تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة (خلايا iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) ، تشكلت في الفئران بواسطة سلسلة Vα14-Jα18 ثابتة مقترنة بمجموعة محدودة من سلاسل Vβ المتنوعة¹، وهي محددة للمستضدات الدهنية التي يقدمها جزيء MHC I-RELATED CD1d². تخضع خلايا iNKT لبرنامج اختيار ناهض مما يؤدي إلى اكتساب النمط الظاهري المنشط / الفطري الموجود بالفعل في الغدة الصعترية ، والذي يحدث من خلال عدة مراحل^{نضوج 3و4}، وإنتاج CD4⁺ و CD4^- فرعية. من خلال هذا البرنامج، تكتسب خلايا iNKT مساعد T متميز (T_H)الأنماط الظاهرية المؤثرة، وهي T_H1 (iNKT1) و T_H2 (iNKT2) و T_H17 (iNKT17)، التي يمكن التعرف عليها من خلال التعبير عن عوامل النسخ T-bet و GATA3 و PLZF و RORаt، على التوالي⁵. تتعرف خلايا iNKT على مجموعة من الدهون الميكروبية ولكنها أيضا ذاتية التفاعل ضد الدهون الذاتية التي يتم تنظيمها في سياق الحالات المرضية لإجهاد الخلايا وتلف الأنسجة ، مثل السرطان والمناعة الذاتية². عند التنشيط، تعدل خلايا iNKT وظائف الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الأخرى عن طريق الاتصال المباشر وإنتاج السيتوكين^2.

وقد تم تسهيل التحقيقات في خلايا iNKT من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو Jα18 ، وإنتاج رباعيات CD1d المحملة بالمستضد بالإضافة إلى توليد أجسام مضادة أحادية النسيلة (mAbs) محددة ل TCR البشري شبه المتغير. ومع ذلك، فقد ثبت أن إنشاء خط الخلية iNKT الماوس الأساسي صعبة. لتوصيف أفضل لوظائف antitumor من خلايا iNKT والاستفادة منها للعلاج بالخلايا بالتبني، وضعنا بروتوكول لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg)^6،والتي خلايا iNKT هي 30 مرة أكثر تواترا مما كانت عليه في الفئران نوع البرية.

يمكن استغلال خلايا iNKT الموسعة لإجراء فحوصات في المختبر ، وفي الجسم الحي عند نقلها مرة أخرى إلى الفئران. في هذا الإعداد، على سبيل المثال، لقد أظهرنا آثارها المضادة للورم قوية⁷. وعلاوة على ذلك، في المختبر توسيع خلايا iNKT قابلة للتعديل الوظيفي عن طريق نقل الجينات أو التحرير قبل حقنها في الجسم الحي^8،مما يسمح التحليل الوظيفي الثاقبة للمسارات الجزيئية، فضلا عن تمهيد الطريق لعلاجات الخلايا المتقدمة.

تم استعراض الإجراءات الموصوفة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) (رقم 1048) في معهد سان رافائيل العلمي.

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في جدول المواد.

1. معالجة الطحال

1. قتل رحيم iVα14-Jα18 الفئران عن طريق استنشاق_ثاني أكسيد الكربون وفقا للسياسة المؤسسية.
   ملاحظة: يجب أن يكون عمر فئران iVα14-Jα18 8 أسابيع أو أكثر. لتجنب رفض الخلايا من نقل الخلايا في الجسم الحي ، اعتبر أن الخلايا المعزولة عن الفئران الأنثوية يمكن نقلها بالتبني في كل من المتلقين الذكور والإناث ، في حين يمكن نقل الخلايا المعزولة عن الفئران الذكور فقط في المتلقين الذكور. وفيما يتحتم النظر في أي تحيز جنساني في التجارب المختبرية. يمكن تجميع المزيد من الفئران من أجل الحصول على المزيد من الخلايا.
2. تشريح طحال الماوس وتحطيمه من خلال مصفاة خلية 70 نانومتر للحصول على تعليق خلية واحدة في 10 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS) مع 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
3. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
4. إزالة supernatant عن طريق عكس وعملية مع العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. Resuspend بيليه الخلية مع 1 مل من ACK العقيمة (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) Lysing العازلة، واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكتلة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: ACK متوفر تجاريا; وهو يتألف من حل 0.15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, و 0.1 mM Na₂EDTA (حمض الإيثيلينديامينتتراستيك) المذاب في بيديستيليد H₂O, pH 7.2-7.4. إذا كانت محلية الصنع، قم بتعقيمها عن طريق الترشيح باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
5. إزالة supernatant عن طريق الانعكاس. Resuspend بيليه الخلية في 3 مل من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS وإزالة بقايا الدهون عن طريق pipetting. إذا لزم الأمر، تجمع الخلايا القادمة من فئران مختلفة.
6. عد الخلايا والحفاظ على 50 ميكرولتر لتحليل FACS.

2. تي إثراء الخلية

ملاحظة: لخطوات التخصيب، اعمل بسرعة، حافظ على برودة الخلايا واستخدم الحلول المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها ثم احتفظ بها على الجليد

1. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
2. إعادة تشغيل جميع الخلايا في المبلغ المناسب من برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS (500 ميكرولتر ل10⁷ خلايا) وحاصر Fc (2.5 ميكرولتر × 10⁷ خلايا)؛ احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. اغسله بكمية 1-2 مل من حاجز فصل MACS لكل 10^{خلايا إجمالية وأجهزة} طرد مركزي بمعدل 300 × ز لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: المخزن المؤقت MACS متوفر تجاريا. وهو يتألف من PH PBS 7.2، 0.5٪ ألبوم مصل البقر (BSA)، و 2 MM EDTA. إذا كانت محلية الصنع، قم بتعقيمها عن طريق الترشيح باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
4. إزالة supernatant عن طريق عكس وصمة عار الخلايا مع CD19-FITC وH2 (IA ب)-FITC (استخدام 5 ميكرولتر × 10⁷ خلايا في 100 ميكرولتر من ميغابايت). تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4-8 درجة مئوية.
5. اغسل الخلايا بإضافة 1−2 مل من ميغا بايت لكل 10⁷ خلايا وأجهزة طرد مركزي عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق.
6. ماصة قبالة supernatant تماما وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من ميغابايت لكل 10⁷ مجموع الخلايا. إضافة 10 ميكرولتر من مكافحة FITC MicroBeads لكل 10⁷ مجموع الخلايا. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4-8 درجة مئوية.
7. اغسل الخلايا بإضافة 1−2 مل من ميغا بايت لكل 10⁷ خلايا وأجهزة طرد مركزي بمعدل 300 × ز لمدة 10 دقائق.
8. ماصة قبالة supernatant تماما وإعادة الإنفاق تصل إلى 1.25 × 10^{8 خلية} في 500 ميكرولتر من MB.
9. ضع عمود LD في المجال المغناطيسي لمفصل MACS للشروع في الاستنفاد. لتجنب انسداد، وتطبيق مرشح ما قبل الفصل على العمود LD وشطف مع 2 مل من ميغابايت.
10. عندما يكون خزان العمود فارغا، قم بتطبيق تعليق الخلية على الفلتر. جمع الخلايا غير التسمية التي تمر عبر العمود.
11. اغسل 3 مرات مع 1 مل من ميغابايت، فقط عندما يكون خزان العمود فارغا. جمع مجموع النفايات السائلة، والتي سيتم إثراء في الخلايا التائية، والعد الخلايا. احتفظ دائما ب 50 ميكرولتر لتحليل FACS.

3. إثراء الخلية iNKT

1. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant عن طريق الانعكاس.
2. وصمة عار الخلايا مع CD1d-tetramer-PE (الماوس PBS57-CD1d-tetramer)، وفقا ل المعايرة الأجسام المضادة في 50 ميكرولتر من ميغابايت لكل 10⁶ خلايا. تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الإجراء باستخدام رباعيات MCD1d التي تحمل علامة APC والخرز المضاد ل APC؛ ضبط الفلوروشروم المستخدمة في تلطيخ التالية وفقا لذلك. في هذا البروتوكول استخدمنا الماوس PBS-57-CD1d-tetramers المقدمة من المعاهد القومية للصحة. αgalactosylceramide (αGal-Cer) هو مستضد نموذجي معترف به من قبل خلايا iNKT. برنامج تلفزيوني-57 هو التماثلية من αGal-Cer مع تحسين الذوبان⁹; يوفر مرفق تترامر NIH PBS-57 ligand معقدة إلى رباعيات CD1d. ومع ذلك، فإن أجهزة التعتيم CD1d/tetramers/dextramers الأخرى متوفرة تجاريا ويمكن تحميلها بمستضد دهون مثل αGal-Cer. ونحن نتصور إمكانية تعديل البروتوكول لاستخدامه.
3. اغسل الخلايا بإضافة 1−2 مل من ميغا بايت لكل 10⁷ خلايا وأجهزة طرد مركزي بمعدل 300 × ز لمدة 10 دقائق.
4. ماصة قبالة supernatant تماما وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 80 ميكرولتر من ميغابايت لكل 10⁷ مجموع الخلايا. إضافة 20 ميكرولتر من مكافحة PE MicroBeads لكل 10⁷ مجموع الخلايا. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4-8 درجة مئوية.
5. اغسل الخلايا بإضافة 1−2 مل من ميغا بايت لكل 10⁷ خلايا وأجهزة طرد مركزي عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق.
6. ماصة قبالة supernatant تماما وإعادة إنفاق ما يصل إلى 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من MB. وإلا إذا تجاوزت الخلايا 10^8،قم بضبط مستوى الصوت وفقا لذلك.
7. وفقا لعدد الخلايا، ضع LS (حتى 10⁸⁾أو MS (حتى 10⁷⁾عمود في المجال المغناطيسي لفاصل MACS. شطف العمود مع MB (3 مل ل LS، 500 ميكرولتر للتصل بالتصلب المتعدد).
8. تطبيق تعليق الخلية على العمود.
9. جمع الخلايا غير البطاقة التي تمر من خلال. اغسل العمود 3 مرات بإضافة الكمية المناسبة من MB (3 × 3 مل لعمود LS و3 × 500 ميكرولتر لعمود MS) فقط عندما يكون خزان العمود فارغا. إجمالي النفايات السائلة هو الكسر السالب.
10. قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي ووضعه على أنبوب تجميع جديد.
11. ماصة ميغابايت على العمود (5 مل لعمود LS أو 1 مل لعمود MS)؛ دفع المكبس المقدمة في العمود وطرد الكسر الموجب (المخصب في خلايا iNKT).
12. لزيادة استعادة الخلية iNKT، طرد المركزي الكسر السلبي في 300 x g لمدة 10 دقائق وكرر الخطوات 3.6-3.7 مع LS أو MS العمود الجديد. تجمع الكسور الموجبة وتحدد عدد الخلايا. احتفظ ب 50 ميكرولتر من الكسور الإيجابية والسلبية لتحليل FACS.
13. تحقق من خطوات تنقية بواسطة تحليل FACS. وتشمل العينات: الطحال السابق فيفو، تي الخلية المخصب كسر، iNKT كسر إيجابي و iNKT كسر سلبي. وصمة عار الخلايا مع: CD19-FITC، IAb-FITC، CD1d-tetramer-PE، TCRа-APC وDAPI.
    ملاحظة: الاسترداد المتوقع من فأر iVα14-Jα18 واحد هو 2x10⁶ خلايا iNKT .

4. iNKT تنشيط الخلية والتوسع

1. تنشيط خلايا iNKT المنقى مع الماوس T المنشط مكافحة CD3/CD28 الخرز المغناطيسي في نسبة 1:1.
   1. الطرد المركزي الخلية iNKT كسر إيجابي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
   2. وفي الوقت نفسه نقل الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 إلى أنبوب وإضافة حجم متساو من برنامج تلفزيوني، دوامة لمدة 5 ثوان. ضع الأنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتخلص من الناتورنت.
   3. إزالة أنبوب من المغناطيس وإعادة إنفاق الخرز المغناطيسي غسلها في الحجم المناسب من RPMI كاملة (RPMI 1640 المتوسطة، 10٪ FCS الحرارة المعطل، 1 mm الصوديوم بيروفات، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 10 U/ml البنسلين والستريبتوميسين، 50 ميكرومتر β ميركابتوثانول) أن يكون 5 × 10⁵ خلايا iNKT في 1 مل. استخدم هذا التعليق لإعادة إنفاق الكسر الإيجابي iNKT الطرد المركزي.
2. لوحة 1 مل من تعليق الخلية (5 × 10⁵ خلايا iNKT) والخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 في لوحة بئر 48 مع 20 U/mL IL-2 واحتضان في 37 درجة مئوية.
3. بعد 5 أيام، أضف 10 نانوغرام/مل IL-7.
4. تقسيم الخلايا 1:2 عندما تصل إلى التقاء 80-90٪، إضافة دائما 20U/mL IL-2 و 10 نانوغرام / مل IL-7. في هذه الظروف، يمكن توسيع خلايا iNKT لمدة تصل إلى 15 يوما.

البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة يمكن من إثراء خلايا iNKT من طحال الفئران المعدلة وراثيا iVa14-Ja18 من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ملخصة في الشكل 1A. يتم اختيار إجمالي خلايا الطحال T أولا بشكل سلبي عن طريق استنفاد الخلايا B والخلايا الأحادية ، تليها الفرز المناعي الإيجابي للخلايا iNKT مع مستضد الدهون PBS-57 المحملة رباعيات CD1d ، والتي تمكن من وصمة عار على وجه التحديد فقط خلايا iNKT. هذا البروتوكول ينتج حوالي 2 × 106 من 95-98٪ خلايا iNKT نقية من طحال فأرة iVa14-Ja18 TG واحدة. لا يمكن الكشف عن أي خلايا iNKT أو عدد قليل منها في الكسر السالب(الشكل 1B).

بعد الإثراء، يمكن توسيع iVa14 iNKT الخلايا مع مكافحة CD3/CD28 الخرز بالإضافة إلى IL-2 و IL-7 (الشكل 2A)، مما أدى إلى توسيع 30 أضعاف في المتوسط بحلول اليوم +14 من الثقافة كما هو مبين في الشكل 2B.

الشكل 3A يظهر نقاء الخلية iNKT جنبا إلى جنب مع التوسع في المختبر والتعبير عن جزيء CD4. لاحظنا تناقصا في النسبة المئوية ل TCRβ+ CD1d-tetramer+ خلايا إيجابية مزدوجة: التنشيط القوي مع حبات مكافحة CD3/CD28 يؤدي إلى خفض تنظيم تعبير TCR الخلية iNKT على سطح الخلية ، ويظهر عدد سلبي مزدوج. وكانت غالبية الخلايا iNKT الموسعة CD4-. ويبين الشكل 3 باء وصفا للتعبير عن عوامل النسخ الخاصة بالنسب PLZF و RORγt على خلايا iNKT المخصبة في اليومين 0 و 14 يوما بعد التوسع. هذا تلطيخ تمكن من تحديد NKT1 (PLZF RORγtمنخفضة -)، NKT2 (PLZF RORγtعالية -)، وNKT17 (PLZFint RORγt+) الأنماط الظاهرية. يجري في الغالب NKT1 و NKT2، والخلايا iNKT المخصب تظهر TH0 مثل تأثير النمط الظاهري. يتم الحفاظ على هذا النمط الظاهري بعد 14 يوما من التوسع كما أكد من قبل إفراز كل من IFN-γ وIL-4 بعد PMA / التحفيز الأيونوميسين هو مبين في الشكل 3C.

الشكل 1: إثراء الخلية iNKT. أ) التمثيل التخطيطي لبروتوكول الفصل المغناطيسي المناعي. ب)تحليل التدفق الخلوي لكل خطوة تخصيب. تظهر النسبة المئوية لترددات الخلايا التائية في المؤامرات العليا، مسورة على الخلايا الليمفاوية القابلة للحياة. في حين تظهر النسبة المئوية لترددات الخلايا iNKT على طول كل خطوة في المؤامرات السفلية ، مسورة على CD19 قابلة للحياة- TCRβ+ الخلايا الليمفاوية. تلطيخ على CD19 قابلة للحياة- TCRβ+ الخلايا الليمفاوية مع tetramer CD1d تفريغ تسمح لرسم بوابة الخلية iNKT بشكل صحيح. يتم عرض تجربة تمثيلية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: iNKT الخلية في توسع المختبر. أ)عدد خلايا iNKT على طول توسيع الخلية iNKT. يتم عرض ثلاث تجارب تمثيلية ومستقلة. ب)أضعاف زيادة في عدد الخلية iNKT في اليوم 7 و 14 بعد تنقية والتنشيط. يعني ± SD تظهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:توسيع توصيف الخلية iNKT. أ) تحليل تدفق قياس الخلايا من نسبة الخلية iNKT والتعبير CD4 على طول فترة التوسع. يتم بوابات المؤامرات العليا على الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة. يتم بوابات المؤامرات السفلية على خلايا iNKT (CD1d-tetramer قابلة للحياة+ TCRβ+ الخلايا الليمفاوية). ب)وصف Phenotypic المخصب (اليوم 0) وتوسيع (اليوم 14) خلايا iNKT. يتم بوابات المؤامرات على خلايا iNKT (قابلة للحياة CD1d-tetramer+ TCRβ+ الخلايا الليمفاوية). كانت الخلايا ملطخة نوويا لعوامل النسخ مع مجموعة التخزين المؤقت لعوامل النسخ Foxp3. NKT1 (PLZF RORγtمنخفضة -), NKT2 (PLZF RORγtعالية -), وNKT17 (PLZFint RORγt+) تم تحديد مجموعات فرعية, يتم عرض ترددات كل مجموعة فرعية في النسبة المئوية. ج)إنتاج السيتوكين من قبل خلايا iNKT الموسعة في اليوم 14. يتم بوابات المؤامرات على خلايا iNKT (قابلة للحياة CD1d-tetramer+ TCRβ+ الخلايا الليمفاوية). تم تحفيز الخلايا لمدة 4 ساعات مع PMA 25 نانوغرام / مل / أيونوميسين 1 ميكروغرام / مل ، في وجود لآخر 2 ساعة من Brefeldin A 10 ميكروغرام / مل. ثم تم إصلاح الخلايا مع PFA 2٪، permeabilized مع Permwash ومن ثم ملطخة داخل الخلايا لإنتاج السيتوكين. تم تعيين استراتيجية غاتينج على عنصر التحكم غير المنشط، اللوحة اليسرى. يتم عرض تجربة تمثيلية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.