Method Article

تقييم وقياس الفجوات الظهارية الدقيقة في الغشاء المخاطي للقولون باستخدام تلطيخ التألق المناعي

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة جديدة لتصور الموقع المحدد حيث يتم تعزيز النفاذية عبر الخلايا وشبه الخلوية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب. في هذا الاختبار ، نطبق صبغة فلورية 10 كيلو دالتون مترافقة على ديكستران ليسين قابل للإصلاح لتصور مناطق النفاذية العالية (HPR) في الغشاء المخاطي للقولون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخلق الخلايا الظهارية المبطنة للغشاء المخاطي المعوي حاجزا ماديا يفصل المحتوى اللمعي عن الخلال. ارتبط ضعف الحاجز الظهاري بتطور أمراض مختلفة مثل أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD). في الغشاء المخاطي الملتهب ، تتوافق التآكل السطحي أو التآكل الدقيق الذي يفسد الطبقات الأحادية الظهارية مع المواقع ذات النفاذية العالية. وقد تورطت العديد من الآليات في تكوين التآكل الدقيق بما في ذلك تساقط الخلايا وموت الخلايا المبرمج. غالبا ما تمثل هذه التآكل الدقيق فجوات ظهارية مجهرية موزعة بشكل عشوائي في القولون. ظهر تصور وقياس تلك الفجوات الظهارية كأداة مهمة للتحقيق في وظيفة الحاجز الظهاري المعوي. هنا ، نصف طريقة جديدة لتصور الموقع المحدد حيث يتم تعزيز النفاذية عبر الخلايا وشبه الخلوية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب. في هذا الاختبار ، نطبق صبغة فلورية 10 كيلو دالتون مترافقة على ديكستران ليسين قابل للإصلاح لتصور مناطق النفاذية العالية (HPR) في الغشاء المخاطي للقولون. كشف الاستخدام الإضافي لعلامات موت الخلايا أن HPR يشمل بؤر موت الخلايا المبرمج حيث يحدث البثق / التساقط الظهاري. يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا بسيطا ولكنه فعال لتصور وقياس التعرية الدقيقة في الأمعاء ، وهي أداة مفيدة للغاية في نماذج الأمراض ، حيث يتم اختراق الحاجز الظهاري المعوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يخلق الغشاء المخاطي في الجهاز الهضمي حاجزا ماديا يفصل بين البيئة خارج الخلية وبيئة المضيف الداخلي ، ويشارك في امتصاص العناصر الغذائية والماء والإلكتروليتات. يشمل الحاجز المعوي طبقة مخاطية مكونة من البروتينات السكرية ، وطبقة أحادية من الخلايا الظهارية ، والصفيحة المخصوصة الأساسية هي خلايا مناعية ولحمية موجودة. ترتبط الخلايا الظهارية المعوية التي تشكل الحاجز المادي ببعضها البعض بواسطة مجمعات بروتينية مختلفة ، والتي تشمل تقاطع الالتصاق (AJ) والتقاطع الضيق (TJ) والديسموسومات (DMs). يؤدي الضعف في وظيفة الحاجز الظهاري إلى زيادة نفاذية الأمعاء ويسمح بنقل المواد الضارة ومسببات الأمراض من التجويف إلى الخلال1. هناك عدد م....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية CINVESTAV لرعاية واستخدام المختبر (CICUAL).

1. تحضير المواد والكواشف

  1. محلول هارتمان قبل التسخين (130 ملي كلوريد الصوديوم ، 28 ملي لاكتات ، 4 ملي كلوريد كلوريد ، 1.5 ملي كلوريدالكالسيوم 2) إلى 37 درجة مئوية بينما يغلي بنسبة 95٪ O2/5٪ ثاني أكسيد الكربون2. حافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية (7.4) للمحلول.
  2. لتحليل النفاذية السلبية للخلايا ، قم بإعداد محلول عملي عن طريق إذابة 1 مجم / مل من FITC-Dextran) (4 كيلو دالتون) و 1 مجم / مل من RITC-Dexterrn (10 كيلو دالتون) في محلول هارتمان الدافئ مسبقا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الغشاء المخاطي الملتهب ، تؤدي التآكل السطحي أو التآكل الدقيق إلى الإضرار بسلامة الطبقة الأحادية للخلية الظهارية وتمثل مواقع ذات نفاذية عالية7،8. لتقييم مثل هذه الاحتمالات ، قمنا بتحليل النفاذية السلبية في الغشاء المخاطي للقولون الملتهب في نموذج التهاب القولون كبريتات الصوديوم ديكستران. باختصار ، لمدة 5 أيام ، تلقت الفئران C57BL / 6J 2.5٪ DSS (وزن / حجم ، 40-50 كيلو دالتون) مذابة في مياه الشرب. يتميز هذا النموذج بإحداث تلف الخلايا الظهارية وخلل الحاجز الظهاري ف.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحافظ التوازن الظهاري الناتج عن موازنة تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج الظهاري على حاجز معوي مناسب ووظيفي. العديد من الاضطرابات السريرية ، مثل مرض التهاب الأمعاء ، مصحوبة أو تتميز بتغيرات في نفاذية الأمعاء والتهاب الغشاء المخاطي واضطراب التوازنالظهاري 1. لا يزال التفاعل بين هذه العمليات مثيرا للجدل إلى حد كبير. لذلك ، فإن تطوير مناهج بحثية جديدة للتحقيق في هذه العمليات بشكل صحيح هو موضوع مهم في هذا المجال. هناك العديد من البروتوكولات المنشورة المتاحة للدراسة غي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث جزئيا من خلال منحة SEP-Conacyt (رقم 179 إلى NV / PND) وبدعم من التمويل القطاعي للبحث والتعليم من خلال منحة العلوم الأساسية من Conacyt (رقم A1-S-20887 إلى PND). نود أن نعرب عن امتناننا لنورما تريخو ، والسيد ف. ز. راؤول كاسترو لونا ، وإم سي ليونيل مارتينيز ، وفيليبي كروز مارتينيز ، وفيكتور مانويل غارسيا غوميز ، وم.ف.ز. ريكاردو غاكسيولا سينتينو على مساعدتهم ومساعدتهم الفنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الجسم المضاد النشط Caspase-3 (1: 1000)إشارات الخلية9664Cparkd caspase-3 (Asp175) (5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488   ؛ مضاد للأرانب (1: 1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 مضاد للفئران (1: 1000)InvitrogenA21209
(Leica TCS SP8x) كاشفاتLeicaHyD   وليزر الضوء الأبيض
الجسم المضاد E-Cadherin (1: 750)SigmaMABT26الفئران أحادية النسيلة Delma-1 الجسم المضاد
الإيثانول 70٪Generic
Fixable-DextranInvitrogenD22914Dextern ، Alexa Fluor ، 10,000 ميجاوات ، أنيوني ، قابل للإصلاح
FITC DexternSigma46944Fluorescein isothiocyanate &ndash ؛ dextran: M. Wt. 4 كيلو دالتون
حل هارتمانPiSAHT PiSA
حاضنة (AutoFlow NU-8500)Nuaire
Microplate (Tecan Infinite 200 PRO) Tecan
Nunc F96 MicroWell لوحة البوليسترين بالأبيضوالأسود ThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
الفالودين (1: 1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran,SigmaR8881-100MGRhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
الأجسام المضادة الثانوية (1: 10000)مختبرات جاكسون للأبحاث المناعيةالأجسام المضادة الثانوية المترافقة HRP
يفضل الغرز الجراحية.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb مضاد ل ZO-1
المجهر متحد البؤر قارئ خيوط خياطة الحرير المضفر العام والبوليستر المضفر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles