درجة مئوية بينما يغلي بنسبة 95٪ O2/5٪ ثاني أكسيد الكربون2. حافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية (7.4) للمحلول.
  2. لتحليل النفاذية السلبية للخلايا ، قم بإعداد محلول عملي عن طريق إذابة 1 مجم / مل من FITC-Dextran) (4 كيلو دالتون) و 1 مجم / مل من RITC-Dexterrn (10 كيلو دالتون) في محلول هارتمان الدافئ مسبقا.
  3. قم بإعداد محلول 4 ميكروغرام / مل من Alexa Fluor647 Fixable-Dextran(10 kDa) في محلول Hartmann. قم بتخزين حلول العمل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحميها من الضوء حتى الاستخدام.
    ملاحظة: سيكون من الضروري 300 ميكرولتر من محلول العمل لكل نقطة.
  4. قم بإعداد خياطة جراحية عن طريق قطع قسمين بطول 5 سم لكل أمعاء غليظة. قم بلف الغرز في عقدة غير مغلقة.

2. تشريح وتحضير قناة الجهاز الهضمي

  1. امتنع عن الطعام الصلب لمدة 6 ساعات قبل القتل الرحيم للفئران. توفير مياه الشرب حسب الحرة.
    ملاحظة: إذا أمكن ، ضع الفئران على مكملات هلام المغذيات (ماء نقي ، دبس السكر ، اليقطين ، شراب الذرة ، بذور عباد الشمس ، بروتين القمح ، الزيت النباتي ، حمض الطعام ، الغرويات المائية ، الإلكتروليتات ، ألياف الذرة ، مزيج معدني NIH-31M ، مزيج فيتامين NIH-31M).
  2. القتل الرحيم للفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم وفقا لبروتوكولات الأخلاقيات المؤسسية.
  3. تعقيم البطن والصدر بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  4. باستخدام مقص ، قم بعمل شق في منتصف البطن وفضح التجويف البريتوني.
  5. لأغراض التوجيه ، افصل الأمعاء الغليظة وتشريحها عن طريق القطع في نهاية الأمعاء الدقيقة (الجزء النهائي من الدقاق) قبل الأعور مباشرة ثم عند حافة الشرج. استخدم ملقطا جراحيا لإزالة المساريق برفق ووضع القولون في محلول هارتمان.
  6. الأهم من ذلك ، من أجل الحفاظ على الاتساق بين ، حدد الأقسام المتشابهة واستخدمها لتقييم النفاذية. يوصى بشدة باستخدام المناطق القريبة من الأعور.
  7. استخدم حقنة الأنسولين المزودة بقنية بلاستيكية ضعيفة لطرد المحتوى اللمعي الموجود في القولون برفق. إذا كان البراز صلبا ، ادفع بعناية بمساعدة ملقط حاد. بعد إزالة البراز ، اغسل 3 مرات ب 400 ميكرولتر من محلول هارتمان.
  8. اربط المنطقة القريبة (الأقرب إلى الأعور) وضع حلقة خياطة مربوطة مسبقا في المنطقة البعيدة من القولون. بمساعدة حقنة مجهزة بقنية بلاستيكية ضعيفة ، املأ كيس الأمعاء بالمحلول الذي يحتوي على مسبار الرغبة. قم بإزالة القنية البلاستيكية بعناية واربط الحلقة في المنطقة البعيدة.
  9. ضع الكيس المعوي في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل مع 6 مل من محلول هارتمان واحتضنه لمدة ساعة واحدة لتقييم التدفق السلبي للخلايا FITC / RITC-Dextran أو 30 دقيقة لتحليل تدفق Alexa Fluor Fixable-Dextran.
    1. حافظ على الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الأكياس المعوية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 وحمايتها من الضوء.
  10. لقياس النفاذية السلبية باستخدام FITC / RITC-Dextran. في 0 و 60 دقيقة ، خذ عينة 100 ميكرولتر من الأنبوب المخروطي وانقلها إلى لوحة 96 بئر. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الجديدة لتعويض الحجم المفقود.
  11. قياس العينات والمعايير الخاصة ب FITC / RITC على قارئ لوحة الفلورسنت (الإثارة / الانبعاثات FITC: 495 نانومتر / 519 نانومتر ؛ الإثارة / الانبعاث RITC: 570/595 نانومتر).
  12. لقياس النفاذية السلبية باستخدام Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran، قم بإزالة الأمعاء، وقطع بالقرب من عقدة الربط الجراحي، وقطع الأمعاء لكشف التجويف لإزالة المحلول باستخدام المسبار. اغسل تجويف الأمعاء 2 مرات بمحلول هارتمان البارد.
  13. ضع الأنسجة في قالب مناديل مملوء مسبقا بمركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T). قم بتوجيه الأنسجة عموديا أو أفقيا وفقا للجانب المراد تقسيمه. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية.

3. تلطيخ الفلورسنت المناعي

  1. قم بإصلاح المقاطع المجمدة من 20 ميكرومتر باستخدام 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسل 3 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS ؛ 37 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الكودميوم ، 10 ملي أمبيرNa 2HPO4 ، و 1.8 ملي مولار KH2 PO4).
    ملاحظة: تميل المقاطع الرأسية من الأمعاء إلى الخروج إذا كانت الغسالات قوية جدا.
  2. تتخلل مع 0.2٪ TX-100 / PBS لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها 3 مرات باستخدام PBS البارد.
  3. كتلة مع 0.2٪ BSA / PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تمييع الجسم المضاد الأساسي في محلول الحجب واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات باستخدام PBS البارد.
  5. احتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحظر. يغسل 3 مرات باستخدام PBS البارد.
  6. ضع وسط التثبيت على الجروح وأغلقه بغطاء غطاء. يمكن تخزين الشرائح لمدة تصل إلى 3 أشهر عند -20 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الغشاء المخاطي الملتهب ، تؤدي التآكل السطحي أو التآكل الدقيق إلى الإضرار بسلامة الطبقة الأحادية للخلية الظهارية وتمثل مواقع ذات نفاذية عالية7،8. لتقييم مثل هذه الاحتمالات ، قمنا بتحليل النفاذية السلبية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب في نموذج التهاب القولون كبريتات الصوديوم ديكستران. باختصار ، لمدة 5 أيام ، تلقت الفئران C57BL / 6J 2.5٪ DSS (وزن / حجم ، 40-50 كيلو دالتون) مذابة في مياه الشرب. يتميز هذا النموذج بإحداث تلف الخلايا الظهارية وخلل الحاجز الظهاري ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحافظ التوازن الظهاري الناتج عن موازنة تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج الظهاري على حاجز معوي مناسب ووظيفي. العديد من الاضطرابات السريرية ، مثل مرض التهاب الأمعاء ، مصحوبة أو تتميز بتغيرات في نفاذية الأمعاء والتهاب الغشاء المخاطي واضطراب التوازنالظهاري 1. لا يزال التفاعل بين هذه العمليات مثيرا للجدل إلى حد كبير. لذلك ، فإن تطوير مناهج بحثية جديدة للتحقيق في هذه العمليات بشكل صحيح هو موضوع مهم في هذا المجال. هناك العديد من البروتوكولات المنشورة المتاحة للدراسة غي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث جزئيا من خلال منحة SEP-Conacyt (رقم 179 إلى NV / PND) وبدعم من التمويل القطاعي للبحث والتعليم من خلال منحة العلوم الأساسية من Conacyt (رقم A1-S-20887 إلى PND). نود أن نعرب عن امتناننا لنورما تريخو ، والسيد ف. ز. راؤول كاسترو لونا ، وإم سي ليونيل مارتينيز ، وفيليبي كروز مارتينيز ، وفيكتور مانويل غارسيا غوميز ، وم.ف.ز. ريكاردو غاكسيولا سينتينو على مساعدتهم ومساعدتهم الفنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الجسم المضاد النشط Caspase-3 (1: 1000)إشارات الخلية9664Cparkd caspase-3 (Asp175) (5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488   ؛ مضاد للأرانب (1: 1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 مضاد للفئران (1: 1000)InvitrogenA21209
(Leica TCS SP8x) كاشفاتLeicaHyD   وليزر الضوء الأبيض
الجسم المضاد E-Cadherin (1: 750)SigmaMABT26الفئران أحادية النسيلة Delma-1 الجسم المضاد
الإيثانول 70٪Generic
Fixable-DextranInvitrogenD22914Dextern ، Alexa Fluor ، 10,000 ميجاوات ، أنيوني ، قابل للإصلاح
FITC DexternSigma46944Fluorescein isothiocyanate &ndash ؛ dextran: M. Wt. 4 كيلو دالتون
حل هارتمانPiSAHT PiSA
حاضنة (AutoFlow NU-8500)Nuaire
Microplate (Tecan Infinite 200 PRO) Tecan
Nunc F96 MicroWell لوحة البوليسترين بالأبيضوالأسود ThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
الفالودين (1: 1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran,SigmaR8881-100MGRhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
الأجسام المضادة الثانوية (1: 10000)مختبرات جاكسون للأبحاث المناعيةالأجسام المضادة الثانوية المترافقة HRP
يفضل الغرز الجراحية.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb مضاد ل ZO-1
المجهر متحد البؤر قارئ خيوط خياطة الحرير المضفر العام والبوليستر المضفر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles